专利名称：一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医学领域，特别是一种关于人乳头瘤病毒16 型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗。(二) 、背景技术人乳头瘤病毒的英文全称是human papilloma virus ，简称HPV 。 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，全球范围内，宫颈癌是女性癌症死 因的第二杀手，每年新增约50万病例，其中有20%发生在中国。好发年龄 呈双峰状，35 39岁和60 64岁。近年己明确，几乎所有的宫颈癌都由人 乳头瘤病毒引起。其中，超过2 / 3的宫颈癌病例可归咎于两种类型的HPV: 16型和18型。发生宫颈癌的病因至今尚未完全明了，可能与性生活紊乱，过早性生 活，早年分娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示卯％ 以上的宫颈癌伴有HPV感染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌 和腺鳞癌等。高危型人乳头瘤病毒的感染是诱发宫颈癌的必要条件，几乎 所有的宫颈鳞癌中都可以检测到HPV-DNA的存在。目前治疗宫颈癌的只能采用手术、放疗，或两者联合使用。近年来，在 上述方法基础上加免疫治疗受到重视并取得较好的效果。单独应用一种治 疗方法的并发症发生率为3 11 % ，联合应用两种治疗方法的并发症发生率 达到30%或以上。手术和放疗各有优缺点。目前的趋势是强调综合治疗，把 手术、放疗和化疗进行有机的结合，以达到提高治疗效果、改善生活质量、 减低并发症、尽可能保留生育功能和卵巢功能的目的。综合治疗宫颈癌的方法，归纳起来有以下几种1)手术治疗法切除标本的正常组织边缘距离肿瘤病灶最少达lcm以 上。其缺点是损伤大，不能凭肉眼发现受HPV病毒感染的细胞，因此，被 感染的细胞清除不彻底。2) 放射治疗法放疗包括外照射和腔内放疗。适用于各期患者，常和 手术、化疗配合使用。该方法主要缺点是虽然能够杀死受HPV病毒感染的 细胞，但是，射线对正常组织细胞损伤较大。3) 化学治疗法化疗可用于术前、术后，或放疗前后,也常与放疗同时 进行，以提高放疗的疗效。迄今为止，已报道有54种细胞毒药物用于进展或 复发宫颈癌的化疗，单药化疗以顺铂的研究最广泛，疗效也最肯定。该方法 主要缺点是虽然能够杀死受HPV病毒感染的细胞，但是，化疗药物对正常 组织细胞的毒性较大，出现诸如过敏性休克、呕吐、白细胞减少、抵抗力 下降等副作用。(三)、发明内容本发明的目的就是提供一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多 肽药物或疫苗，它可以专门针对受HPV16型病毒感染的细胞进行有效地破 坏，而且对人体无毒副作用。本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它的氨基酸序列为 氨基端-YICEDTSVTV-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成 多拷贝的串联结构。正常人体的外周血单核细胞(简称PBMC) —般不具有特异性溶破受 到HPV16型病毒感染的细胞的功能，本发明提供的多肽在体外与 HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞共同孵育，可以增加这些外周血单 核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量50%-80%，还可以 诱导激活CTL溶破HPV16型阳性的肿瘤细胞，溶破率为60%-卯％。本发明的基本的氨基酸序列来源于GENBANK报道的氨基酸序 列，采用蛋白质表位分子设计的原理和方法，对HPV16型的E2蛋白序列进 行CTL表位分析，主要是基于量化基序法确定E2蛋白的CTL表位，具体 做法是从E2蛋白第1位氨基酸残基开始，逐个截取九肽段或十肽段，共 获得357条九肽段和356条十肽段。对于每一条肽段，在结合矩阵中査找 各位点氨基酸残基的结合系数，这九肽或十肽结合系数相乘后再乘以标准 系数，即为该九肽或十肽与HLA-AM201的结合系数。最后，选取结合系数最高的几条肽段作为候选CTL表位。以此方法找到了具有功能的本发明 所述的氨基酸序列，即氨基端-YICEDTSVTV-羧基端。合成本发明所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如 下的方法制成的采用标准Fm o c方案，起始选用0.0125 mmol, P S C树脂(A B I公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、 2、 3或4所述的 序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国A B I 公司生产)的用量为0. lmmo 1。各种氨基酸保护基团是各氨基酸 的alpha氨基为Pm o c保护，其余侧链保护基团，A r g (M t r )、tyr(tBu)、 Thr(tBu)、 Tyr(tBu)、 Asp(Ot B u)。每步縮合都加入H o B t /D c c活化保护氨基酸的羧基。每 步縮合用含有2(^六氢吡啶的NMP溶液去除Fm o c保护基，肽链 合成后，按照A B I公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰浴 条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0. 75 g 、酒石酸乙二 胺(E D T)O. 25m 1 、苯硫基甲烷(T hionaisole)O. 5m1 、去离子水0. 5m 1 、三氟乙酸10m 1 。在室温条件下持续搅拌， 反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护 基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团， 并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1 2m1 ，加乙醚50m 1使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便 是肽产品。以上过程都是在A B I —431A固相自动肽合成仪(美国 生产)上完成。本发明所述的氨基酸序列既可以作为多肽药物，也可以作为多肽疫 苗，不仅可以室温保存、运输，还可以自动化批量生产。使用现有的成熟技术，制备表达HPV16型E2蛋白的靶细胞，叫Caski 细胞；按照本领域公知的方法获得HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞 (简称PBMC);培养上述PBMC细胞24小时后，取悬液(2X 106/ ml) 4瓶。加入本发 明所述的氨基酸序列多肽(20ug/ml)，加入等量完全培养基作为对照组， 37 °C, 5n/。C02环境下孵育。7天后重复该刺激过程，共反复刺激3次。 最末一次刺激后第3天收集悬浮细胞，这些细胞具有针对HPV16型E2蛋 白的靶细胞的细胞毒性(CTL细胞)，计数检测发现使用本发明涉及的 合成多肽药物或疫苗可以使CTL细胞数量较对照组增加50%-80%。将转染了 HPV16之E2基因的Caski细胞与上述CTL细胞共同孵育， 发现该CTL细胞可以溶破转染了 HPV16之E2基因的Caski细胞，溶破率 得到60%-卯％。由于采用了上述技术方案，本发明具有便于运输保存和自动化批 量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能 力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有人乳头瘤病毒16型相关肿 瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。 具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明本发明的氨基酸序列为氨基端-YICEDTSVTV-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高50%-80%，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破率为60实施例l:它的氨基酸序列可以为该多肽可以体外剌激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高60%，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破率为87.17%。实施例2:它的氨基酸序列也可以为-氨基端-YICEDTSVTV-羧基端K氨基端-KLYTAVSST-羧基端该多肽可以体外剌激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高50%，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破率为77.54%。实施例3:它的氨基酸序列还可以为该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核细胞，可以 增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL)的数量 提高55%，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破率为66.12%以上所述的氨基酸序列方法均是现有的成熟技术，它是按照如下的方 法制成的采用标准F m o c方案，起始选用0.0125 mmol， P S C树脂(A B I公司生产，批号A5F013)，分别按照权利要求1、 2、 3或4所述的 序列特征，使肽链从C端逐个向N端延伸，各氨基酸原料(美国A B I 公司生产)的用量为0. lmmo 1 。各种氨基酸保护基团是各氨基酸 的alpha氨基为Pm o c保护，其余侧链保护基团，A r g (M t r )、 tyr(tBu)、 Thr(tBu)、 Tyr(tBu)、 Asp(Ot B ii)。每步縮合都加入H o B t /D c c活化保护氨基酸的羧基。每步縮合用含有20W六氢吡啶的NMP溶液去除Fm o c保护基，肽 链合成后，按照A B I公司推荐的步骤，将含树脂的肽链加入处于冰 浴条件下的混合反应液中，反应液的成分结晶苯酸0. 75 g 、酒石酸乙 二胺(E D T)O. 25m 1 、苯硫基甲烷(T hionaisole)O. 5 m 1 、去离子水0. 5m 1 、三氟乙酸10m 1 。在室温条件下持续搅拌， 反应时间为4.5小时，把肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护 基。将混合液经4G的玻璃滤器过滤，以滤掉切下的树脂及保护基团， 并用三氟乙酸冲洗反应瓶和滤器，将滤液在常温下低压蒸发至1 2m 1 ，加乙醚50m 1使多肽沉淀后，经6G滤器过滤后，冷冻干燥，所得便 是肽产品。以上过程都是在A B I —431A固相自动肽合成仪(美国 生产)上完成。下面结合实验例对本发明作如下说明实验例1制备表达HPV16 E2蛋白的靶细胞模型(Caski细胞) 1 、主要仪器微量高速冷冻离心机；MJ. Research PCR扩增仪； 凝胶成像分析系统；电泳系统；FX-302型暗箱式紫外检测仪；YJ-875 SA 型超净工作台；THZ-C恒温振荡器；FA 1004电子天平；康乐电热恒温水浴 箱；0 30O型pH计。2、 主要材料1)菌株E. coliDH5a。 2)质粒pBR322/HPV16 为含目的基因HPV16E2的重组质粒；pIRES2-EGFP为含绿色荧光蛋白报告基 因的真核表达载体，含有Kana抗性基因。购自Clontech公司。3、 主要溶液配制1) LB培养液胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，溶于800ml ddH20中，用5MNaOH调整pH至7. 4，定容至1000ml，分装成100ml 后，高压蒸气灭菌，4'C保存。2) LB固体培养基100ml LB培养液中加入1.8g琼脂粉，高压蒸气灭 菌后，铺板，4'C保存。3) LB琼脂+A即培养液配制LB，高压消毒。冷却至5(TC左右，加Amp 使终浓度为100pg/ml， 4'C保存。4) LB琼脂+Amp固体培养基配制LB固体培养基，高压消毒。冷却 至50。C左右，加Amp使终浓度为100|iig/ml，铺板，4。C保存。5) LB琼脂+Kana培养液配制LB，高压消毒。冷却至5(TC左右， 加Kana使终浓度为50|ig/ml， 4'C保存。6) LB琼脂+Kana固体培养基配制LB固体培养基，高压消毒。冷 却至5(TC左右，加Kana使终浓度为50ing/ml，铺板，4"C保存。7) 电泳缓冲液(50xTAE): Tris碱24.2g， 0. 5M EDTA(pH8. 0) 10ml， 冰乙酸5. 71ml，加水至100ml。应用浓度为lxTAE。8) 溴化乙锭(EB):在20mlH20中溶解0. 2gEB，混匀后于4。C避光 保存。9) 0. 1MCaC12: CaC12.2H20 1. 47g,溶解于100ml水中，高压消毒， 4'C保存。4、 反应体系Pl(10,ol/L) l|ul P2(10|imol/L;) lfil dNTP(2.5mM) 1^1 10xBuffer 5pl MgCl2 (25mM) 3|il pBR322/HPV16pfb Ta。 (5u/ul)_lulddH20 up to 50|xl5、 反应条件1 cycle 94 。C 2min30cycle 94。C 50sec54。C 30sec72 °C 2min 1 cycle 72 °C lOmin4°C Hold反应完毕后取4^1反应产物，在1. 5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。6、 Caski细胞的培养1) 细胞寄到后，置于37'C、 5%032培养箱中培养，在倒置显微 镜下观察，待细胞贴壁至80—90%的时候，进行传代培养2) 弃去细胞培养液，PBS洗涤2 3遍3) 用0.25%胰蛋白酶(含0.02XEDTA)消化至悬浮状态迅速加 入含血清的1640培养基终止消化4) 500rpm/min离心5min5) 弃上清，加入新鲜培养基4mL，吹打重悬细胞6) 分装至3个培养瓶内，每个培养瓶内再加入2mL培养基7、质粒DNA转染Caski细胞细胞准备收获处于指数生长期细胞约"105个细胞接种于6孔细胞培 养板中> 使细胞达到40-60%融合，置于37。C、 5XC02培养箱中，无血清 培养24小时。转染48小时后，将6孔培养板直接置于荧光显微镜下，在 479nm的激发波长下激发绿色荧光，观察绿色荧光蛋白EGEP以及HPV16 E2在细胞中的定位和表达情况。实验例2体外诱导特异性性细胞毒性T淋巴细胞(CTL) 1、试剂和材料1) 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。2) PBS洗涤液。3) 重组人白介素(recombinant human IL-2)。4) 规格为1毫升和10毫升的刻度吸管。5) 75%酒精，无菌棉球，镊子。6) 显微镜、水平式离心机。7) HLA-A*020i阳性人体血液20mL (4x5mL)。按照本领域公知的方 法获得外周血单核细胞(PBMC)。2、方法培养PBMC细胞24小时后，取悬液(2X106/ ml) 4瓶。加入本发明所 述的基本的氨基酸序列多肽(20u g/ ml)和等量完全培养基，同时培养瓶内 加入rhlL-2使终浓度为50U/mL 、 37 °C、 5。/。C02下孵育。7天后重复该 刺激过程，共刺激3次。每次刺激之间，视情况加入新鲜RPMI1640培养 基，每一次刺激时均需吹打贴壁细胞至悬浮状态，洗涤，换培养瓶。按照 该方法便可以得到细胞毒性CTL细胞。实验例3 "Cr释放试验检测CTL细胞溶破Caski细胞的能力1、 主要仪器YJ-875 SA型超净工作台；水平式离心机；康乐电热恒 温水浴箱；恒温孵箱；Y-计数仪2、 主要实验材料靶细胞为转染了HPV16之E2基因的Caski细胞； 效应细胞为本发明所述的基本的氨基酸序列多肽与重组人IL-2协同刺激 人外周血单个核细胞()后得到的T淋巴细胞。放射性同位素Na^Cr04 ; RPMI1640培养基；盐酸(HC1);规格为6孔、96孔培养瓶。3、 靶细胞准备收获处于对数生长期的耙细胞(转染了 pIRES2-EGFP-HPV16E2质粒的Caski细胞)，洗涤后调整细胞浓度为2xl06/ml。取lxl()6细胞(0.5ml)，加Na251Cr 04100— 37。C孵育2 3h，每15min 轻轻振摇一次。用含有10%FCS的RPMI1640洗漆3次，每次800rpm离 心，5min，弃上清，重悬细胞至浓度为lxl05/ml。 96孔培养板中，每孔 加100^d(lxl()4细胞)，每份3个复孔，共42孔。4、 CTL细胞的加入每孔加入IO(VI不同细胞浓度的CTL细胞，最 大释放组加入100^11的lXmol/LHCL，以此溶破靶细胞效率为100%;自 然释放组加100pl完全培养基，以此为阴性对照组。每孔取出lOOiil上清， 按照本领域公知的方法在Y计数仪上测定cpm值。结果表明该多肽可以体外刺激HLA-A*0201阳性人体的外周血单核 细胞，可以增加这些外周血单核细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(简称CTL) 的数量提高50%-80%，还可以激活CTL溶破对HPV16型肿瘤细胞，溶破 率为60%-90%。氨基酸序列表的计算机可读形式的序列表电子文件<110>中国人民解放军第三军医大学第三附属医院<120>—种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗<130>无<140>申请号<141>2007-12画28<160>3<170>Patent In Version 2.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>1Tyr! lie Cys Gly Asp5 Thr Ser Val Thr Val10<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>2ThriLeu Gin Asp Val5 Ser Leu Glu Val9<210>3<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>3LysiLeu Tyr Thr Ala5Val Ser Ser Thr9 .
权利要求
1.一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端-YICEDTSVTV-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。
2. 如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为
3.如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为
4.如权利要求1所述的治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端-KLYTAVSST-羧基端
全文摘要
一种治疗人乳头瘤病毒16型引发的肿瘤的多肽药物或疫苗，其特征在于它的氨基酸序列为氨基端-YICEDTSVTV-羧基端；以赖氨酸为接头，将多个该氨基酸序列组成多拷贝的串联结构。本发明具有便于运输保存和自动化批量生产的优点，它具有激活特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力，该特异性CTL细胞具有杀伤、溶破具有人乳头瘤病毒16型相关肿瘤标志的靶细胞，效果明显，而且无毒副作用。
文档编号A61K38/16GK101214370SQ20071009323
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者吕凤林, 李元朝 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院