专利名称：一种用于人外周血来源造血干细胞的培养基的制作方法
一种用于人外周血来源造血干细胞的培养基
技术领域：
本发明涉及一种人外周血来源造血干细胞的培养基，具体来说，本发明提 供了一种对体外釆集的人外周血来源造血干细胞进行短期培养以提高其抗肿瘤 活性的培养基。本发明还涉及一种用于对造血干细胞进行短期培养的培养基。 本发明最后还涉及一种造血干细胞的移植方法，其可显著提高患者的生存能力。
背景技术：
造血干细胞(hematopoietic stem cells , HSC)是一小群具有高度自我复制能 力和多向分化潜能的造血前体细胞。其基本特征是l)高度的自我更新或自我 复制能力；2)可分化生成所有类型的血细胞。正常情况下，造血干细胞通过不 对称性的有丝分裂，不断产生大量祖细胞，造血祖细胞进一步增殖和分化，补 充和维持人体外周血细胞。在造血细胞发育谱系中，造血干细胞的位置处顶端， 具有极其重要的生物学功能。近10多年来，随着外周血干细胞移植治疗的开展， 对造血干细胞的研究日益深入。细胞的增殖分化、发育成熟、迁移定居、衰老 凋亡和癌变等生命科学中的许多基本问题，已成为基础研究的主要热点。
造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)是近几十年 逐步发展起来的一种治疗方法，通过大剂量放化疗或其他免疫抑制预处理，清 除受体体内肿瘤细胞、异常克隆细胞，阻断发病机制，然后把自体或异体造血 干细胞移植给受体，使受体重建正常造血或免疫功能，从而达到治疗目的一种 治疗手段。目前造血干细胞移植是治疗/根治恶性或难治性血液病、遗传性疾病、 免疫性疾病及某些实体瘤的有效方式(参见Paneesha S， Milligan DW. Stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukaemia.Br J Haematol. 2005 Jan; 128(2): 145-52.; Bredeson CN, Pavletic SZ. Considerations when designing a clinical trial of haematopoietic stem cell transplantation for autoimmune disease.BestPract Res Clin Haematol. 2004 Jun;17(2):327-43 )。 1955年Thomas等率先开展人 骨髓移植工作，并获得诺贝尔医学奖，至今已半个世纪，目前，造血干细 胞移植已在国内外广泛用于临床。
常规的造血干细胞移植方法，根据移植供体细胞的来源分为自体造血干细 胞移植(Tomblyn M， Winter JN. Autologous hematopoietic stem cell transplant in first remission in non-Hodgkin's lymphoma. Expert Rev Anticancer Ther. 2003 Jun;3(3):281-94 )和异体造血干细胞移植(Bensiger WI, Clift R , Martin P , et al. Allogeneic peripheral blood stem cell transplantation in patients with advanced hematologic malignancies: aretrospective comparison with marrow transplantation. Blood ， 1996,88:2794-2799.)两大类。理论上异体干细胞移植是较为理想的方 式，但由于存在供体来源有限、配型问题以及移植相关病死率高等问题，其临 床应用受到一定限制。自体干细胞移植相关病死率相对较低,故目前应用较多。 造血干细胞移植根据血液来源的不同区分为骨髓、外周血和脐带血造血干细胞 移植。由于外周血干细胞移植相对于其他来源的干细胞移植具有釆集安全简便、 造血和免疫系统重建快等优点，而且目前观察到的短期疗效令人满意，因此是 目前临床采用较多发展较快的一种方法。
目前现有技术中外周血干细胞移植步骤通常分为以下几大基本步骤
1) 外周血干细胞的动员与釆集；
2) 外周血干细胞的保存、复苏；
3) 外周血干细胞向受体患者体内的回输；
4) 移植后的术后观察。并且根据供体的不同，还可根据需要加入预防患者
移植物抗宿主病的预处理步骤(参见外周血干细胞移植[M],北京: 人民卫生出版社，2000;"异基因外周血干细胞移植治疗恶性血液病" 中华血液学杂志2002年8月第23卷第8期)。 但是现有技术中上述外周血干细胞移植中存在以下缺点
1) 现有技术中，目前还没有一种短期提高造血干细胞抗肿瘤活性的体外培
养方法，以及适合的造血干细胞离体培养基；
2) 传统造血干细胞移植方法中，从体内釆集到造血干细胞后，造血干细胞
通常置于细胞冻存(对自体移植而言冻存，对异体移植而言可不冻存，但均缺乏一个体外迅速提升抗肿瘤活性的激活过程)液中在-196'C液 氮保存，解冻后直接输入受体体内，因而保存后的造血干细胞活性及 数量均有所下降；
3)移植后的造血干细胞对肿瘤细胞等的杀伤能力有限，因此术后效果一 般，其对肿瘤生长的抑制能力有待进一步提高。
发明内容
本发明目的在于弥补现有技术中缺乏造血干细胞离体培养技术的缺陷，提 供了一种效果较好的人外周血来源造血干细胞的培养基，该培养基能显著提高 造血干细胞的抗肿瘤活性。
本发明提供了一种提高了人外周血来源造血干细胞对肿瘤的杀伤能力的培 养基，并对培养后的细胞进行生物学活性检测。将培养后的外周血来源造血干 细胞收集、洗涤后，回输给肿瘤患者，可以发现患者食欲增加，睡眠和体力状 况改善，卡式评分指标提高，个别有水肿、行动障碍的患者，在治疗后症状明 显好转。这表明将该细胞回输到体内后，能提高免疫力，起到治疗肿瘤的目的。
本发明的上述培养基中所用的培养基命名为IN - VITR03,含有Iscobe改良 的Dulbecco基本培养基(IMDM) 1000亳升、0.1-10吗/ml的脂肪酸、1.5吗/ml 的胆固醇、5-20fig/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢钠或 HEPES,培养基的pH值为7.0。
以1000亳升为依据，营养因子为胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、NaH2CO3、 谷氨酰胺。营养因子的使用量为常规量即可，这些组分在培养基中的使用量属 于公知常识。本发明的发明点在于上述组分的组合，发明人经过了多种的试验， 发现上述的组合效果非常好。
具体而言，本发明涉及如下内容
本发明提供了一种提高人外周血来源造血干细胞对肿瘤的杀伤能力的方 法，该方法包括首先对外周血来源的造血干细胞进行动员和釆集；然后将釆集 到的外周血来源造血干细胞进行体外短期活化培养，并对培养后的细胞进行生 物学活性检测；将培养后的外周血来源造血干细胞收集、洗涤后进行回输。
本发明还提供了一种体外短期活化培养造血干细胞的方法，该方法为将新鲜釆集的外周血来源造血干细胞经生理盐水洗涤后，用无菌PBS对倍稀释，即
比例为l: l的稀释；用Ficoll分离液去除红细胞，离心分离目的造血干细胞，离 心条件为1800rpm, 20min;用PBS洗涤造血干细胞两遍，1400rpm, 15min 离心；台盼蓝拒染法计数标本，加入含有rhlL-2 100- 5000 U/mL和IFN-y 100-5000U/mL的无血清培养基并调整细胞浓度为5xlO6/mL,置于培养箱中培养，培 养条件为37'C, 5%C02;培养活化3 4h后收集细胞，并进行生物活性检测。
如上文所述的培养基，其中所述的培养基的具体成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) IOOO毫升、0.1-10吗/ml的脂肪酸、1.5吗/ml的胆 固醇、5-20昭/ml的甘油酯、300fig/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES, 培养基的pH值为7.0。
以1000亳升为依据，上述培养基还可以添加的营养因子为胰岛素、2-巯基 乙醇、丙酮酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。可以按照常规使用量添加。 一种釆用上文所述方法短期活化培养得到的造血干细胞。 如上文所述的造血干细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。 如上文所述的应用，其中所述的肿瘤为淋巴瘤、肺癌、结肠癌或乳腺癌。
图l:外周血来源造血干细胞釆集、培养前后的表型特点； 图2:外周血来源造血干细胞培养前后形成的粒单细胞集落形态(A.活化 前；B.活化后)；
图3:不同效靶比下外周血来源造血干细胞培养前后对多种实体肿瘤的杀伤 活性；
图4:釆用本发明培养基及培养方法培养得到的细胞集落培养前4- 1，培养后 4-2。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 如下实施例仅为说明本发明人外周血来源的造血干细胞的活化培养方法，不是为限制本发明的保护范围。如下实施例中所用的化学试剂、细胞因子和实
验用的肿瘤细胞系，如无特别说明均购于GIBICO公司；如下实施例中所涉及到
的检测，及评价方法均为本领域技术人员公知的检测、评价方法。 实施例l
外周血来源造血干细胞的釆集
如下实施例仅为说明本发明人外周血来源的造血干细胞的活化培养方法， 不是为限制本发明的保护范围。如下实施例中所用的化学试剂、细胞因子和实
验用的肿瘤细胞系，如无特别说明均购于GIBICO公司；如下实施例中所涉及到 的检测，及评价方法均为本领域技术人员公知的检测、评价方法。
实施例2
外周血来源造血干细胞的体外短期培养活化。 实施例2-1
将新鲜采集的外周血来源造血干细胞标本经生理盐水洗涤后，用无菌PBS 对倍稀释。用Ficoll分离液去除红细胞，离心分离目的造血干细胞，离心条件为 1800rpm, 20min。用PBS洗涤造血干细胞两遍，1400rpm, 15min离心。台盼蓝 拒染法计数标本，加入含有rhlL-2 5000U/mL和IFN-y 1000U/mL的无血清培养基 并调整细胞浓度为5xl06/mL,置于培养箱中培养，培养条件为37。C, 5%C02; 培养活化3后收集细胞，进行生物活性检测。
其中培养所用的培养基成分为lOOO亳升含有Iscobe改良的Dulbecco基本 培养基(IMDM)、 10吗/ml的脂肪酸、1.5昭/ml的胆固醇、5(ag/ml的甘油酯、 300吗/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES,培养基的pH值为7.0。
实施例2-2
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为IOOO毫升含有 Iscobe改良的Dulbecco基本培养基(IMDM)、 0.1昭/ml的脂肪酸、1.5昭/ml的胆 固醇、20)ag/ml的甘油酯、300昭/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES， 培养基的pH值为7.0。
实施例2-3
将新鲜釆集的外周血来源造血干细胞标本经生理盐水洗涤后，用无菌PBS对倍稀释。用Ficoll分离液去除红细胞，离心分离目的造血干细胞，离心条件为 1800rpm， 20min。用PBS洗涤造血干细胞两遍，1400rpm,15min离心。台盼 蓝拒染法计数标本，加入含有rhlL-2 100U/mL和IFN-y5000U/mL的无血清培养基 并调整细胞浓度为5xl06/mL,置于培养箱中培养，培养条件为37。C， 5%C02; 培养活化4h后收集细胞，进行生物活性检测。
其中培养所用的培养基成分为lOOO毫升含有Iscobe改良的Dulbecco基本 培养基(IMDM)、 5吗/ml的脂肪酸、1.5吗/ml的胆固醇、10昭/ml的甘油酯、 300(ig/ml的转铁蛋白。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES,培养基的pH值为7.0。
实施例2-4
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) IOOO亳升、0.1-10吗/ml的脂肪酸、1.5吗/ml的胆 固醇、5-20iag/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白、胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮 酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES，培养基的pH值为 7.0。
实施例2-5
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) IOOO亳升、0.1-10吗/ml的脂肪酸、1.5吗/ml的胆 固醇、5-20(ig/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白、胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮 酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES,培养基的pH值为 7.0。
实施例2-6
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) IOOO毫升、0.1-10吗/ml的脂肪酸、1.5)ng/ml的胆 固醇、5-20iag/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白、胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮 酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES，培养基的pH值为 7.0。
实施例2-7
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) IOOO毫升、0.1-10fig/ml的脂肪酸、1.5吗/ml的胆固醇、SJ0iug/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白、胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮 酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES，培养基的pH值为 7.0。
实施例2-8
方法如实施例2-l所述，其中培养所用的培养基成分为含有Iscobe改良的 Dulbecco基本培养基(IMDM) 1000亳升、0.1-10iug/ml的脂肪酸、1.5iug/ml的胆 固醇、5-20呢/ml的甘油酯、300吗/ml的转铁蛋白、胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮 酸钠、NaH2C03、谷氨酰胺。缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES,培养基的pH值为 7.0。
实施例3
经培养后的外周血来源造血干细胞的生物活性的检测 3.1 表型检测
釆用常规的直接免疫荧光法结合流式细胞仪分别测定培养前后外周血来源 造血干细胞中003+ CD 4+、 CD3 +CD 8+、 CD3-CD 56+ CD 16+、 CD8 +CD 28+、 CD45RO+CD8+、 CD4+CD25+、 CD25+、 CD69+的表达。取3 x 106细胞,1400 转/分，离心5分钟。弃上清，以PBS洗涤两次，同上离心将细胞悬于0.5mlPBS中， 计数将细胞移入U型96孔板中，每孔细胞数为不少于5x 105个，分别加入荧光抗 体轻轻混匀，4°C、避光孵育30-60分钟。1000转/分，离心5分钟，弃上清。各加 入200jul PBS洗涤两遍，1000转/分，离心5分钟。每孔加入100jil 1%多聚甲醛 重悬细胞并固定。上机分析前30min，每管准确加入100ulFlow-Count荧光微球， 轻轻混匀，避光。吸取细胞至流式细胞仪检测管，并加适量PBS (0.5-lml),重 悬细胞后上机检测。
经培养活化后的造血干细胞结果如图l所示。该结果说明短期活化不会影响 外周造血干细胞中各种主要细胞亚群的分布和比例，而是大大增加了T和NK细 胞的比例，为抗肿瘤杀伤活性的升高提供有力的细胞学基础。
3.2克隆形成能力检测
采用常规的半固体琼脂糖法测定培养前后外周血来源造血干细胞中 GM-CFU的数量。CFU-GM每亳升培养体系含集落刺激因子为GM-CSF50ng 、rlL-3 5ng。以上每毫升分别含有20。/。FCS、 10。/。人AB血清(ABS )、 1%FVBSA、 2-巯基乙醇5x 10-5mol/L、 0.9%甲基纤维素或0.3%的软琼脂，每亳升体系加入2 xl05单个核细胞，置35mm培养皿，在37。C饱和湿度二氧化碳孵箱培养14天， 用倒置显微镜下计数集落，CFU-GM》40个细胞为1个集落单位，用半固体软琼 脂法所形成的集落，可用快速血球染色液直接染色，观察其细胞集落的形态和 种类。
检测结果如图2所示。该结果说明短期活化不会影响外周造血干细胞中干细 胞的数量和功能。
实施例4
活化前后的造血干细胞的杀伤活性测定与比较
采用常规LDH法测定培养前后外周血来源造血干细胞在不同效乾比下对淋 巴瘤raji细胞、肺癌95D细胞、结肠癌HCT-8和乳腺癌MCF-7 (商购于ATCC,美 国典型物保藏中心,又称美国模式典型物收集中心)的杀伤活性。方法简述如下 分别收集活化前后外周血来源造血干细胞作为不同效应细胞，用1640培养液洗 涤2遍，计数，调整细胞浓度至4 x 106/ml。收集乾细胞raji、 95D、 HCT-8和MCF-7， 洗涤计数，调整细胞浓度至l x 105/ml。每种效应细胞做3个复孔，每孔100jul， 加入96孔U型板中，并按照效靶比40: 1、 20: 1、 10: l加入靶细胞，同时设靶 细胞最大释放，自然释放，培养液空白对照和体积纠正对照，200nl/孔，每组3 个复孔，离心250g4分钟，37°C 5。/。C02孵箱培养6小时，在培养结東前45分钟， 取出96孔板，在靶细胞最大释放组和体积纠正对照组每孔加入lysis buffer 20 pl， 离心250g4分钟，继续培养45分钟后取出，每孔吸出50ial上清转移入另一96孔 板，毎孔加底物溶液50m1,避光室温孵育15分钟，加入50pl终止液，用振荡器 将色素颗粒打散，测波长490nm处的吸光度，按下列公式
CTL活性(％)=(实验组-效应细胞自然释放组-靶细胞自然释放组)/ (乾 细胞最大释放组-体积纠正对照组-靶细胞自然释放组)x 100%
以培养液对照组作为空白对照校正各孔吸光度。
实验结果如图3所示，该结果表明无论是在效靶比40: l还是20: l的情况下， 釆集的造血干细胞经本发明所述方法培养活化后，其抑瘤效果均有显著增加。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是 显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基本上所做的这些修改或改进，均 属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1、一种提高人外周血来源造血干细胞对肿瘤的杀伤能力的培养基，其特征在于其中所述的培养基的具体成分为含有Iscobe改良的Dulbecco基本培养基(IMDM)1000毫升、0.1-10μg/ml的脂肪酸、1.5μg/ml的胆固醇、5-20μg/ml的甘油酯、300μg/ml的转铁蛋白，缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES，培养基的pH值为7.0；其中以1000毫升培养基为依据，加入的营养因子为胰岛素、2-巯基乙醇、丙酮酸钠、NaH2CO3、谷氨酰胺。
2、 一种如用权利要求l所述培养基短期活化培养得到的造血干细胞。
3、 如权利要求2所述的造血干细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。
4、 如权利要求3所述的应用，其中所述的肿瘤为淋巴瘤、肺癌、结 肠癌或乳腺癌。
全文摘要
本发明涉及一种人外周血来源造血干细胞的培养基，具体来说，本发明提供了一种对体外采集的人外周血来源造血干细胞进行短期培养以提高其抗肿瘤活性的培养基。本发明提高人外周血来源造血干细胞对肿瘤的杀伤能力的培养基，其特征在于其中所述的培养基的具体成分为含有Iscobe改良的Dulbecco基本培养基(IMDM)1000毫升、0.1-10μg/ml的脂肪酸、1.5μg/ml的胆固醇、5-20μg/ml的甘油酯、300μg/ml的转铁蛋白，缓冲溶液是碳酸氢钠或HEPES，培养基的pH值为7.0。
文档编号A61P35/00GK101429496SQ20071016628
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者于津浦, 任秀宝, 水 曹, 慧 李, 郝希山 申请人:天津市肿瘤医院