专利名称：：杨树叶酚类提取物在治疗心血管疾病中的用途及其提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种杨树叶提取物在治疗疾病中的用途及其提取方法。技术背景随着经济的发展、人民生活水平的提高以及社会化进程的加剧，心血管疾病的发病率逐年上升，己成为人类死亡的主要原因，严重威胁着人民的生命健康。根据WHO对全球各种疾病死亡的统计，因心脑血管疾病死亡的人数占总死亡人数的28.8%。预计到2008年，该比例将上升至36%，成为威胁人类健康的"头号杀手"，给人民和社会造成巨大的精神和经济负担。目前临床上对心血管疾病的治疗以西药为主，包括|3受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂和HMG-CoA还原酶抑制剂等，但服用这些药物不仅易产生耐药性，而且有毒副作用，甚至导致患者心律失常。杨树叶虽然在《中药大辞典》中没有记载，但民间医学认为杨树叶味苦、性寒，可治五脏风热毒，解毒通便。近几年医学研究发现杨树叶的叶蛋白可分解腐败蛋白质，并有祛腐生新，促进溃疡伤口愈合的作用；杨树叶中还含有杀菌、抑菌成分，有抗感染和帮助肌肉和皮肤生长的作用。但迄今为止没有关于杨树叶及其提取物治疗心血管疾病的报道；而且由于杨树叶中所含物质种类繁多，药物成分提取存在有效成分含量低的缺陷。
发明内容本发明的目的是提出一种杨树叶提取物的新用途和解决药物成分提取中有效成分含量低的缺陷，而提供的一种杨树叶酚类提取物在治疗心血管疾病中的用途及其提取方法。本发明杨树叶酚类提取物用于治疗心血管疾病。上述杨树叶酚类提取物按以下步骤提取一、经过清洗、粉碎后的杨树叶用水或醇煎煮23次，每次煎煮24h，水或醇的重量为杨树叶重量的8~14倍；二、煎煮液过滤，然后浓縮滤液比重至L101.15;三、洗脱将经过浓縮的滤液经大孔吸附树脂柱色谱，依次用水和浓度为30%~50%的乙醇洗脱；四、浓縮乙醇洗脱组份比重至1.15-1.18，然后加入等体积的蒸馏水，再用盐酸调节pH值至13，冷却至20。C以下，静置沉降1224h;五、弃去上清液后向固相沉淀物中加入等体积的去离子水，并用NaOH溶液调节pH值至6~7，然后静置沉降12~24h，再抽取上清液，用盐酸调节上清液pH值至13，之后再静置沉降1224h;六、抽滤，得到沉淀物，并用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀物至中性，即得到杨树叶酚类提取物。经色谱分析，本发明杨树叶酚类提取物中包含多酚和黄酮类化合物。本发明提取方法获得的酚类化合物含量高达95%以上。本发明杨树叶酚类提取物具有抗炎、活血祛瘀、抗氧化、缓解心肌缺血、改善心律失常症状和提高患者耐缺氧能力的作用，可用于治疗冠心病等心血管疾病。具体实施方式具体实施方式一本实施方式杨树叶酚类提取物用于治疗心血管疾病。本实施方式提取物加入辅料采用常规制备工艺制成不同口服剂型(口服液、片剂、散剂、丸剂或胶囊)，如加入湿润剂(水或水蜜)和粘合剂(蜂蜜、米糊或面糊)制成丸剂，加入填充剂(淀粉、糊精、糖粉、乳糖、无机盐类[硫酸钙、药用碳酸钙]、微晶纤维素或甘露醇)和湿润剂(蒸馏水或乙醇)、粘合剂(淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或明胶溶液)等制成片剂。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是杨树叶酚类提取物用于治疗冠心病。具体实施方式三本实施方式杨树叶酚类提取物按以下步骤提取一、经过清洗、粉碎后的杨树叶用水或醇煎煮23次，每次煎煮24h，水或醇的重量为杨树叶重量的8~14倍；二、煎煮液过滤，然后浓縮滤液比重至U01.15;三、洗脱将经过浓縮的滤液经大孔吸附树脂柱色谱，依次用水和浓度为30%~50%的乙醇洗脱；四、浓縮乙醇洗脱组份比重至1.151.18，然后加/入等体积的蒸馏水，再用盐酸调节pH值至13，冷却至20。C以下，静置沉降1224h;五、弃去上清液后向固相沉淀物中加入等体积的去离子水，并用NaOH溶液调节pH值至67，然后静置沉降12~24h，再抽取上清液，用盐酸调节上清液pH值至l3，之后再静置沉降12~24h;六、抽滤，得到沉淀物，并用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀物至中性，即得到杨树叶酚类提取物。本实施方式在4(TC温度下测定回收膏比重。经检测本实施方式杨树叶酚类提取物中酚类化合物纯度高达95%以上。本实施方式提取物中含有黄酮。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤一中醇是浓度为10%~95%的乙醇、甲醇或丙醇。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤三中的大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤三中的洗脱用乙醇浓度为30%。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤二浓縮滤液比重至1.14。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式八本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤四浓縮乙醇洗脱组份比重至1.16~1.17。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式九本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤五中用NaOH溶液调节pH值至6.8。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式十本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤五中用盐酸调节上清液pH值至1.6-1.8。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式十一本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤四中用盐酸调节pH值至1.6~1.8。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式十二本实施方式与具体实施方式三或十一的不同点是步骤四中盐酸的浓度为3%5%。其它步骤及参数与实施方式三十一相同。具体实施方式十三本实施方式与具体实施方式三或九的不同点是步骤五中NaOH溶液的浓度为4%。其它步骤及参数与实施方式三或九相同。具体实施方式十四本实施方式与具体实施方式三或十的不同点是步骤四中盐酸的浓度为3%5%。其它步骤及参数与实施方式三或十相同。具体实施方式十五本实施方式与具体实施方式三的不同点是步骤一中杨树叶粉碎后粒径不小于ioo目。其它步骤及参数与实施方式三相同。具体实施方式十六本实施方式杨树叶酚类提取物按以下步骤提取一、经过清洗、粉碎后的杨树叶用30%乙醇煎煮3次，每次煎煮3h,乙醇的重量为杨树叶重量的10倍；二、煎煮液过滤，然后浓縮滤液比重至1.12(4(TC温度下测定)；三、洗脱将经过浓縮的滤液经D101型大孔吸附树脂柱色谱，依次用水和浓度为30%的乙醇洗脱；四、浓縮乙醇洗脱组份比重至1.16(40°C温度下测定)，然后加入等体积的蒸馏水，再用盐酸调节pH值至1.5，冷却至20'C以下，静置沉降12h;五、弃去上清液后向固相沉淀物中加入等体积的去离子水，并用NaOH溶液调节pH值至6.8，然后静置沉降12h，再抽取上清液，用盐酸调节上清液pH值至1.75，之后再静置沉降12h;六、抽滤，得到沉淀物，并用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀物至中性，即得到杨树叶酚类提取物。药理试验1、耐缺氧能力试验将40只健康小鼠随机分为4组(第一组为对照组、第二组为异丙肾上腺素组、第三组为杨树叶酚类提取物低剂量组、第四组为杨树叶酚类提取物(高剂量组)每组10只。第三组小鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类提取物30mg，第四组小鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类提取物150mg，第一组和第二组小鼠均腹腔注射等容积生理盐水，15min后第二、三和四组小鼠均按体重皮下注射异丙肾上腺素20mg/kg，以增加心肌耗氧量。再经过15min后将小鼠放入盛有钠石灰的250mL广口瓶内，加盖密封后，记录小鼠存活时间。试验数据如表l所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>第一组与第二组小鼠存活时间有极显著差异(pO.Ol)，第三组与第二组小鼠存活时间有显著差异(p0.05)，第四组与第二组小鼠存活时间有极显著差异(p<0.01);试验数据表明，皮下注射异丙肾上腺素能明显縮短小鼠在常压缺氧状态下的存活时间，第三组和第四组小鼠在常压缺氧状态下的存活时间均具有明显对抗作用，说明本实施方式制备出的杨树叶酚类提取物可以明显提高小鼠耐缺氧能力。2、心肌保护实验将40只健康Wistar大鼠随机分为4组(第1组为对照组、第2组为垂体后叶素组、第3组为杨树叶酚类提取物低剂量组、第4组为杨树叶酚类提取物(高剂量组)每组10只。第3组大鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类取物20mg，第4组大鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类提取物100mg，第1组和第2组大鼠均腹腔注射等容积生理盐水，lh后用浓度为的20。/。乌拉坦(5mL/kg)腹腔注射麻醉，将麻醉大鼠仰位固定在鼠台上并与BL-420生物机能实验系统相连，描记心电图。第1组大鼠舌下静脉注射生理盐水，第2、3和4组大鼠舌下静脉注射垂体后叶素lU/kg，分别在于注射即刻、注射lmin后观察心电图变化。以T波和ST段改变为指标，判断心肌缺血程度和药物作用。注射60min后腹主动脉取血，离心分离血清，测定血清中乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，试验数据如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>试验数据说明本实施方式制备出的杨树叶酚类提取物可明显改善急性心肌缺血的状况，保护心肌。将30只雌性健康Wistar大鼠随机分为3组(第一组为对照组、第二组为杨树叶酚类提取物低剂量组、第三组为杨树叶酚类提取物(高剂量组)每组10只。第二组小鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类提取物20mg，第三组小鼠按体重每千克腹腔注射杨树叶酚类提取物100mg，第一组大鼠均腹腔注射等容积生理盐水，30min后腹腔注射乌拉坦lg/kg对大鼠进行麻醉，用天津开发区福斯特科技发展有限公司生产的FM6501多参数患者监护仪连续观察II导联心电图，由股静脉以1.25ug/min恒速输入乌头碱生理盐水溶液，分别记录各鼠心律失常出现时间以及诱发室性期前收縮(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)、心脏停搏(CA)的乌头碱用量，实验数据如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>第二组、第三组与第一组大鼠的心律失常间期及诱发室性期前收縮(VP)、室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)、心脏停搏(CA)的乌头碱注入剂量有显著差异(p0.05)，说明本实施方式制备出的杨树叶酚类提取物可以明显改善心律失常症状，具有保护心肌的作用。3、抗炎试验将40只健康小鼠(体重为1743g，雌雄各半)随机分为4组(第一组为生理盐水组、第二组阿司匹林组、第三组为杨树叶酚类提取物低剂量组、第四组为杨树叶酚类提取物(高剂量组)每组10只。每天第一组小鼠生理盐水灌胃一次、第二组小鼠阿司匹林(200mg/kg)灌胃一次、第三组小鼠杨树叶酚类提取物(20mg/kg)灌胃一次、第四组小鼠杨树叶酚类提取物(130mg/kg)灌胃一次；连续灌胃给药4天，末次给药30min后尾部静脉注射浓度为0.5%的伊文思兰生理盐水溶液(O.lmLAOg)，然后立即腹腔注射浓度为0.8%的冰醋酸生理盐水液(0.1mL/10g)，20分钟后将小鼠脱颈椎处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6mL生理盐水洗涤腹腔，用吸管收集洗涤液，合并后加入生理盐水至10mL，再以3000r/min的转速离心15min，取上清液于波长为590nm的紫外光下比色测定吸收度，实验数据如表4所示。表4组别OD值第一组0.35±0.07第二组0.20±0.04*第三组0.23±0.08*第四组0.19±0.09*第二、三、四组与第一组小鼠OD值有显著差异(p0.05)，说明本实施方式制备出的杨树叶酚类提取物具有抗炎作用，可抑制对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高。权利要求1、杨树叶酚类提取物在治疗心血管疾病中的用途，其特征在于杨树叶酚类提取物用于治疗心血管疾病。2、根据权利要求1所述的杨树叶酚类提取物在治疗心血管疾病中的用途，其特征在于杨树叶酚类提取物用于治疗冠心病。3、如权利要求1所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于杨树叶酚类提取物按以下步骤提取一、经过清洗、粉碎后的杨树叶用水或醇煎煮23次，每次煎煮24h，水或醇的重量为杨树叶重量的814倍；二、煎煮液过滤，然后浓縮滤液比重至1.10~1.15;三、洗脱将经过浓縮的滤液经大孔吸附树脂柱色谱，依次用水和浓度为30%~50%的乙醇洗脱；四、浓縮乙醇洗脱组份比重至1.151.18，然后加入等体积的蒸馏水，再用盐酸调节pH值至1~3，冷却至2(TC以下，静置沉降1224h;五、弃去上清液后向固相沉淀物中加入等体积的去离子水，并用NaOH溶液调节pH值至67，然后静置沉降1224h，再抽取上清液，用盐酸调节上清液pH值至13，之后再静置沉降1224h;六、抽滤，得到沉淀物，并用浓度为95%的乙醇洗涤沉淀物至中性，即得到杨树叶酚类提取物。4、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤一中醇是浓度为10%~95。/。的乙醇、甲醇或丙醇。5、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤三中的大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。6、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤二浓縮滤液比重至1.12。7、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤四浓縮乙醇洗脱组份比重至1.16~1.17。8、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤五中用NaOH溶液调节pH值至6.8。9、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤五中用盐酸调节上清液pH值至1.6~1.8。10、根据权利要求3所述的杨树叶酚类提取物的提取方法，其特征在于步骤四中用盐酸调节pH值至1.6~1.8。全文摘要杨树叶酚类提取物在治疗心血管疾病中的用途及其提取方法，它涉及一种杨树叶提取物在治疗疾病中的用途及其提取方法。它提出一种杨树叶提取物的新用途和提取高含量有效成分的一种方法。杨树叶酚类提取物用于治疗心血管疾病。提取方法1.煎煮；2.煎煮液过滤、浓缩；3.柱色谱洗脱；4.酸调节pH值后冷却沉降；5.碱调节pH值后静置沉降，再抽取上清液酸调节pH值静置沉降；6.抽滤，并乙醇洗涤。本发明提取方法获得的酚类化合物含量高达95％以上。本发明提取物具有抗炎、活血祛淤、抗氧化、缓解心肌缺血、改善心律失常症状和提高患者耐缺氧能力的作用，可用于治疗冠心病等心血管疾病。文档编号A61K36/185GK101152223SQ20071007272公开日2008年4月2日申请日期2007年8月31日优先权日2007年8月31日发明者吕延杰,勇张,李国玉,杨宝峰申请人:哈尔滨医科大学