专利名称：：抗肿瘤复方番荔枝制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属于中药领域，具体涉及一种由番蕃枝种子和广玉兰组成的抗肿瘤复方制剂。
背景技术：
：广玉兰(MagnoliagrandifloraL.),又名荷花玉兰，为木兰科木兰属植物，常绿乔木。广玉兰原产北美洲东南部，19世纪末20世纪初引入我国，目前在长江流域及以南各城巿广为栽培。广玉兰属阳性树种，喜光，耐半阴，是优良的绿化观赏树种，抗S02、氯气等能力强，其叶入药少，主要用于高血压病(1、中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志<第三十卷第一分册>北京科学出版社.1996:125;2、斐鉴，等.中国药用植物志<第五册>.北京科学出版社，1957:31)。广玉兰叶中含有多种生物碱及萜类成分(吴征镒，等.新华本草纲要<第一册〉.上海上海科学技术出版社，1988:58.)。文献(Twonewgermacranolidesfromgrac^/7om.J.AsianNatProdRes.2001,3(2):95-102)报道了从广玉兰中分离的倍半萜内酯类化合物，其中包括2-a-羟基-二氢小白菊内酯、小白菊内酯、木香内酯等内酯类化合物。有文献报道从小白菊中提取分离得到是小白菊内酯化合物及其类此的含内酯环的倍半萜内酯类化合物具有抑制肿瘤细胞生长的活性。番荔技为番荔枝科植物，属双子叶植物纲木兰亚纲，具有比较原始的性状，被达尔文成为"活化石"，原产于美洲热带，全世界有120属2100种。我国共有24属103种及6个变种，主要分布于西南至台湾，大部分产于华南及云南南部。华南引种的热带品种有圆滑番荔枝、刺果番荔枝、牛心番蕃技、毛叶番蕃枝等。番荔枝科植物中有7属12种可供药用，一般用来清热解毒、驱虫、止痢、抗肿瘤、抗疟等，今年来从番荔技科植物中分离得到的一类新颖的植物成分-番荔枝内酯(Annonaceousacetogenins)显示了很强的抗肿瘤活性，由于其结构独特，作用机理不同于现有的抗癌药物，是作用于线粒体干扰能量代谢，而且无致突变性，引起人们极大兴趣。中国专利已公开多篇对番荔枝内酯分离提取、番荔枝内酯类化合物结构修饰及其在抗肿瘤方面的应用文献，如CN1171850C公开了一种番荔枝二萜化合物及其制法和用途专利；CN1209355C公开了一种新型番蕃枝内酯衍生物及其制备方法和用途专利；CN1141093C公开了一种番蒸枝内酯抗癌有效部位药及其制备方法，其有效部位即为番荔技总内酯。
发明内容本发明的目的在于提供一种由番荔技种子和广玉兰叶/花组成的中药复方制剂，番荔枝种子与广玉兰叶/花的重量配比为番荔枝种子14重量分，广玉兰叶/花3~8重量份。本发明中，原料番荔枝种子可以是从光叶番荔技(AnnonaglabraLi皿)、牛心番篇技(AnnonareticulateLinn)、弟'J果番蠤枝(AnnonamuricataLinn)中的任一种。本发明中，所用的广玉兰可以是广玉兰叶，也可以是广玉兰花，还可以是广玉兰叶和花的混合。本发明复方中，主要有效成分是番荔技内酯类化合物和广玉兰内酯类化合物。本发明中，番荔枝内酯类化合物可以是从番荔技中提取得到的单一的内酯化合物，如番荔辛；也可以是番荔枝中的几种内酯类化合物的混合；或者也可以是番荔技总内酯类提取物。本发明中，广玉兰内酯类化合物，可以单一的从广玉兰中分离得到的内酯类化合物，如小白菊内酯；也可以是广玉兰中的几种内酯类化合物的混合，如小白菊内酯与木香烃内酯的混合；或者还可以是广玉兰总内酯提取物。本发明的复方，其活性成分是指由番蕃枝中提取的番篇枝内酯或番蕃枝总内酯与广玉兰中提取得到的内酯或广玉兰总内酯的组合。本发明中，番荔枝内酯除可从番荔技科番蕃技属植物一如光叶番荐枝(又称圆滑番荔枝)中分离得到外，还可从番荔技科的其它属中分离得到，如紫玉盘属(Uvaria),哥钠香属(Goniothalanus)，泡泡树属(Asimina)，卷团属(Rollinia),木瓣树属(Xylopia)或暗罗属(Polyathia)中分离得到，其属中的植物如海南哥纳香(Goniothalamushowii)、长叶哥钠香(Goniothalamusgardneri)、田方骨(Goniothalamusdo皿ariensis)、大花哥纳香(G.griffithii)、景洪哥钠香(G.cheliensis)、大叶紫玉盘(Uvariamacrophylla)、刺果紫玉盘(U.calamistrata)、越南紫玉盘(U.tonkinesis)、刺果番蕃技(Annonamuricata)、囊瓣木(Saccopetalumprolificum)。本发明中所述的番荔技内酯类化合物是指一类具有含末端Y-内酯环及四氢呋喃或吹喃环为主要结构特征的长烷基链化合物，广玉兰内酯类化合物是指一类具有a-亚甲基卞内酯环的化合物。番篇技内酯和广玉兰中的倍半萜烯内酯是两类结构不同、抗肿瘤机理亦不同的内酯化合物。番蕃技内酯的Ames试验显阴性，表明这种化合物可能不是致癌源，也进一步说明其作用靶点不是染色体或DNA，其对线粒体复合物I具有强烈抑制作用，作用机理是通过抑制线粒体NADH氧化还原酶，从而阻止呼吸链电子的传递，使ATP产生迅速减少，由于能量的减少引起P-gp(可渗透性蛋白)功能的减弱及随后的细胞凋亡。同时，番荔枝内酯能引起细胞内活性氧的增加和线粒体膜点位的降低，活性氧的大量释放和线粒体膜电位的降低均能引起半胱氨酸蛋白酶caspase-9的释放，从而激活了半胱氨酸蛋白酶caspase-3，活化的caspase-3使其它底物PARK降解，从而诱导了肿瘤细胞的凋亡。而广玉兰中的倍半萜烯内酯(如小白菊内酯)作为环氧化酶抑制剂(主要通过抑制脂多糖中的蛋白酪氨酸活化而抑制环氧化酶-2(COX-2)的活性)及作为核转录因子NF-kB抑制剂(NF-kB可控制多种重要的基因表达，包括肿瘤基因)，COX-2、NF-kb在肿瘤细胞的增殖过程中都发挥着重要的作用，通过对其活性的抑制而达到抑制肿瘤细胞中的DNA合成及肿瘤细胞增殖作用。本发明通过体外和体内试验证明，将两种内酯联合使用，在抑制肿瘤细胞生长方面具有协同增强的作用。本发明活性提取物制备工艺可以通过如下方式实现-.(1):分别取番蠤枝种子和广玉兰，粉碎，合并，用810倍量的石油醚浸泡提取23次，过滤，去除滤液，滤渣挥干石油醚备用；(2):滤渣用去810倍量的去离子水浸泡提取23次，过滤，弃水提取液，滤渣备用；(3):滤渣用能与水互溶的有机溶剂系统提取23次，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至浸膏状，加适量去离子水分散浸膏，分散液用氯仿或乙酸乙酯萃取至萃取液颜色变淡，合并萃取液，减压浓缩，干燥，即得活性提取物。本发明提取时所用的能与水互溶的有机溶剂可以是选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮中的任一种，也可以是这几种有机溶剂的任意混合系统。本发明中，提取时所用的有机溶剂优选乙醇，更优选75%~95%的乙醇。本发明所用的提取方法，可以是浸泡提取法，也可以是滲漉提取法，或者回流提取法，或者逆流提取法，本发明中，优选浸泡提取法。本发明的活性提取物除用上述方法得到外，还可以通过其它方式得到。比如同上述工艺步骤，将番荔技与广玉兰分开提取，得到各自的总内酯后合并既得活性成分。本发明中，在要得到纯度更高的内酯时，还可在其中加入纯化步骤。如在得到总内酯后，将总内酯上硅胶柱，进行纯化，用石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮或己烷-乙酸乙酯或己烷-丙酮或氯仿-乙酸乙酯或氯仿-丙酮或氯仿-甲醇混合溶液系统进行梯度洗脱，收集所需要的内酯成分即可得到纯度更好的总内酯活性部位。在本发明的活性成分中，加入药学上可接受的制药辅料，采用常规的制剂工艺，即可制成所需的药剂。本发明中，制成的制剂优选口服制剂，如片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、混悬液等。本发明所用的制药上的辅料，可以选自于粘合剂(可以是聚维酮、淀粉桨、纤维素等)、崩解剂(可以是干燥淀粉、羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等)、润滑剂(可以是滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙镁、硬脂酸钙等)、矫味剂(可以是蔗糖、阿司巴甜、甜菊素、果糖等)、稳定剂(可以是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯等)、稀释剂(可以是淀粉、糊精、糖粉、乳糖等)、润湿剂(可以是水或乙醇)、助流剂(可以是微粉硅胶)、赋形剂(可以是糖类衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇；淀粉类衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精或羧甲基淀粉；纤维素衍生物如结晶纤维、羟丙基纤维、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙；硅酸盐衍生物如硅酸镁铝；磷酸盐衍生物如磷酸锦；硫酸盐衍生物如硫酸钙；碳酸盐衍生物如碳酸4丐；阿拉伯胶；右旋糖苷)。本发明糖衣片剂可以通过如下工艺程序实现称取本发明提取物30g，淀粉30g，糊精25g，蔗糖(粉)5g，混匀，以80%的乙醇为润湿剂制成颗粒，6(TC以下干燥，加入滑石粉5g，硬脂酸镁lg，压制成1000片，包糖衣，即得。具体实施例活性成分制备实施例实施例1称取番荔枝lkg,广玉兰叶3kg,粉碎，混合，以8倍量石油醚室温浸泡提取2次，过滤，去除石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用75%的乙醇浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的8倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓缩至浸膏状，加入去离子水适量，分散浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC减压浓缩，真空干燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，采用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。实施例2称取番荔枝lkg,广玉兰叶8kg，粉碎，混合，以8倍量石油醚室温浸泡提取2次，过滤，去除石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用95%的乙醇浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的8倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓缩至浸膏状，加入去离子水适量，分散浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC减压浓缩，真空千燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，釆用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。实施例3称取番荔技4kg，广玉兰叶3kg，粉碎，混合，以8倍量己烷室温浸泡提取2次，过滤，去除己烷提取液，滤渣挥干己烷，以8倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用80%的乙醇浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的8倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓缩至浸膏状，加入去离子水适量，分散浸膏，分散液以乙酸乙酯萃取至萃取液颜色变淡，合并乙酸乙酯萃取液，5(TC减压浓缩，真空干燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，采用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。实施例4称取番荔技4kg，广玉兰叶8kg，粉碎，混合，以8倍量石油醚室温浸泡提取2次，过滤，去除石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用甲醇浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的8倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓缩至浸膏状，加入去离子水适量，分散浸膏，分散液以乙酸乙酯萃取至萃取液颜色变淡，合并乙酸乙酯萃取液，5(TC减压浓缩，真空干燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，采用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。实施例5称取番蕃枝3kg,广玉兰叶3kg,粉碎，混合，以10倍量石油醚室温浸泡提取2次，过滤，去除石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以10倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用丙酮浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的10倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓縮至浸膏状，加入去离子水适量，分散浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，5(TC减压浓缩，真空干燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，采用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。实施例6称取番荔技2kg，广玉兰叶5kg，粉碎，混合，以8倍量石油醚室温浸泡提取2次，过滤，去除石油醚提取液，滤渣挥干石油醚，以8倍量去离子水浸泡提取2次，过滤，弃水提取液，滤渣再用85%的乙醇浸泡提取3次，每次溶剂用量为药材的8倍，过滤，合并滤液，6(TC减压浓缩至浸膏状，加入去离子水适量，分散9浸膏，分散液以氯仿萃取至萃取液颜色变淡，合并氯仿萃取液，50'C减压浓缩，得浸膏，浸膏拌入硅胶，采用硅胶柱层析精制，先以流动相石油醚-丙酮20:l洗脱，改用石油醚-丙酮3:l洗脱，收集3:1系统洗脱部分，4(TC减压浓缩，真空干燥，得活性提取物。活性提取物加入制药上可接受的制药辅料，采用常规的制剂技术，即可制得所需剂型。药理实施例以下药理实验组中，原料药番荔枝为3重量份，广玉兰叶/花5重量份。1、体外药理实施例细胞株白血病细胞株K562、乳腺癌细胞株MDA-MB-436、肝癌细胞BEL-7402。将处于对数生长期的的白血病细胞珠、乳腺癌、肝癌细胞、和LAK细胞(对照组)用RPMI-1640培养基配成2xl05/ml细胞悬液，加入96孔圆底细胞培养板内，每孔0.2ml,再分别加入同工艺条件下的广玉兰内酯提取物(A)、番蕃技内酯提取物(B)、本发明提取物(C)(先以DMSO溶解)，使其浓度均为0.5、1.0、2.5、5.0、lO.Opg/ml,每一测试浓度5孔，置37°C、5。/。C02饱和湿度条件下培养72小时，用MTT法在酶联检测仪570nm波长测得吸光(A)值。计算出本发明提取物对各细胞株的抑制率。抑制率=(1-1||^|>100%。结果见表l表1不同浓度本发明提取物对肿瘤细胞和LAK细胞的增值抑制率。/。)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从上表结果可知，各提取物在1.010吗/ml时，对三种癌细胞均具有一定的抑制作用，其中以5pg/ml浓度时最为适宜，再往上梯增浓度对癌细胞的抑制作用贡献不明显，无显著意义。对LAK细胞毒性实验表明，在0.55pig/ml时对LAK细胞不产生抑制作用，在1.0~2.5pg/ml时还有一定的增值作用，在10.0pg/ml时对LAK细胞抑制作用最强。单独用药与联合用药相比，在5.0pg/ml时，其协同增强效果明显，与单独用药相比，差异有显著性(P0.05)。2、体内药理实施例(1)对小鼠S180肉瘤的抑制作用取接种7天后的S180腹水，用生理盐水稀释成1:3的悬液备用，将制备的S180瘤细胞悬液，以0.2mL/只的量接种与小鼠右前肢腋部皮下，24小时后将已接种的小鼠随机分为对照组(A)、广玉兰内酯组(B)、番荔枝内酯组(C)、本发明提取物组(D),各给药组每天给小鼠灌胃给药10mg/kg.(T1，每天给药一次，对照组每天灌胃给予等量的生理盐水，各组连续给药7天。停药后拉颈处死，剥取瘤块称重，按"抑齡=(1-)督感计算抑瘤率。结果见表2表2对小鼠核S180瘤的抑制作用(；士s)Sl^剂量(mg/kg.d")瘤体重量(g)抑瘤率(％)实验结果表明，各治疗组均具有一定的治疗效果，其对小鼠移植性肉瘤S180的抑制率可达到50.00%-68.31%，在等同剂量下(均为10mg/kg.cT1),联合用药组的抑瘤率要明显强于单独用药组，其中联合用药组在相对低剂量下(6mg/kg^1)，即可达到与广玉兰内酯(lOmg/kg.d")或番荔枝内酯(10mg/kg.cT1)相当的效果。说明两药联合在一起使用，在体内对移植性小鼠S180肉瘤的抑制具有协同增强的效果。_1.42±0.67100.71±0.1750.00100.59±0.1359.45100.45±0.1068.3160.63±0.1555.64本发明提取物广玉番蕃匕曰稳酉西内内兰枝权利要求1、一种含有番荔枝的抗肿瘤复方制剂，其特征是由下列配比的原料药组成:番荔枝种子1～4份，广玉兰3～8份。2、一种制备如权利要求1所述复方制剂的方法，其特征是包括如下步骤(1):分别取番荔技种子和广玉兰，粉碎，合并，用石油醚浸泡提取，过滤，去除滤液，滤渣挥干石油醚备用；(2):滤渣用去离子水浸泡提取，过滤，弃水提取液，滤渣备用；(3):滤渣用能与水互溶的有机溶剂系统提取，过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至浸膏状，加适量去离子水分散浸膏，分散液用氯仿或乙酸乙酯萃取至萃取液颜色变淡，合并萃取液，减压浓縮，干燥，即得活性提取物；活性提取物粉碎，加入制药上可接受的辅料，釆用常规的制剂方法制成所需的药剂。3、如权利要求2所述的方法，其中所述的能与水互溶的有机溶剂系统是指甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙酮中的任意一种。4、如权利要求3所述的方法，其中所述的有机溶剂优选乙醇。5、如权利要求4所述的方法，其中所述的乙醇优选75%~95%的乙醇。6、如权利要求1所述的复方制剂，其中所述的制剂主要为口服制剂。7、如权利要求l所述的复方制剂在制备具有抗肿瘤作用和肿瘤辅助治疗作用的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种抗肿瘤的中药复方制剂，由番荔枝和广玉兰组成，分别经过提取各自有效成分后混合即可得到本发明抗肿瘤活性成分部位。经体内外药理学实验证明，本发明组合物具有一定的肿瘤抑制作用，可用于制备抗肿瘤和肿瘤辅助治疗药物。文档编号A61P35/00GK101375936SQ20071012105公开日2009年3月4日申请日期2007年8月29日优先权日2007年8月29日发明者张树祥申请人:北京星昊医药股份有限公司