专利名称：注射用小牛血清去蛋白提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种注射用小牛血清去蛋白提取物及其制备方法，特别涉及一种小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂及其制备方法。
背景技术：
小牛血清去蛋白提取物(又称小牛血去蛋白提取物)，主要用于治疗脑血管疾病。目前小牛血去蛋白提取物的提取工艺一般是用小牛血清为原料采用加热除蛋白获得小牛血去蛋白提取物(见中国专利ZL200410013643.6)。专利号为ZL96120777.9的专利文献公开了一种提取小牛血去蛋白提取物的方法，采用乙醇除蛋白；小牛血去蛋白提取物的分子量小于5000道尔顿，因为分子量小，无抗原，不引发过敏反应。
专利号为ZL96120777.9的专利文献公开的小牛血去蛋白提取物以冻干粉的状态存在，只是为了便于小牛血去蛋白提取物的保存，这种简单的冻干粉不能作为临床应用制剂。而且这种冻干粉严重影响产品的稳定性，半年以上就发生潮解和变性。
目前小牛血清去蛋白提取物类注射剂只有水针。水针不稳定，常温放置就容易发生聚合、光解等反应而改变成分，甚至发生沉淀，产品保质较短。
发明内容
本发明的目的是提供一种注射用小牛血清去蛋白提取物及其制备方法，即小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂及其制备方法。
本发明所提供的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，含有下述重量份数比的组分 小牛血清去蛋白提取物干物质 1份； 甘露醇 9-11份； 小分子右旋糖苷 4.5-5.5份。
所述小牛血清去蛋白提取物是小牛血清去除蛋白后得到的提取液。
所述小牛血清去蛋白提取物是将小牛血清中加入两倍体积的质量百分含量为96％的乙醇，使蛋白变性沉淀，离心去除沉淀，去除乙醇得到的提取液。
所述小牛血清去蛋白提取物的分子量为5000道尔顿以下。
本发明所提供的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂的制备方法，是按照上述的重量份数比将甘露醇和小分子右旋糖苷加入到小牛血清去蛋白提取物中，在30-50℃溶解后得到混合液，冻干，得到小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂。
所述小牛血清去蛋白提取物的干物质质量百分含量优选为18-22mg/ml。
所述方法中，所述小牛血清去蛋白提取物是将小牛血清中加入两倍体积的质量百分含量为96％的乙醇，使蛋白变性沉淀，离心去除沉淀，去除乙醇得到的提取液。
所述方法中，还包括将所述去除乙醇得到的提取液在30-50℃蒸发浓缩。
所述方法中，所述冻干的步骤是将所述混合液先在-40℃预冻1小时，然后在20℃融化，然后再在-40℃预冻2小时后，在真空状态下，在-20℃保持8-10小时，在-15℃保持4小时，然后升至-10℃，每隔1小时升高10℃，至40℃时冻干结束。
所述方法中，还包括在冻干步骤前将混合液进行用截留分子量为5000道尔顿的中空纤维超滤柱过滤。
所述方法中，所述冻干步骤前还包括将混合液进行过滤除菌。
本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂外观细腻，产品质量稳定。可用来治疗以下疾病脑部血液循环和营养障碍性疾病(缺血性损害、颅脑外伤)；末梢循环障碍及其引起的动脉血管病、腿部溃疡；皮肤移植术；皮肤烧伤、烫伤、糜烂；愈合伤口(创伤、褥疮)；放射所致的皮肤、粘膜损伤。本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂克服了水针和输液质量不稳定的缺陷，延长产品有效期，扩展临床应用，降低不良反应发生的几率。本发明的制备小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂的方法中的冻干过程中进行了一步冻融，这种方法可以彻底释放产品中的水分，使冻干效果更好。
具体实施例方式 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、注射用小牛血清去蛋白提取物的组分含量筛选 一、注射用小牛血清去蛋白提取物(小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂)的制备 无菌采1-6个月龄幼牛静脉血，参照发明专利(专利号为ZL 96120777.9)实施例1中所述的方法分离出血清，检测小牛血清的pH值、血清总蛋白、血清白蛋白含量，选择满足以下条件的小牛血清 1)pH值小牛血清的pH值应为6.5-7.5。
2)血清总蛋白小牛血清稀释500倍，依《中国生物制品规程》一部35页方法测定血清总蛋白含量，应大于4.0g/100ml。
3)血清白蛋白含量取小牛血清0.02ml，依《中华医学检验全书》(1996年版)644页方法，测定血清白蛋白含量，应大于2.3g/100ml。
1、小牛血清去蛋白提取物的制备 参照发明专利(专利号为ZL 96120777.9)中实施例1所述的方法制备小牛血清去蛋白提取液，具体方法为选用上述分离的小牛血清(pH值为7.2，血清总蛋白含量为4.4g/100ml，血清白蛋白含量为2.5g/100ml)，加入两倍于小牛血清体积的质量百分含量为96％的乙醇，不断搅拌30分钟，静止60分钟，使蛋白变性沉淀，然后经10000rpm在4℃离心30分钟，得到去除蛋白上清液，将上清液利用真空旋转蒸发仪，在37℃，1个大气压下减压去除乙醇，在余下液体中加入复合蛋白酶(购于宁夏沁荣生物科技有限公司)水解24小时，在10000rpm、4℃，离心30分钟，留上清，将上清用5000道尔顿中空纤维柱超滤，收集得到的滤液即为小牛血清去蛋白提取液。用专利ZL 96120777.9中实施例1所述的方法检测该小牛血清去蛋白提取液的固形物(干物质)含量，结果表明固形物质量百分含量为10mg/ml。
2、小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂制备方法 1)浓缩分别取四组5000ml步骤1制备的小牛血清去蛋白提取液在用旋转蒸发仪在40℃条件下蒸发浓缩到2500ml，用专利ZL 96120777.9中实施例1所述的方法检测表明，该小牛血清去蛋白提取物干物质量百分含量为20mg/ml。
2)加赋形剂分别按照表1中所示样品2、样品3、样品4、样品5组分含量的要求，计算并准确称量甘露醇和小分子右旋糖酐加入到步骤1)得到的干物质量百分含量为20mg/ml的小牛血清去蛋白提取物，分别在40℃热溶，得到稀配液。
3)超滤将步骤2)得到的稀配液分别用切割分子量5000道尔顿的中空纤维超滤柱(购于上海群迈实验室设备有限公司)超滤稀配液得到超滤液，分别收集超滤液，用蒸馏水分别定容至3000ml备用。
4)除菌分装分别将步骤3)得到的超滤液用0.2微米孔径的滤膜过滤后，无菌操作分装，分别将过滤液按照3ml/瓶无菌操作分装至10ml规格已经清洗并烘干的西林瓶盛装。
5)将装有上述除菌后滤液的西林瓶半加塞后，冻干；冻干的步骤如下所述 ①预冻将分装后的产品装入冻干机(型号LYO-0.2，购于上海东富龙科技有限公司)中，调节前箱搁板温度至-40℃，预冻1小时。
②融化关闭制冷，调节前箱搁板温度至20℃，加热1-2小时，致产品瓶中的冰完全融化。
③再次预冻调节前箱搁板温度至-40℃，预冻2小时。
④真空干燥调节前箱温度至-20℃，同时前箱开始抽真空，后箱开始制冷；真空干燥8-10小时。
⑤共溶点保温保持真空状态，调节前箱温度至-15℃，保温4小时。
⑥解析干燥保持真空状态，调节前箱搁板温度至-10℃，以后每1小时升高搁板温度10℃，至40℃，保温至保压实验合格(关闭前箱真空阀，前箱压力升高前10秒小于3Pa为保压合格)后，压紧胶塞，冻干结束，得到小牛血清去蛋白提取物冻干粉针剂。
上述冻干过程无特别强调，均按照冻干的常规操作进行的。
6)扎盖从冻干机中取出制品，迅速扎上铝盖，即得满足要求的注射用小牛血清去蛋白提取物(表1所示的样品2、样品3、样品4或样品5)。
将上述小牛血清去蛋白提取液5000ml按照专利ZL 96120777.9中实施例1进行除菌分装冻干得到表1中的样品1。
表1.牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂组分含量筛选 分别在第0个月、6个月、12个月、18个月、24个月观察上述5组样品的性状、水份、活性、澄明度，以比较5组样品组方的合理性。
其中活性检测(SI)方法按照文献(于洪儒、肖建英促细胞代谢素注射液生物活性的实验研究《中国新药杂志》2000年第2期，96-98)进行；性状指标肉眼观察；水份和澄明度按照《中国药典》2005版2部的方法检测。
表2.第0个月检测结果 表3.第6个月检测结果 表4.第12个月检测结果 表5.第18个月检测结果 表6.第24个月检测结果 以上数据显示，除样品3各项技术指标在24个月内无变化外，其他样品的个别指标在6个月后都出现下滑，因此，样品3的组方比较合理。
实施例2、小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂的制备及其稳定性检测 一、小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂和注射液的制备 无菌采1-6个月龄幼牛静脉血，参照发明专利(专利号为ZL 96120777.9)实施例1中的方法分离出血清，检测小牛血清的pH值、血清总蛋白、血清白蛋白含量，选择满足以下条件的小牛血清 1)pH值小牛血清的pH值应为6.5-7.5。
2)血清总蛋白小牛血清稀释500倍，依《中国生物制品规程》一部35页方法测定血清总蛋白含量，应大于4.0g/100ml。
3)血清白蛋白含量取小牛血清0.02ml，依《中华医学检验全书》(1996年版)644页方法，测定血清白蛋白含量，应大于2.3g/100ml。
1、小牛血清去蛋白提取物的制备 参照发明专利(专利号为ZL 96120777.9)中实施例1所述的方法制备小牛血清去蛋白提取液，具体方法为选用上述分离的小牛血清(pH值为7.3，血清总蛋白含量为4.2g/100ml，血清白蛋白含量为2.6g/100ml)，加入两倍于小牛血清体积的质量百分含量为96％的乙醇，不断搅拌30分钟，静止60分钟，使蛋白变性沉淀，然后经10000rpm在4℃离心30分钟，得到去除蛋白上清液，将上清液利用真空旋转蒸发仪，在37℃，1个大气压下减压去除乙醇，在余下液体中加入复合蛋白酶(购于宁夏沁荣生物科技有限公司)水解24小时，在10000rpm、4℃，离心30分钟，留上清，将上清用5000道尔顿中空纤维柱超滤，收集得到的滤液即为小牛血清去蛋白提取液。用专利ZL 96120777.9中实施例1所述的方法检测该小牛血清去蛋白提取液的固形物(干物质)含量，结果表明固形物质量百分含量为10mg/ml。
2、小牛血清去蛋白提取物注射液生产方法 上述的小牛血清去蛋白提取液经过0.2微米孔径的滤膜过滤后，无菌操作分装至规格为5ml的清洗干净的安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白提取物注射液。
3、注射用小牛血清去蛋白提取物(冻干粉针注射剂)的生产 1)浓缩分别取三份5000ml步骤1制备的小牛血清去蛋白提取液在用旋转蒸发仪在40℃条件下蒸发浓缩到2500ml，用专利ZL 96120777.9中实施例1所述的方法检测表明，该小牛血清去蛋白提取液浓缩液干物质量百分含量为20mg/ml。
2)加赋形剂按照表7中所示样品2、3、4组分含量的要求，计算并准确称量甘露醇和小分子右旋糖酐加入到步骤1)得到的干物质量百分含量为20mg/ml的小牛血清去蛋白提取物，分别在40℃热溶，得到稀配液。
3)超滤将步骤2)得到的稀配液用切割分子量5000道尔顿的中空纤维超滤柱(购于上海群迈实验室设备有限公司)超滤稀配液得到超滤液，分别收集超滤液，用蒸馏水分别定容至3000ml备用。
4)除菌分装分别将超滤液用0.2微米孔径的滤膜过滤后，无菌操作分装，分别 将过滤液按照3ml/瓶无菌操作分装至10ml规格已经清洗并烘干的西林瓶盛装。
5)将装有上述除菌后滤液的西林瓶半加塞后，冻干；冻干的步骤如下所述 ①预冻将分装后的产品装入冻干机(型号LYO-0.2，购于上海东富龙科技有限公司)中，调节前箱搁板温度至-40℃，预冻1小时。
②融化关闭制冷，调节前箱搁板温度至20℃，加热1-2小时，致产品瓶中的冰完全融化。
③再次预冻调节前箱搁板温度至-40℃，预冻2小时。
④真空干燥调节前箱温度至-20℃，同时前箱开始抽真空，后箱开始制冷；真空干燥8-10小时。
⑤共溶点保温保持真空状态，调节前箱温度至-15℃，保温4小时。
⑥解析干燥保持真空状态，调节前箱搁板温度至-10℃，以后每1小时升高搁板温度10℃，至40℃，保温至保压实验合格(关闭前箱真空阀，前箱压力升高前10秒小于3Pa为保压合格)后，压紧胶塞，冻干结束，得到小牛血清去蛋白提取物冻干粉针剂。
上述冻干过程无特别强调，均按照冻干的常规操作进行的。
6)扎盖从冻干机中取出制品，迅速扎上铝盖，即得满足要求的注射用小牛血清去蛋白提取物(表7所示的样品2、样品3、样品4)。
观察室温条件下分别在第0个月、6个月、12个月、18个月、24个月观察小牛血清去蛋白提取物冻干粉针和水针的性状、活性、pH值、澄明度四个指标，比较水针和冻干粉针的稳定性。
表7.样品要求
二、小牛血清去蛋白提取物冻干粉针的制稳定性检测 分别在第0个月、6个月、12个月、18个月、24个月观察上述4组样品的性状、活性、pH值、澄明度，以比较水针和粉针的稳定性。其中活性(SI)检测方法按照文献(于洪儒、肖建英促细胞代谢素注射液生物活性的实验研究《中国新药杂志》2000年第2期)进行；性状指标肉眼观察；pH值和澄明度按照《中国药典》2005版2部的方法检测。
表8.第0个月检测结果 表9.第6个月检测结果 表10.第12个月检测结果 表11.第18个月检测结果 表12.第24个月检测结果 以上数据显示，在观察期的24个月内，从第6个月开始水针就出现变化，而且其活性持续下降，pH值持续升高，第12个月出现絮状沉淀；样品2、3、4冻干粉针剂型各指标没有明显变化。
实施例3、小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂对小白鼠常压耐缺氧能力的影响 选择健康的昆明种一级小白鼠(购自辽宁医学院SPF实验动物中心)80只，体重18-22g，雌雄各半，分成四组，实施例2制备的样品2组(小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂)、实施例2制备的样品3组、实施例2制备的样品4组、生理盐水对照组。
实施例2制备的样品2组(小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂)、实施例2制备的样品3组、实施例2制备的样品4组分别按照1.5mg小牛血清去蛋白提取物干物质/kg体重注射实施例2制备的样品2、实施例2制备的样品3、实施例2制备的样品4，一天一次，连续四天。给药方式为静脉注射(用无菌生理盐水溶解，按照每只小白鼠注射剂量为0.5ml计算浓度进行溶解稀释)。对照组，每天给予注射相同体积(0.5m/只)的生理盐水。
于末次给药后30分钟将所有小白鼠分别放入装有10g碱石灰的250ml广口瓶中，密闭常压缺氧，观察小白鼠存活时间，小白鼠死亡后测定脑组织中葡萄糖和乳酸的含量；脑乳酸和葡萄糖含量测定按照文献(毛捷、陈劲草GM1对大鼠脑缺血再灌注损伤的乳酸及葡萄糖含量的影响《安徽医科大学学报》2004年39卷6期，449-452)所述的方法进行。
常压缺氧小白鼠存活时间测定结果如表13所示，结果表明，实施例2制备的样品2组、实施例2制备的样品3组、实施例2制备的样品4组小白鼠存活时间均明显长于生理盐水对照组；实施例2制备的样品2、3、4组之间无明显差别。本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂在常压缺氧环境下对中枢神经系统具有保护作用；并且各组产品疗效无差别。
表13.常压缺氧小白鼠存活时间 肩注*表示同对照组比较P＜0.01 常压缺氧小白鼠脑乳酸含量测定结果如表14所示，结果表明，实施例2制备的样品2组、实施例2制备的样品3组、实施例2制备的样品4组小白鼠脑乳酸含量明显低于生理盐水对照组，实施例2制备的样品2、3、4组之间无差别。本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂能明显促进有氧代谢；并且各组产品疗效无差别。
表14.常压缺氧小白鼠脑乳酸含量 肩注*表示同对照组比较P＜0.01 常压缺氧小白鼠脑葡萄糖含量测定结果如表15所示，结果表明，实施例2制备的样品2组、实施例2制备的样品3组、实施例2制备的样品4组小白鼠脑葡萄糖含量均明显高于对照组，实施例2制备的样品2、3、4组之间无差别；表明本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂能明显促进中枢神经系统对葡萄糖的摄取；并且各组产品疗效无差别。
表15.常压缺氧小白鼠脑葡萄糖含量 肩注*表示同对照组比较P＜0.01 上述实验表明，本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂能促进常压缺氧小白鼠脑细胞进行有氧代谢；能促进血或其它组织葡萄糖向脑组织转运；能延长常压缺氧小白鼠存活时间。表明，本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂含有多种生理活性物质，能加强葡萄糖和氧转运入细胞，增加葡萄糖的利用。
权利要求
1.一种小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，含有下述重量份数比的组分
小牛血清去蛋白提取物干物质1份；
甘露醇9-11份；
小分子右旋糖苷4.5-5.5份。
2.根据权利要求1所述的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，其特征在于所述小牛血清去蛋白提取物是小牛血清去除蛋白后得到的提取液。
3.根据权利要求2所述的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，其特征在于所述小牛血清去蛋白提取物是将小牛血清中加入两倍体积的质量百分含量为96％的乙醇，使蛋白变性沉淀，离心去除沉淀，去除乙醇得到的提取液。
4.根据权利要求3所述的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，其特征在于所述小牛血清去蛋白提取物的分子量为5000道尔顿以下。
5.权利要求1所述的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂的制备方法，是按照权利要求1所述的重量份数比将甘露醇和小分子右旋糖苷加入到小牛血清去蛋白提取物中，在30-50℃溶解后得到混合液，冻干，得到小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述小牛血清去蛋白提取物的干物质质量百分含量为18-22mg/ml。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述小牛血清去蛋白提取物是将小牛血清中加入两倍体积的质量百分含量为96％的乙醇，使蛋白变性沉淀，离心去除沉淀，去除乙醇得到提取液，将提取液在30-50℃蒸发浓缩得到的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述冻干的步骤是将所述混合液先在-40℃预冻1小时，然后在20℃融化，然后再在-40℃预冻2小时后，在真空状态下，在-20℃保持8-10小时，在-15℃保持4小时，然后升至-10℃，每隔1小时升高10℃，至40℃时冻干结束。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中，还包括在冻干步骤前将混合液进行用截留分子量为5000道尔顿的中空纤维超滤柱过滤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述冻干步骤前还包括将混合液进行过滤除菌。
全文摘要
本发明公开了一种小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂及其制备方法。该小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂，含有下述重量份数比的组分小牛血清去蛋白提取物干物质1份；甘露醇9-11份；小分子右旋糖苷4.5-5.5份。本发明的小牛血清去蛋白提取物冻干粉针注射剂克服了水针和输液质量不稳定的缺陷，延长产品有效期，扩展临床应用，降低不良反应发生的几率。
文档编号A61K35/14GK101120924SQ20071011915
公开日2008年2月13日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者于洪儒, 王洪新, 张敬国, 菁 杨 申请人:锦州奥鸿药业有限责任公司