专利名称：猪用二联疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及猪用二联疫苗及其制备方法，特别是猪口蹄疫(FMD) 和猪呼吸与繁殖障碍综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome) 二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
-口蹄疫作为国际兽医局(OIE)规定的A类动物流行病，是国际公认的对 畜牧业危害最大的动物传染病。因此，口蹄疫疫苗的研究一直受到国内外 的研究人员的高度关注。猪呼吸与繁殖障碍综合征虽是国际兽医局规定的B 类动物流行病，但最近一年来在我国发生了病毒变异，产生了高致病性毒 株，造成大量生猪死亡，重创了我国养猪业,使猪肉价格急剧增长。因此我 国政府最近高度重视该传染病，并与口蹄疫同等看待。目前正在积极开展 猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗的研究。国外对口蹄疫灭活疫苗的生产目前 主要采用悬浮培养技术培养细胞和病毒，其优点在于自动化程度高、质量 稳定性较高。其缺点在于这种培养病毒的方式病毒含量低，必须经过超滤 浓缩才能用于疫苗生产，这极大地限制了疫苗的产量。这种生产仅适用于 疫苗储备和小量免疫需要，不适合我国对口蹄疫免疫的大量需要，并且生 产设备和工艺成本很高，其产品价格使我国政府和用户都难以接受。某研 究所在本领域探索了多年，并在前进口了相应的设备，力图在口蹄疫疫苗 生产中使用，但最终不得不弃用，而仍使用目前的传统方法生产口蹄疫疫 苗。猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活疫苗的研究在国内外都有报道。由于猪 口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征以往在国内外很少同时造成危害，所以这两种疫苗都是单独研究、单独使用，目前国内外均没有将二者制成联苗 的报道。国内目前普遍采用传统的单层细胞培养病毒，其优点是无须国外的超 滤浓缩工艺，其培养的病毒含量就可以达到制备单价疫苗的要求，适合国内的超大规模生产的要求。申请人发明的93114885.5发明专利"口蹄疫疫 苗的生产工艺"，通过浓縮培养病毒使单价疫苗的效力大幅提高，目前在国 内广泛应用(国家科技发明二等奖)。其缺点是其仅适合做单价疫苗，做多 价联合疫苗则仍需进一步浓縮病毒，否则就只有提高使用剂量，这将加大 疫苗的副反应和增加使用难度。如进一步浓縮培养来浓縮病毒，则会遇到培 养基营养不足和细胞新陈代谢造成酸度增加，从而使合成出来的病毒大量 降解，这不但不能达到浓縮的目的，反而使有效病毒含量越来越少。因此 解决病毒培养中的营养问题和酸度问题是超浓縮培养的关键。由于猪口蹄 疫疫苗和猪呼吸与繁殖障碍综合征疫苗目前使用各自不同的佐剂，前者使 用双相佐剂,后者使用单相佐剂并且初步试验表明双相佐剂不适合于后者。 因此寻找对二者通用的佐剂也是该二联疫苗成败的关键。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题，提供一种免疫力高，成本低廉的猪口 蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征二联疫苗，达到一针防两病的目的。 本发明的上述发明目的是通过如下技术方案实现的。 本发明提供一种猪用二联疫苗，其活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和呼 吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者比例为l: 0.6-1.5 (V/V)，优选 为l: 1。根据疫苗毒株效价高低配比，例如口蹄疫病毒规定效价是LDs么1075 LD5。/0.2ml，猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒效价规定为TCID5(^10"LD5o/ml， 当口蹄疫病毒效价达到LD5(^10" LD50/0.2mWt，而猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒效价仍为规定的最底效价TCID5^10" LD50/ml，则二者的配比为l: 1.5。 二者反之也成立。所述二联疫苗还含有佐剂，所述佐剂为单相佐剂为矿物油且选自法国 SEPPIC公司Montanide ISA系列50V佐剂、含5%-10%的司本80和2%-5%的土 温80的杭州炼油厂11号白油或含5%-10%的司本80和2%-5%的土温80的美浮 公司Marcol 52油。所述50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭 活抗原按l: l体积比乳化配制，所述ll号白油或Marcol 52油与混合的猪口 蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2: l体积比乳化配制。本发明进一步提供一种所述的猪用二联疫苗的制备方法，其包括如下 工艺转瓶培养单层细胞，转速为8-12转/小时；单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液，其中所述病毒培养液对口蹄疫病毒为无血清的细胞培养液，对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒为含2%血 清的细胞培养液或完全细胞培养液，使用HEPES或NaHC03调整培养液pH 为7.4±0.2，病毒及培养液的接入量为300-800ml/15L瓶；转瓶中病毒培养液 加入量为300-600ml/15L瓶时，转瓶转速14±2转/小时，避免细胞处于干旱状 态；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒； 将50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭 活抗原按l: l体积比乳化，其中病毒液 11值为7.4±0.2; 11号白油或Marco152 油与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2.0: 1 体积比乳化配制成猪用二联疫苗。 其中种毒接入量为1 5%。其中所述病毒培养液pH值由NaHC03溶液微调至设定值，其中当病毒及 培养液的接入量为300-600ml/15L瓶时，培养液中加HEPES, NaOH ， NaHC03，并用NaHCO3溶液微调至pH7.4士0.2。其中当猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒培养液含血清超过2%时，收获的 病毒液用超滤浓縮器浓縮5-10倍，再用？11值为7.4±0.2的？88稀释回原来体 积。这样可尽可能祛除血清以减少过敏反应。如使用二个型的口蹄疫病毒，其中每个型的猪口蹄疫病毒培养其培养 液接入量为300-600ml/15立升细胞培养瓶，分别培养后将其混合灭活后用于 配制二联灭活疫苗。其中接入种毒和病毒培养液后转瓶转速为14±2转/小时。对口蹄疫部分的细胞培养和病毒繁殖工艺，其中出现细胞致病作用 (Cytopathogenic effect,CPE)后，收获病毒液,置-20。C保存。测定病毒效价， 乳鼠测定1^5^107化050/0.21111，细胞测定TCIDs^1085 TCID50/0.2ml。采用 振动膜除细胞碎片机除去细胞碎片，二乙烯亚胺(BEI)灭活病毒；对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒部分的细胞培养和病毒繁殖工艺，其 中出现细胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE)后，收获病毒液,置-2(TC保 存。测定病毒效价，细胞测定TCID^10"LD5o/ml。采用振动膜除细胞碎片 机除去细胞碎片，二乙烯亚胺(BEI)或甲醛灭活病毒。本发明同现有技术相比具有如下优点本发明所提供的猪口蹄疫和呼吸与繁殖障碍综合征二联灭活疫苗制备 方法不限制使用的病毒株，不同的毒株通过调整病毒培养液的接入量和两 种抗原的配比都可以达到预期效果。而目前的现有技术都严格限制使用的 病毒株。因为毒株的免疫原性不同，对免疫原性不好的毒株唯一可以改变 其免疫效力的办法就是增加抗原含量。由于本方法有效地增加了病毒浓度， 因此可以通过调整配比(二种抗原的配比和抗原与油的配比)解决某些毒 株免疫原性不好的问题；本发明所提供的猪口蹄疫和呼吸与繁殖障碍综合征二联灭活疫苗的制备方法中病毒及其培养液的接入量为300-800ml/瓶(15000ml容积细胞瓶)， 可以比93114885.5发明专利接入量(500ml/瓶)更少。其中对猪呼吸与繁殖 障碍综合征病毒培养液改用细胞培养液，确保了营养充分，特别是采用了 更强的缓冲剂HEPES。因为在培养液很少的情况下普通培养液中的缓冲体 系不能抵抗细胞新陈代谢产生的酸性而使pH迅速下降，pH的下降将会迅速 裂解口蹄疫病毒，对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的繁殖也有很大影响， 而HEPES是很强的缓冲剂，可以解决这一问题；在病毒培养过程中，由于 培养液接入量少，易使细胞"干旱"，对病毒繁殖不利，故增加了转瓶速度， 使细胞有更长的时间接触病毒培养液，从而避免了"干旱"。通过以上改变， 可使病毒繁殖数量较现有方法(93114885.5发明专利)明显提高。发明人做 口蹄疫病毒蛋白电泳分析时发现，采用本发明所提供的口蹄疫疫苗制备方 法培养的病毒，其电泳带较原方法有明显增粗，这说明了病毒数量有明显 增加。而传统的生物学方法对病毒的测定是10倍梯度稀释，加之生物本身 的敏感差异，使得难以稳定测定出病毒数量的变化。本发明所提供的疫苗一改口蹄疫疫苗制备方法的双相佐剂为单相佐 剂，是因为单相佐剂对猪呼吸与繁殖障碍综合征有更好的效力，且不影响 口蹄疫疫苗效力而确定的。在口蹄疫O型上的试验表明，单相佐剂测定免疫 效力成倍地高于双相佐剂，因此可见，单相佐剂的使用可有效减少免疫使 用剂量且对口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征都有良好的效果。同时，本发明所提供的猪口蹄疫和呼吸与繁殖障碍综合征二联灭活疫 苗的制备方法与现有猪口蹄疫和猪呼吸与繁殖障碍综合征的单价灭活疫苗 技术相比，因为超浓縮培养已达到了浓縮目的无须超滤浓縮，所以便于超 大规模生产。制备的二联疫苗可同时防二种疾病。本发明不限制毒株的使 用，不同毒株只须调整病毒培养液接入量和二种抗原之间的配比都可达到 预期的免疫效力。因为本方法有效地增加了病毒浓度，因此可以通过调整配比解决有些毒株免疫原性不好的问题，而总体使用剂量仍然保持单价疫苗的免疫剂量(2ml/头剂)。2ml/头剂完全可达到并超过国家标准(口蹄疫 〉3PDso/头剂，猪呼吸与繁殖障碍综合征保护率4/5以上)。这是因为通过病 毒浓縮有效縮小了免疫剂量，同时高强度的单相佐剂确保了免疫效力。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，这些实施例并非限制 本发明的保护范围，所有基于本发明基本思想的修改和变动都属于本发明 的保护范围。分别制备两种病毒抗原1、对口蹄疫病毒部分的细胞培养和病毒繁殖工艺，其中单价口蹄疫 病毒抗原的培养方法是以传统技术通过转瓶培养单层细胞，转速10转/小时，单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液。其中o型种毒按病毒培养液的1%加入，病毒培养液为无血清细胞培养基，用8.8。/。的NaHC03溶液调整至 pH7.4土0.2。转瓶中病毒培养液加入量为600ml/15立升瓶。转瓶转速12转/小 时。出现细胞致病作用(Cytopathogenic effect，CPE)后，收获病毒液，置-2(TC 保存。测定病毒效价，乳鼠测定LD^10"LD5o/0.2ml，细胞测定1005(^ 108'5 TCID50/0.2ml。采用振动膜除细胞碎片机除去细胞碎片，BEI灭活病毒；其 中双价口蹄疫病毒抗原的培养方法是以传统技术通过转瓶培养单层细胞， 转速10转/小时，单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液。其中A型种毒按 病毒培养液的2%加入，病毒培养液为无血清细胞培养基，含HEPES6g/L， NaOH 0.4g/L， NaHC03 4g/L，用8.8。/。的NaHCO3溶液微调pH至7.4士0.2 。 转瓶中病毒培养液加入量为300ml/15立升瓶，转瓶转速15转/小时。其中亚 洲1型种毒按病毒培养液的3%加入，病毒培养液为无血清细胞培养基，含 HEPES6g/L， NaOH0.4g/L， NaHC03 4g/L，用8.8。/。的NaHC03溶液微调pH 至7.4±0.2 。转瓶中病毒培养液加入量为300ml/15立升瓶，转瓶转速15转/ 小时。当A型口蹄疫病毒和亚洲I型病毒分别出现细胞致病作用(Cytopathogenic effect,CPE)后，分别收获病毒液，置-20。C保存。分别测定病 毒效价，乳鼠测定LD5(ei075 LD50/0.2mI ，细胞测定TCID5(^ 1085 TCID5。/0.2ml。若A型和亚洲I型都达到效价标准，按l: l混合，采用振动膜 除细胞碎片机除去细胞碎片，BEI灭活病毒，即成双价口蹄疫病毒灭活抗原。2、 对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒部分的细胞培养和病毒繁殖工艺， 其中传统技术通过转瓶培养单层细胞，转速10转/小时，单层细胞长满后接 入病毒和病毒培养液。其中种毒按病毒培养液的5%加入，病毒培养液为 含2%血清的细胞培养基，含HEPES 6g/L， NaOH 0.4g/L， NaHC03 4g/L， 用8.8。/。的NaHCO3溶液微调pH至7.4士0.2。转瓶中病毒培养液加入量为 600ml/15立升瓶，提高转瓶转速至12转/小时。出现细胞致病作用 (Cytopathogenic effect,CPE)后，收获病毒液，置-2(TC保存。测定病毒效价， 细胞测定TCID^10"LD5o/ml。采用振动膜除细胞碎片机除去细胞碎片，甲 醛灭活病毒；3、 将按上述方法培养的合格病毒液(两种病毒液分别达到上述测定标 准)分别灭活后混合制备疫苗抗原。二种病毒液混合制备疫苗时，比例为l: 1 (单价口蹄疫病毒抗原与猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒抗原)或l: 1.5 (双 价口蹄疫病毒)。其中病毒液pH值为7.4i0.2。当猪呼吸与繁殖障碍综合征 病毒培养液含血清超过2%时，则收获的病毒液用超滤浓縮5-10倍，再用pH 值为7.4士0.2的PBS稀释回原来体积，这样可尽可能祛除血清以减少过敏反 应。4、 二联疫苗配合单相佐剂采用法国SEPPIC的50V佐剂，与混合抗原 按体积比l: l的比例；11号白油与混合抗原的比例为2.0: 1。采用传统方法(国家标准)进行成品检验1、对口蹄疫的检验方法用体重40kg左右的健康易感架子猪(经乳鼠 中和试验测定无口蹄疫中和抗体)15头，分为3组，每组5头。将待检疫苗 分为1头份、1 / 3头份、1 / 9头份3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后肌肉注射5头猪，接种28日后，连同条件相同的对照猪2头，每头猪耳根 后肌肉注射1000ID5o的猪口蹄疫病毒强毒。连续观察10日。对照猪均应至 少一蹄出现水泡病变。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护。根据免 疫猪的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。每头份疫苗应至 少含3PD5o。2、对猪繁殖与呼吸综合征的检验方法用3-6周龄，猪繁殖与呼吸综 合征病毒抗原、抗体阴性的猪10头，其中5头耳后部肌肉注射疫苗每头2ml， 另5头作为对照，同条件下词养。28日后，所有猪对侧耳后部肌肉注射猪 繁殖与呼吸综合征强毒，每头不少于105TCID5C)，每日测体温并观察21曰。 5头对照猪应全部发病，且至少2头死亡；免疫猪至少4头健活。
权利要求
1.一种猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者体积比为1∶0.6-1.5。
2. 如权利要求l所述的猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，两者体积比为l: 1。
3. 如权利要求1或2所述的猪用二联疫苗，其中所述二联疫苗还含有佐剂，所述佐剂为单相佐剂矿物油。
4. 如权利要求3所述的猪用二联疫苗，其中所述矿物油选自法国 SEPPIC公司Montanide ISA系列50V佐齐!j、含5%-10%的司本80和2%-5%的 土温80的11号白油、含5。/。-10。/。的司本80和2。/。-5。/。的土温80的Marco1 52油。
5. 如权利要求4所述的猪用二联疫苗，其中所述50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l: l体积比乳化 配制，所述ll号白油或Marcol 52油与混合的猪口蹄疫灭活抗原和呼吸与 繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2.0: l体积比乳化配制。
6. —种如权利要求1所述的猪用二联疫苗的制备方法，其包括如下工艺转瓶培养单层细胞，转速为8-12转/小时；单层细胞长满后接入种毒和病毒培养液，加HEPES或NaHC03缓冲系 统调节培养液pH为7.4i0.2，病毒及培养液的接入量为300-800ml/15L瓶；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒； 将50V佐剂与混合的猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征 灭活抗原，按l: l体积比乳化，ll号白油或Marcol 52油与混合的猪口蹄 疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原按l-2.0: l体积比乳化配制成猪用二联疫苗。
7. 根据权利要求5所述的猪用二联疫苗的制备方法，其中种毒接入量 为1 5%，其中用于培养猪口蹄疫病毒时所述病毒培养液为无血清的细 胞培养液和用于培养猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒时所述病毒培养液为 含血清的细胞培养液。
8. 根据权利要求5所述的猪用二联灭活疫苗的制备方法，其中所述 病毒培养液pH值由NaHC03溶液微调至设定值，其中当病毒及培养液的接 入量为300-600ml/15L瓶时，培养液中加HEPES， NaOH ， NaHC03，并 用NaHC03溶液微调pH值。
9. 根据权利要求5所述的猪用二联疫苗的制备方法，其中当猪呼吸与 繁殖障碍综合征病毒培养液含血清超过2%时，收获的病毒液用超滤浓縮 器浓縮5-10倍，再用？11值为7.4±0.2的？88稀释回原来体积。
10. 根据权利要求5所述的猪用二联疫苗的制备方法，其中每个型的 猪口蹄疫病毒其培养液接入量为300-500ml/15立升细胞培养瓶，分别培养 后将其混合灭活后用于配制二联灭活疫苗。
11. 根据权利要求5所述的猪用二联灭活疫苗的制备方法，其中转瓶 中病毒培养液加入量为300-600ml/15L瓶时，提高转瓶转速至14±2转/小 时。
全文摘要
本发明提供一种猪用二联疫苗，其中活性成分为猪口蹄疫灭活抗原和猪呼吸与繁殖障碍综合征灭活抗原，其中两者比例为1∶0.6-1.5。本发明还提供所述猪用二联疫苗的制备方法，其中包括转瓶培养单层细胞，接入种毒和病毒培养液，采用HEPES或NaHCO<sub>3</sub>缓冲系统调节培养液pH为7.4±0.2，病毒及培养液的接入量为300-800ml/15L瓶；出现细胞致病作用后收集病毒液，测定病毒效价后灭活病毒；将50V佐剂与混合灭活抗原按1∶1体积比乳化，11号白油或Marcol 52油与混合的灭活抗原按1-2.0∶1体积比乳化配制成猪用二联疫苗。本发明便于超大规模生产，不限制毒株使用，缩小免疫剂量，同时确保免疫效力。
文档编号A61P31/00GK101332298SQ200710123208
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者薛景山 申请人:薛景山