专利名称：：地衣芽孢杆菌在治疗妇女真菌性阴道炎药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及芽孢杆菌的一种新的医药用途，尤其涉及地衣芽孢杆菌(&c^hs"C力e/7J'/027Z^S)在治疗妇科疾病中的一种新用途，属于微生物领域。
背景技术：
：中国专利92113318.9(授权公告号CN1044324C，授权公告日1999年7月28日)公开了一种地衣芽孢杆菌(5acj'"^"c力e/7J'/br啦's)63516株(其微生物保藏号是CGMCCN0:0183)，该菌株来源于1986年中国人民解放军二零三医院妇产科一健康待产孕妇的阴道拭子，其背景是为了分离乳酸杆菌用其制备酸奶，治疗因大量使用抗生素而导致的肠道菌群失调症。该孕妇在生产后其阴道拭子没有再能分离出该菌株，而在当时妇产科其它健康的待产孕妇阴道式子中也未能分离出该菌株，该菌株的发现极具偶然性。该菌株具有如下生物学特征(1)该菌与阴道正常菌群的优势菌嗜酸乳杆菌在同一生境中为共生或促生关系，有利于该生境菌群失衡状态的调节；(2)该菌群在生境中能产生多组份抗生活性物质，对一些致病菌和条件致病菌有一定的生物拮抗效应，因此具有双重调节作用，该菌株制成的生物制剂临床上可用于治疗急慢性腹泻和肠道菌群失调症。专利号为98100113.0的中国专利(授权公告号CN1109752C，授权公告日2003年5月28日)公开了一种地衣芽孢杆菌20389株(其微生物保藏号是CGMCCNO:0298)，该菌株也来源于健康待产孕妇的阴道，该专利公开了地衣芽孢杆菌20389株对急慢性肠炎，轻型痢疾以及细菌性阴道病有较好的疗效。目前，对-些念珠菌性阴道炎的治疗药，在临床应用中，医生持谨慎态度，主要是考虑其不良反应，如甲硝唑的致畸作用、抗菌素的致阴道菌群失调作用等。市场上出现的比较多的用于念珠菌性阴道炎的药物主要有达克宁栓(肾上腺[皮质激素类)、克霉唑(抗真菌感染药)、制霉菌素(抗真菌感染药)。用于细菌性非特异性阴道炎的药物主要为各类抗生素及各种中药洗液。各种药物的专属性比较强(即只适用于单一阴道炎的治疗)，而不具有普适性。迄今为止，缺乏一种能够有效治疗真菌性阴道炎尤其是念珠菌性阴道炎的微生态调节剂，该微生态调节剂需在完成治疗作用的同时，不会导致阴道菌群的失调，能够对真菌性阴道炎(尤其是念珠菌性阴道炎)达到理想的治疗效果。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种能够有效治疗真菌性阴道炎(尤其是念珠菌性阴道炎)的微生态调节剂。发明人在对地衣芽孢杆菌63516株(其微生物保藏号是:CGMCCN0:0183)的生物学特性进行系统研究的时候，非常意外的发现地衣芽孢杆菌(万a"W^h'c力e/7i/br/zj's)CGMCCNO:0183对真菌性阴道炎(尤其是念珠菌阴道炎)具有显著的治疗作用。如
背景技术：
所述，授权公告号为CN1109752C的专利公开了一种可用于治疗细菌性阴道病的地衣芽孢杆菌20389株(其微生物保藏号是CGMCCNO:0298)，但由于真菌性和细菌性阴道炎的致病菌在生物学特性上有很大的区别，两种阴道炎在疾病的成因上也有很大的不同。正常状态下，妇女阴道中可分离出30余种微生物，最常见的有乳酸杆菌、白色念珠菌、棒状杆菌、链球菌、大肠埃希菌、类杆菌等。其中，最重要的是乳酸杆菌，它在健康妇女的阴道排出物标本中分离率高达50-80%。在乳酸杆菌检出率高的个体，白色念珠菌、棒状杆菌等检出率也高，白色念珠菌等真菌有强发酸能力，在乳酸杆菌分解碳水化合物产酸有协同作用，成共生性。白色念珠菌亦为条件致病菌，当其检出率超出乳酸杆菌时则为真菌性阴道炎。真菌性阴道炎发病时，阴道上皮内糖原数量增加，阴道内pH值《4，阴道内固有的乳杆菌，主要是嗜酸乳杆菌(阴道内主要的益生菌)数量减少是此时微生态环境发生的主要的变化。细菌性阴道炎发生时，阴道内pH值^5.5乳酸杆菌检出率下降，白色念珠菌也下降，而大肠埃希菌、类杆菌、链球菌等条件致病菌的检出率增加，使阴道内的微生态环境处于失去平衡状态。白色念珠菌和阴道内固有的益生菌一乳杆菌为共生关系，可共同分解阴道上皮内的糖原，生成具有维持环境酸碱度作用的醋酸，由此可以看出，对于治疗真菌性阴道炎，理想的微生态调节剂不是将阴道内的念珠菌完全杀灭，而是将其数量控制在合理水平，于此同时，又能显著增加阴道内有益菌乳酸杆菌的数量。显然，由于真菌性和细菌性阴道炎其阴道内的微生态环境(譬如微生物的种类、数量；阴道内的pH值等)存在巨大的差异，不经过大量的试验和创造性的劳动，是不可能推断或预测地衣芽孢杆菌可以将阴道内白色念珠菌数量控制在合理水平，同时又能大大增加阴道内有益菌乳杆菌的数量，使阴道内的微生物种群和数量以及微生态环境趋与健康、和谐，恢复到正常状态，从而可有效治疗真菌性阴道炎，并且在完成治疗作用的同时，不会造成二次感染(即从一种类型的阴道炎转化为另外一种类型的阴道炎)。由于地衣芽孢杆菌20389株(其微生物保藏号是CGMCCNO:0298)，也来源于健康待产孕妇的阴道，该菌株与地衣芽孢杆菌63516株具有相似的生菌性阴道炎(尤其是念珠菌阴道炎)具有治疗作用。此外，本发明通过对地衣芽孢杆菌CGMCC63516株(其微生物保藏号是CGMCCNO:0183)的生物学特性进行系统全面的研究，发现该菌株有很好的环境耐受性，温度在-50—9(TC范围内都可以保持其活性，这样的特点给研究制剂工艺创造了便利条件。因此，地衣芽孢杆菌无论是制备成阴道用胶囊还是阴道用栓剂，都不存在技术难点。通过动物试验发现，在地衣芽孢杆菌不同剂量给药组的家兔阴道冲洗液中，白色念珠菌的数量有较为明显的减少，但不是完全杀灭，这进一步证实了地衣芽孢杆菌为一种阴道微生态环境调节剂，而非抗生素。由于在正常条件下，白色念珠菌和阴道内固有的益生菌一乳杆菌为共生关系，可共同分解阴道上皮内的糖原，生成具有维持环境酸碱度作用的醋酸，因此，将白色念珠菌数量控制在合理的范围内，较完全杀灭白色念珠菌，对阴道正常微生态环境的建设更为有益。地衣芽孢杆菌在阴道正常微生态环境的建设中起到了调整菌群平衡的作用，因此地衣芽孢杆菌微生态制剂，在对念珠菌性阴道炎的治疗上是有效的。通过毒性及刺激试验证明地衣芽孢杆菌有良好的安全性，另外，发明人对其菌种的大量研究和该菌种用于治疗肠道疾病的制剂的多年临床实践也证明了该菌种的安全性。所以该活菌制剂对于念珠菌性阴道炎具有显著的治疗效果，临床应用安全。具体实施方式实施例l地衣芽孢杆菌泡腾片的制备泡腾片所使用的地衣芽孢杆菌菌粉按照中国专利92113318.9(授权公告号CN1044324C;授权公告日1999年7月28日；发明名称地衣芽孢杆菌生态制剂的制备方法)所公开的发酵工艺生产的菌粉。地衣芽孢杆菌泡腾片制剂技术方案如下1、制造配方酒石酸氢钾25-40%碳酸氢钠10-20%羧甲基纤维素0.5-1%乳糖20-35%预胶化淀粉5—10%地衣芽孢杆菌菌粉5-10%硬脂酸镁适量10%淀粉糊适量2、制造方法2.1取羧甲基纤维素加适量蒸馏水浸溶，与10%淀粉糊适量混合作成黏合剂。2.2酒石酸氢钾、碳酸氢钠分别过80目筛后加黏合剂制粒，干燥后过80目筛。2.3乳糖、预胶化淀粉及地衣芽孢杆菌菌粉，混合均匀后，加黏合剂制成颗粒，干燥后过80目筛。2.4以上三种颗粒，加硬脂酸镁混合均匀，压片，每片0.5g。2.5批次的划分以生产车间同一个总混设备，一次总混取得的全部颗粒所压制的片剂为一个批次。3主要技术指标3.l活菌数的测定每片活菌数不少于5-15亿。3.2水分测定《3%。3.3崩解时限按《中华人民共和国药典》2005年版二部附录》崩解时限测定法检测，崩解时间《5分钟。3.4发泡量按《中华人民共和国药典》2005年版二部附录片剂阴道泡腾片发泡量检测方法，发泡量^6ml。3.5片重差异0.5g±7%。3.6杂菌检査不得检出金黄色葡萄球菌、白色念珠菌，杂菌数量《1000个/g。3.7霉菌检查霉菌数《100个/g。3.8安全性实验以体重2-2.5kg雌性家兔2只，每只阴道给药l/4片，连续三天，观察五天，隔日涂片检査阴道清洁度应正常。4保存常温下置干燥，避光处保存。7试验例11地衣芽孢杆菌泡腾片对念珠菌的体外抑菌试验1.1试验方法首先用比浊法测出试验各菌的对数生长期的时值；取各试验菌的12-24小时肉汤培养液以1/20比例接种于5ml肉汤管中，37t培养至各菌的对数生长期的时值；分别取CGMCCNO:0183和各靶细菌的对数期菌液并以1/40比例混入同一试管内，分别设靶细菌的对照管；置37'C培养同时将上述对数期菌液作适当稀释，取0.Olml点种于琼脂平板，经37'C培养后分别计数菌落形成单位，取各菌落数的对数进行统计学分析。1.2试验结果地衣芽孢杆菌(CGMCCNO:0183、白色念珠菌20131(购买中国药品生物制品检定所)表1地衣芽孢j汗菌泡腾片对念珠菌的体外抑菌试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>试验结果分析:(1)在CGMCCNO:0183和20131混合培养的试管中，经过48小时培养，白色念珠菌的数量没有显著的增加(P〈0.5无统计学意义上的增加)，而同样的培养基，单独培养白色念珠菌的试管中，白色念珠菌数量有显著增加(有统计学意义上的增加)。(2)结果证明，地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183菌株对白色念珠菌有显著的抑制作用。试验例2地衣芽孢杆菌(CGMCCNO:0183)的制剂对念珠菌性阴道炎动物治疗的试验1.1试验家兔模型的建立取试验用成熟雌性新西兰大白兔22只，随机分4组，试验组3组，每组6只，感染对照组l组，4只。试验组和感染组大白兔阴道脱污后，将念珠菌20131菌液(3.6X108CFU/ml)注入其阴道深度5-8cm处，注入数量2.5ml，连续注入5天。模型完成时，①观察外观红肿、溃烂、出现大量分泌物为阳性(模型建造成功)，无此种变化为阴性；②阴道拭子涂片，Gram's染色镜检，阴道洁净度分级，III-IV为阳性，I-II为阴性。③中型白细胞检査检查出大量的中性白细胞为阳性，少量及没有为阴性。1.2念珠菌性阴道炎合格动物模型标准(+为阳性，-为阴性)表2念珠菌性阴道炎合格动物1漠型标准检测项目健康兔实验模型兔外观无异常变化红肿、出现大量分泌物或溃烂阴道洁净度Im-iv中性白细胞检査—+1.3试验方案将己随机分组的家兔编号A、B、C，A组:6只，每只每次阴道给药量12.5mg/0.125亿活菌(地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183)(用2.5ml无菌水稀释)；B组6只，每只每次阴道给药量25mg/0.25亿活菌(地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183)(用2.5ml无菌水稀释);C组6只，每只每次阴道给药量50mg/0.50亿活菌(地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183)(用2.5ml无菌水稀释)。感染对照组4只，每只每次给空白无菌泡腾片，12.5mg(用2.5ml生理盐水稀释)。试验过程中，第2、4、6、8、10天对全部试验动物进行表3所列项目的检查及检验，中型白细胞通过阴道拭子镜检观察，活菌计数方法略1.4实验结果(乳杆菌、地衣芽孢杆菌和念珠菌计数单位为Lgn7ml，表中活菌计数的数值为全部试验动物活菌计数的平均值)表3地衣芽孢杆菌对念珠菌性阴道炎动物治疗的试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*说明表中洁净度、外观项内的阿拉伯数字代表实验动物的数量2.5试验结论地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183的微生态制剂对小样本(18)只念珠菌性阴道炎家兔模型的实验治疗是有效的，三种不同剂量组的全部治疗家兔经6-8天全部治愈，停药2-4天未见复发。剂量分组实验结果提示，12.5mg剂量组的全部治愈时间终点为8天，较25mg和50mg剂量组延长两天；但三个不同剂量组的治疗起效时间，无明显差别，皆在2日内起效。三个试验组，念珠菌数量有不同程度的下降，乳杆菌数量有明显的增加，显示地衣芽孢杆菌在促进有益菌生长，抑制有害菌生长上面，有显著的作用。分析上面的试验数据，我们发现，在地衣芽孢杆菌不同剂量给药组的家兔阴道冲洗液中，白色念珠菌的数量有较为明显的减少，但不是完全杀灭，这进一步证实了地衣芽孢杆菌为一种阴道微生态环境调节剂，而非抗生素。由于在正常条件下，白色念珠菌和阴道内固有的益生菌一乳杆菌为共生关系，可共同分解阴道上皮内的糖原，生成具有维持环境酸碱度作用的醋酸，因此，将白色念珠菌数量控制在正常的范围内，较杀灭白色念珠菌，对阴道正常微生态环境的建设更为有益。地衣芽孢杆菌在阴道正常微生态环境的建设中起到了调整菌群平衡的作用，因此地衣芽孢杆菌微生态制剂，在对念珠菌性阴道炎的治疗上是有效的。结果提示，CGMCCNO:0183制剂治疗实验家兔念珠菌性阴道炎的最佳治疗剂量为25mg(0.25亿活菌)/2.5kg，一个疗程为6天，有效率为18/18，近期(六天)治愈率为100%。试验例3地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183菌株活菌制剂急性毒性实验2.1实验材料2.1.1试药(1)受试药物实施例1所制备的白色地衣芽孢杆菌泡腾片，每片0.5g，含1X109个活菌；(2)对照药物白色空白泡腾片，主要成分包括预胶化淀粉、乳糖、酒石酸氢钾；碳酸氢钠(即与地衣芽孢杆菌泡腾片辅料的配方和工艺一致)。2.1.2实验动物健康成年Sprague-dawlay雌性大鼠，平均体重229士12g，由大连医学院实验动物中心提供。实验动物合格证号辽实动字522。动物实验室的温度为20士2。C，相对湿度为50±10%。2.2实验方法取雌性大鼠20只，随机分成2组，分别为空白对照组和给药组，每组10只。向对照组动物阴道内一次置入不含地衣芽孢杆菌的空白泡腾片125mg/只；向给药组动物阴道内一次置入受试药物125mg/只，按试摇所含活菌数量换算，其剂量为1.09X109个活菌/kg体重。保证接触时间大于4小时，给药后观察，并连续观察7天。2.3实验结果与结论观察期间受试动物全身状况良好，体重、呼吸、循环、中枢神经系统等均正常，无一例死亡。因此，地衣芽孢杆菌活菌泡腾片的大鼠经阴道给药的半数致死量(LD5。)大于1.09X109个活菌/kg体重。试验例4地衣芽孢杆菌CGMCCNO:0183阴道刺激性实验ii1.实验材料1.1试药(1)受试药物白色地衣芽孢杆菌泡腾片(实施例l所制备)，每片0.5g，含1X109个活菌；(2)空白泡腾片，主要成分包括预胶化淀粉、乳糖、酒石酸氢钾；碳酸氢钠(即与地衣芽孢杆菌泡腾片辅料的配方和工艺--致)。1.2实验动物健康盛年Sprague-dawlay雌性大鼠，平均体重228土13g，由大连医科大学实验动物提供。实验动物合格证号辽实动字522。动物实验室的温度为20士2。C，相对湿度50±100/0。2.实验方法取大鼠18只，随机区组3组，分别为空白对照组、赋形剂对照组和给药组，每组6只。空白对照组动物不作任何处理；向赋形剂读动物阴道内置入不含地衣芽孢杆菌的泡腾片赋形剂25mg/只；向给药组动物阴道内置入受试药物25mg/只，按试药所含活菌数计算，其剂量为2.2X109个活菌/kg体重，约为预计临床用量的ll倍。与其黏膜接触时间大于4小时。每天一次，连续一周。于末次给药后24小时将动物处死，取出局部阴道组织进行观察。3.结果与结论受试动物给药(实施例l所制备的地衣芽孢杆菌泡腾片)后，其阴道组织均无红肿和充血，也未见其他变化，且无一例动物死亡。因此，地衣芽孢杆菌活菌泡腾片对大鼠阴道无刺激性。地衣芽孢杆菌通过上述毒性及刺激试验证明其有良好的安全性，另发明人对其菌种的大量研究和该菌种用于治疗肠道疾病的制剂的多年临床实践也证明了该菌种的安全性。权利要求1、地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)在制备治疗妇女真菌性阴道炎药物中的用途。2、按照权利要求1的用途，其特征在于所述的地衣芽孢杆菌(^a"'W^"c/e;n'/br肌's)分离自健康待产孕妇的阴道。3、按照权利要求2的用途，其特征在于所述的地衣芽孢杆菌(&"W"sZj'c力e/7jYbi7Z7J's)的微生物保藏号是CGMCCN0:0183或CGMCCNO:0298。4、按照权利要求1的用途，其特征在于所述的妇女真菌性阴道炎是念珠菌性阴道炎。全文摘要本发明公开了地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)，尤其是微生物保藏号为CGMCCNO0183或CGMCCNO0298的地衣芽孢杆菌在制备治疗妇女真菌性阴道炎(尤其是念珠菌性阴道炎)药物中的新用途。通过实验发现，地衣芽孢杆菌为一种阴道微生态环境调节剂，能够将阴道内的念珠菌数量控制在合理水平，同时能显著增加阴道内有益菌乳杆菌的数量，在阴道正常微生态环境的建设中起到了调整菌群平衡的作用，从而有效治疗真菌性阴道炎。毒性及刺激试验证明地衣芽孢杆菌有良好的安全性，临床应用安全。文档编号A61K35/66GK101322724SQ20071011895公开日2008年12月17日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者吴晓松申请人:吴晓松