一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂及其制备方法

专利名称：：一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明属中药领域，涉及一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂及其制备方法。
背景技术：
：骨质疏松症是由于全身骨质及骨组织的微细结构的改变。致使骨强度减弱、骨脆性增加，极易发生骨折的系统性多病因骨骼疾病。研究表明，美国、欧洲和日本大约有7500万人受累，其中1/3为绝经后的妇女；国内情况亦不容乐观，6069岁老年妇女骨质疏松发生率高达50%70%，老年男性发生率为30%左右。随着社会人口老龄化，骨质疏松的发生率还会继续增加，由此而给家庭和社会带来沉重的负担。中药通过补肾、健脾等方法，在治疗骨质疏松症方面具有较好的疗效。从已上市和报道中尚在研制过程的中药制剂来看，多为中药复方粗提物，一般服用剂量较大，临床服药依从性较差，特别对需要长期服用的骨质疏松患者。即使有个别制剂经现代提取、纯化技术，使服用量大为减少，但多为单味药，无法体现中药配伍使用所产生的协同增效、减毒等优势。因此针对抗骨质疏松症有效的中药复方，从有效部位层面，通过适当的提取方法和技术，尽可能多地提取和保留其中地有效成分，以保证中药复方的药效，是中药(复方)提高疗效，较少服用量，增加技术含量的一种可行方法。
发明内容本发明的目的是提供一种具有补肾益精作用，用于骨质疏松症治疗的一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂。本发明的进一步目的是提供上述中药复方制剂的制备方法，更具体的涉及所述的中药复方中的有效部位及其制备方法。本发明根据中医学的"肾藏精，骨髓之气也"，"肾主骨"即肾具有藏精生髓，滋养骨骼之作用理论，釆用中药材淫羊藿、黄芪、制何首乌、骨碎补、枸杞，制成治疗骨质疏松症的复方制剂。本发明复方制剂是由下列重量份的原料药组分制成的淫羊藿2份，黄芪1.5份，制何首乌l份，骨碎补l份，枸杞子l份方中的淫羊藿辛甘温，入肝肾经，补肾壮阳，坚筋强骨；首乌《纲目》谓"此物气温味苦涩，苦补肾，温补肝，能收敛精气，所以能养血益肝，固精益肾,健筋骨，不温不燥，与淫羊藿偏重补阳相配，阴得阳以生，阳得阴以长，使阴阳平和；黄芪甘'微温，为益气要药，黄芪益气偏重肌表，故由益气而荣筋骨，生肌肉；骨碎补兼有补肾活血两重功效，治肾虚腰痛极为合宜，既佐诸益肾之品，益肾而阴阳兼顾，又佐黄芪行动气血，便于药到病所；枸杞子味甘性平，补肾益精，滋阴之功胜于助阳，配以首乌、黄芪以达平补阴阳、补精益气的功效。本发明更具体的通过采用大孔吸附树脂、超滤等分离纯化技术，提取纯化上述复方制剂中的总多糖和总黄酮部位为有效部位，按下述方法制备治疗骨质疏松症的中药复方制剂。所述的总多糖其截留分子量为〈1万和15万。所述的有效部位通过下述步骤制备上述重量份的原料药，加水10倍，浸泡30分钟,第一次煎煮1小时，第二次加水10倍，煎煮1小时，过200目网，合并提取液，管式分离机离心(16000r/min)，取上清夜，减压浓縮至提取液lml含lg生药。加入95%的乙醇醇沉两次(含醇量为80%)，得沉淀部分和醇溶部分；所述的沉淀部分加水稀释至30%(以药材量计)，用超滤机过1万和5万截留分子量的超滤膜，得〈1万多糖部位，15万多糖部位，减压浓縮、干燥即得总多糖部位；醇溶部分经减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至lml含lg生药材，采用DM301大孔吸附树脂(径高比为l:10)，以0.25BV/h速度上样(湿树脂投量与生药比为2:1)，分别用310倍(与湿树脂量相比)蒸馏水洗和310倍量(与湿树脂量相比)10%乙醇洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮(洗脱容剂用量与生药比为10:1，吸脱速度为lml/min(相当于2.3BV/h))，收集吸脱液，减压回收乙醇，减压浓縮、干燥即得总黄酮部位。上述的<1万多糖部位，15万多糖部位和总黄酮部位提取物经粉碎，加入适量淀粉，混匀，装入胶囊即得本发明的复方制剂。5经对上述有效部位一总黄酮和截留分子量〈1万多糖和截留分子量15万多糖的含药血清的体外实验，结果显示，所述的有效部位对体外培养的成骨细胞增殖率有明显的促进作用。图l是本发明中总黄酮、淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的泄漏曲线。图2是本发明中总黄酮、淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷洗脱曲线，其中，A—总黄酮B—淫羊藿苷C一二苯乙烯苷D—柚皮苷；总黄酮洗脱曲线容量瓶编号说明1、2—水洗脱液(50ml);3、4、5、6—水洗脱液(25ml);7、8、9、10—10%醇洗脱液(25ml);11、12、13、14一70%醇洗脱液(25ml);15、16、17、18—90%醇洗脱液(25ml);19、20、21—95%醇洗脱液(25ml);淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷容量瓶编号说明1、2、3、4一水洗脱液(50ml);5、6、7、8—10%醇洗脱液(25ml);9、10、11、12—70X醇洗脱液(25ml);13、14、15、16—90X醇洗脱液(25ml);17、18、19、20—95%醇洗脱液(25ml)。图3是本发明不同提取部位的含药血清对成骨细胞增殖率的影响。具体实施例方式实施例1提取纯化工艺按所述重量份配比取各原料药，加水10倍，浸泡30分钟,第一次煎煮1小时，第二次加水10倍，煎煮1小时，过200目网，合并提取液，管式分离机离心(16000r/min)，取上清夜，减压浓縮至提取液lml含lg生药，加入95%的乙醇醇沉两次(含醇量为80%)，得沉淀部分和醇溶部分；沉淀部分加水稀释至30%(以药材量计)，用板框式超滤机过1万和5万截留分子量的超滤膜，得<1万部位，15万部位和〉5万部位，减压浓縮、干燥即得多糖不同部位的干燥物；醇溶部分经减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至lml含lg生药材。选用DM301大孔吸附树脂，以0.258￥/11速度上样，分别用10倍(与湿树脂量相比)蒸馏水洗和10倍量(与湿树脂量相比)10%乙醇洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮(湿树脂投量与生药比为2:1，洗脱容剂用量与生药比为10:1，径高比为l:10，吸脱速度为lml/min(相当于2.38￥/11))，收集吸脱液，减压回收乙醇，减压浓缩、干燥即得总黄酮部位提取物。实施例2建立测定总多糖含量的方法1)仪器和试剂UV_240紫外分光光度计(岛津)，无水葡萄糖(含量测定用，购于中国药品生物制品鉴定所，批号110833—200302)，蒽酮(CP)。2)配制标准溶液和显色剂葡萄糖标准溶液精密称取105'C恒重的无水葡萄糖22mg，置于25ml容量瓶中，加蒸馏水并稀释至刻度，摇匀即得C-0.88mg/ml的标准品溶液。0.2%蒽酮显色剂称取蒽酮0.2g，置于100ml容量瓶中，加入浓硫酸溶解并稀释至刻度，临用时新配。3)选择最大吸收波长精密吸取上述制得的标准品溶液O.lml于试管中，补加蒸馏水0.9ml至l.Oml;精密加入0.2%蒽酮显色剂3.01111，摇匀，放置至室温后，以蒸馏水1.0ml加显色剂3.0ml为空白，于500700nm波长范围进行吸收光谱扫描，结果显示在625nm处有最大吸收，溶液呈蓝绿色。表明本发明总多糖加入0.2%蒽醌浓硫酸溶液显色后，在625nm处有最大吸收峰。4)制备标准曲线精密吸取标准溶液0.15，0.25，0.50，0.75，1.00和L20ml，分别置于10ml容量瓶中，加水稀释至刻度。分别得0.0132，0.022,0.044，0.066，0.088，0.1056mg/ml标准品溶液；另取O0.0132mg/ml的标准品溶液5ml，置于10ml容量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，得C-0.0066mg/ml。分别取上述7种浓度的标准品溶液lml于试管中，精密加入0.2%的蒽酮显色剂3.01111，摇匀，放置至室温后，在625nm处测定吸收度，并以蒸馏水l.Oml加显色剂3.0ml为空白对照，得回归方程为Y=0.0112x+0.0898，r=0.9949，线性范围为6.6105.6ug/ml。表.l是制备的标准曲线。表.l标准品浓度(wg/ml)吸光度(A)105.61.258881.066660.837440.608220.41713.20.1976.60.1175)精密度试验精密量取标准品溶液(C=0.0352mg/ml)lml，共6份，按照标准曲线项下自精密加入0.2%的蒽酮显色剂起，测定其吸光度，结果显示其平均吸光度为0.437，RSD为1.98%。表2是精密度试验结果。表2试验号123456平均值(A)RSD(%)测定值0.4380.4480.4420.4350.4220.4370.4371.986)重复性试验精密量取同一样品溶液lml，共6份，按照标准曲线项下自精密加入0.2%的蒽酮显色剂起，测定其吸光度。结果显示其平均吸光度为0.4836，RSD为3.08%。表3是重复性试验结果。表3_试验号123456平均值(A)RSD(%)测定值0.4990.4940.4940.4660.4650.4840.4843.087)不同截留分子量多糖的含量测定精密量取不同截留分子量分段的多糖溶液，经稀释定容后，取样品溶液lml，精密加入0.2X的蒽酮显色剂3.0ml，摇匀，于加入硫酸开始计时，在30min后测定其吸光度，测定波长为625nm。实施例3建立总黄酮测定方法1.)仪器和试剂UV—240紫外分光光度计(岛津)，淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所，批号0737—9910)。82.)配制标准溶液和显色剂淫羊藿苷对照品溶液精密称取淫羊藿苷对照品1.4mg，置于10ml容量瓶中，加60%乙醇稀释并定容至刻度，摇匀即得C-0.14mg/ml的标准品溶液。3.)选择最大吸收波长分别制作淫羊藿苷为对照品和本发明黄酮部分纯化前后的UV吸收光谱扫描图，淫羊藿苷对照品和所述总黄酮样品的吸收光谱比较结果显示，它们在270nm处均有一吸收峰，经大孔吸附树脂纯化后吸收峰更大，说明大孔吸附树脂富集了黄酮类成分，这与黄酮类成分的一般紫外吸收特征相符，本发明采用以淫羊藿苷为对照品，在270nm处测定其紫外吸收度，用以测定总黄酮的含量。4.)制备标准曲线精密称取1.4mg淫羊藿苷标准对照品，置于10ml容量瓶中，加60%乙醇稀释并定容至刻度，摇匀即得C=0.14mg/ml的标准品溶液，分别精密吸取lml置于10ml容量瓶中，lml置于5ml容量瓶中，2ml置于5ml容量瓶中得浓度为0.014、0.028、0.056mg/ml标准品溶液；再分别取C=0.014mg/ml的标准品溶液lml置于5ml容量瓶中，2ml置于5ml容量瓶中，加入60%乙醇定容后，得浓度为0.0028、0.0056mg/ml标准品溶液；再取C=0.056mg/ml的标准品溶液2ml，置于5ml的容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度，得C-0.02246mg/ml的标准品溶液；分别取上述6种浓度的标准品溶液，在270nm处测定吸收度，并以60%的乙醇为空白对照，得回归方程为Y=38.456x+0.0172，r=0.9997，线性范围为0.00280.056mg/ml。表4是制备的标准曲线。表4标准品浓度(mg/ml)吸光度(A)0.00280.1100.00560.2350.0140.5600.0224O.卯l0.0281.1200.0562.149)根据上述的测定条件，分别对样品进行适当稀释后，在波长为270nm处测定总黄酮提取物及大孔吸附树脂纯化样品中总黄酮的含量。9实施例4大孔吸附树脂选型试验1)试验仪器、材料与试剂UV—240紫外分光光度计(岛津)，HP1100高效液相色谱仪，电子天平，真空干燥箱；淫羊藿苷、二苯乙烯苷、柚皮苷对照品(购自中国药品生物制品检定所)，型号为DIOI、DA201、DM301精品级树脂(购自于天津市海光化工有限公司)，95%医用乙醇；本复方制剂水提液(lml含1克药材)即母液，按常规方法醇沉2次(加95%乙醇至含醇量达80%)，合并醇溶液，浓縮至lml相当于lg药材，经含量测定，其总黄酮的含量为17.56mg/ml。2)树脂预处理按现有技术((潘见，陈强，谢慧明，等.农业工程学报，1999，15(1):236-240)，分析方法参照现有技术(总黄酮含量测定一以淫羊藿苷为标准对照品；淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷HPLC含量测定；史万忠，朱兰，徐德生，等.中草药，2000，31(5):341;史万忠，黄利红，徐德生，等.中药新药与临床药理，2001，12(5):359;史万忠，徐德生，孔德云，等.时珍国医国药，2000，11(6):500)。3)测定静态参数以树脂质量为单位测定吸附量称取经预处理的树脂各3份，各2.5g置lOOmL的容量瓶中，精密加入本发明样品液25mL于电动振荡机上振荡，频率为120r*min-l，振荡20h充分吸附后，滤过，测定剩余总黄酮的浓度，按下式计算各树脂在室温下的吸附量(mg'g-l)。Q=(Cl-C2)XV/W式中Q为吸附量(mg'g-l);Cl为起始浓度(mg'mL-l);C2为剩余浓度(mg.mL-l);V为溶液体积(mL);W为树脂重量(g)。另外随行准确称取预处理的树脂各lg，分别置于已记录质量的干燥瓶中，IOO'C烘至恒重，得出每克含水树脂相当于干树脂的质量，结果显示，以总黄酮和淫羊藿苷为指标，3种吸附树脂的吸附量DM301〉D101〉DA201;以二苯乙烯苷和柚皮苷为指标，则DM301>DA201>D101，其中DM301对3种指标成分的200710172985.6吸附量和吸附率最大。3种大孔吸附树脂中以DM301质量系数最大，推测其强度大于其他2种，不易破碎而进入药物。表5是3种大孔吸附树脂对本发明指标成分的吸附效果比较。表6是3种含水树脂与干树脂质量换算系数表5指标成分D101DA201DM301吸附量/mg吸附率/Q/o吸附量/mg吸附率/%吸附量/mg吸附率/%总黄酮64.7019.9959.2216.3381.1821.81淫羊藿苷18.4329.2912.2819.5221.6334.38二苯乙烯苷8.1414.2211.3019.7417.5630.68柚皮苷1.578.773.1817.763.7020.64其中母液为lml相当于lg生药量表6树脂型号每克含水树脂相当于干树脂质量系数D1010.2548DA2010.2213DM3010.28254)树脂解吸附率的测定取按照3)的方法吸附饱和的树脂各3份，分别加入50%、70%和90%的乙醇各50mL，浸泡振荡24小时，滤过，测定滤液中总黄酮及淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的浓度，并计算解吸率(％)，结果表明，DM301型树脂对总黄酮、淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷均有较好的解吸附作用，洗脱浓度以70%或90%的乙醇浓度为宜。表7是3种大孔吸附树脂对本发明指标成分的解吸率比较。表7指标成分D101DA201DM30150%70%90%50%70%鄉50%70%卯％总黄酮72.6385.9285.0787.5789.4397.8287.90卯.9198.91淫羊藿苷62.9181.4488.9395.1495.51100.0289.2983.8591.16二苯乙烯苷51.7068.5666.8092.38卯.7588.7197.1191.7783.34柚皮苷75.3191.5888.9252.5164.0253.9779.6576.9168.34其中母液为lml相当于lg的生药量5)静态吸附动力学曲线的测定实验方法同3)，在25'C时，当母液总黄酮含量为17.56mg/ml时，树脂用量11为2g，加入母液量为40ml时，用静态吸附法测定DM301树脂对母液中总黄酮类化合物的吸附速率，以吸附树脂与母液接触时为0时刻，每隔一定时间取样0.5ml，测定其中总黄酮的含量，计算此时树脂的吸附量，以时刻t对树脂的吸附率作图，得静态吸附速率曲线。结果显示，以吸附7小时时的吸附量为100%，则在0.5小时时，其吸附量仅为61%;吸附时间在4小时以上时，其吸附量基本接近，4小时的吸附量为7小时的96%。确定以4小时为保证样品充分吸附的时间，上样的速度以此确定为0,25BV/h。表8不同取样时间点的大孔吸附树脂吸附率。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中吸附率以湿树脂计实施例5有效部位总黄酮纯化工艺的试验研究1)泄漏曲线根据静态吸附参数，评价并选择适合该复方总黄酮纯化的DM301吸附树脂，称取湿树脂23g装柱(1.5cmX15cm,柱体积为26ml)，精密吸取本发明样品液60mL(lg生药/ml)上柱，控制流速，O.lOmLmin-l(相当于0.25BV/h)流过树脂柱，定量收集流出液，测定样品液和过柱液总黄酮浓度及淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的含量，以发生泄漏过程中上样量(体积)为横坐标，以流出液中指标成分的浓度与本发明样品液浓度的比值为纵坐标，作DM301泄漏曲线，以淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷为评价指标，其泄漏约出现在20ml时(上样量:湿树脂为20/23=0.87时，开始出现泄漏)；而以总黄酮为指标，其泄漏出现在10ml左右(此时的上样量湿树脂约为0.5)，表明总黄酮指标的敏感程度强于淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷指标。2)解吸曲线根据静态解吸附实验结果，采用70%和90%的乙醇为洗脱液，进行解吸曲线制备。取DM301湿树脂10g，湿法装柱(柱直径1.5cm，柱高约7cm)，精密吸取本发明样品液10mL上柱，然后分别用蒸馏水200mL，10%乙醇、70%乙醇、90X乙醇和95X乙醇各100mL梯度洗脱，洗脱液流速为0.5mLmin-l,蒸馏水洗脱液收集50mL4份，10%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和95%乙醇洗脱液分别收集25mL4份。分别测定各个洗脱液段的总黄酮、淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的含量(图2)。根据上述的洗脱曲线，采用以10倍量(与湿树脂量相比)的蒸馏水和10倍量10%乙醇(与湿树脂量相比)洗脱除去杂质。3)DM301吸附树脂纯化总黄酮的条件优化正交试验设计根据黄酮的理化性质与大孔吸附树脂的吸附特点，考察药物上柱量、柱子的径高比、洗脱溶剂的用量、洗脱速度4个因素，并结合预试验结果选择了3水平设计试验方案。表9是各因素及水平设计表。表9ABCD水平树脂量上样量径高比洗脱溶剂用量洗脱速度/g:g直径高度/mL:上样量/mLtnin-112:11:55:10.521:11:1010:11.030.5:11:2020:11.5采用1.5cmX50cm的分析柱，根据因素水平表，以L9(3,正交表安排实验，每次试验精密取一定量的本发明样品液上柱，用固定的10倍量(与湿树脂量相比)蒸馏水和10倍量(与湿树脂量相比)10%乙醇洗去杂质，然后用70%的乙醇洗脱本发明总黄酮，收集70%的洗脱液，减压浓縮至一定量，并定容。定量量取部分样品液，测定其中的总黄酮、淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的含量，其余样品再减压浓縮和干燥至恒重，得棕黄色粉末。分别计算得率和纯度。以总黄酮得率和纯度及淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷得率总和及纯度总和为指标，评价并确定最佳工艺条件。表10是以总黄酮含量及纯度为指标，正交实验结果及方差分析。表11是以总含量(淫羊藿苷+二苯乙烯苷+柚皮苷)和纯度为指标正交实验结果及方差分析。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表ll因素ABCD总含量(％)纯度(％)l11118.096134.4832212229.572338.760931338.571842.0365试421237.581741.3222验2218.143643.86506318.157140,741531326.626345.0903816.661343.1578933215.518345.1676I26.240122.304122.914521.75801123.882524.377222.672324.3557G=68.9285>E、III18.805922.247223.341722.8148含CT=G2/9=527.9047量R7.43422.13000.66952.5977SJ=(K12+K22+K32)/3-CTS9.62190.98200.07661.1377P<0.05—_——_I115.2806120.8956118.3825123.5158II125.9286125.7837125.2507124.5926G=374.6249纯III133.4157127.9456130.9918126.5165CT=G2/9=15593.7591度R18.13517.049912.60933.0006SJ=(K12+K22+K32)/3-CTS55.36858.696526.56981.5405P<0.05—一______结果显示，从总黄酮得率及纯度来看，因素A(湿树脂量上样量)对总黄酮得率有显著性影响(P<0.05)，且3个水平中树脂量上样量为2:l时最佳，因此选用l水平；而因素C(洗脱溶剂用量)对纯度影响显著(P<0.05)，且第2水平最佳，因此选用IO倍量；因素B(径高比)对总黄酮含量和纯度均不显著，考滤到洗脱溶剂用量太大，加大后续的浓縮的工作量，因此B因素选用2水平;因素D(洗脱速度)对总黄酮含量和纯度影响也不显著，考滤到洗脱速度大可縮短洗脱时间，便于大样的实际操作，因此因素D(洗脱速度)选用2水平。确定最优化的大孔吸附树脂的纯化条件为A1B2C2D2。总含量(淫羊藿苷+二苯乙烯苷+柚皮苷)和纯度的正交结果与总黄酮相似。本发明确定的总黄酮的大孔吸附树脂的分离纯化工艺参数为优选的上样量为湿树脂量/上样量=2:1(相当于0.5BV)，上样速度为0.25BV/h，径高比(1:10)，洗脱溶剂用量10:1,洗脱速度lml/min(相当于2.5BV/h)。4)正交重复实验根据上述的正交实验结果，采用优化的纯化工艺参数，进行正交重复实验，结果显示，采用上述工艺，可使总黄酮和总含量的提取率较大，同时保证纯化物中总黄酮的纯度达50%以上。所述三个指标成分在纯化物中的比例为淫羊藿苷-二苯乙烯苷柚皮苷=3.32:5.63:1.00;总黄酮纯化物的得率为2.25%(以投料药材计)。表12是正交重复实验结果。表12指标测定值(mg/g)得率平均(mg/g)RSD(%)测定值(g/g,%)纯度(％)平均(g/g，％)RSD(%)12.7757.04总黄酮12.0212.263.5753.8454.58楊12.0052.879.6943.29总含量9.279.372.9941.5141.723.559.1640.49其中得率为测定所得的含量/上样的药材量；纯度为测定所得的含量/固形物的量实施例6多糖超滤工艺条件优化1)材料和仪器本发明提取纯化步骤中的沉淀部分；HPM型板筐式超滤器(上齊原子核研究所)，真空干燥器，电子天平，温度计。12)方法与结果将按实施例1方法制得的沉淀部分，按其生药量折算成浓度为40%,30%，20%和10%的药液浓度(药材量/溶剂量)，分别进行超滤，压力控制在a2Mpa，温度控制(通冷凝水)在不大于60'C，以药液超滤至无过滤膜的超滤液流出后再加2次2倍量药材量的蒸馏水，至无超滤液流出即为超滤结束。分别收集分子量<1万、1~5万和>5万的三个分子量段，浓縮，水浴蒸发至干后，按药典方法，测定干浸膏的量和得率，结果表明，药液浓度越小，则<1万和15万分子段的干浸膏得率越高，说明超滤效果越好，从<1万和15万分子段的得率评价，30%浓度的药液的干浸膏得率低于10%和20%浓度的干浸膏得率，但差距不大，同时考虑到后续超作，药液浓度越小，则增加了后续浓縮的成本和周期，因此选用30%的超滤液浓度。根据上述结果，结合实际操作的因素，确定超率的工艺为30%的复方总多糖药液浓度(以药材计)，超率压力控制在0.2Mpa，温度控制(通冷凝水)不大于60°C，以药液超滤至无过滤膜的超滤液流出后再加2次2倍量药材量的蒸馏水，至无超滤液流出即为超滤结束，收集不同分子量段的超滤液。表13是超滤溶液浓度对3个分子量段得率的影响。表13比例<1万l--5万>5万干膏量得率干膏量得率干膏量得率40%25.381.9530.052.3159.224.5630%27.332.1034.612.6654.374.1820%27.942.1535.032.6953.984.1510%28.052.1635.162.7052.144.01实施例7提取物部分质控指标的研究试验本发明对提取纯化所得的黄酮类和多糖类提取物进行抗骨质疏松症药效学研究前进行初步的质控研究试验，以更好地了解实验药物质量与药效的关系，和为进一步配伍不同的组分及评价不同剂量的药效提供基础。1)实验药物和仪器实验药物本发明总黄酮提取物和总多糖提取物；实验仪器采用HPLC仪器，紫外分光广度仪，真空干燥器。172)实验方法和结果测定总黄酮中3个指标成分的比例分别采用HPLC法测定纯化前和纯化后总黄酮样品中的淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的含量，并以含量最小的柚皮苷为基准，计算总黄酮纯化物中3个成分的比例，结果显示，淫羊藿苷、二苯乙烯苷、柚皮苷在大孔吸附树脂纯化前后，其比例无明显变化。表14是3个指标成分在总提取物中的含量及其比例。表15是原提取液中3个指标成分在总提取物中的含量及其比例。表14指标淫羊藿苷二苯乙烯苷柚皮苷含量(mg/g)3.135.300.94比例3.325.631.00表15指标淫羊藿苷二苯乙烯苷柚皮苷含量(mg/ml)2.664.110.80比例3.335.131.00不同部位多糖的固形物得率、比例及含量测定为了确定总多糖不同部位中3个不同部位的固形物比例，以13kg的生药投料量，经提取和纯化的粗多糖后，配制成30%的药液浓度，按照上述的工艺流程,分别得到3种不同的多糖截留段多糖，并以药典方法，测定其多糖固形物得率(固形物/生药量)，并计算3个不同固形物在总多糖中的比例，同时按照总多糖的测定方法(以葡萄糖为标准品，硫酸一蒽酮法)，测定3个不同分子量的多糖的含且里；本发明进行了3批总黄酮干浸膏的得率的测定，确定了采用大孔吸附树脂纯化后的总黄酮的干浸膏得率。结果表明，总黄酮固形物得率(以生药材计)为2.25%，复方总黄酮纯化物中总黄酮的含量(以淫羊藿苷计(分光光度法)为54.58%，以淫羊藿苷、二苯乙烯苷和柚皮苷的总含量计(HPLC法)为41.72%)，过大孔吸附树脂的总黄酮得率为76.30%(分光光度法)。表16是不同截留段多糖固形物的得率及其在总多糖中的比例。表17总黄酮固形物得率及其含量测定结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2次，每次间隔2小时，末次灌胃后l小时采血，制备含药血清，动物以乙醚麻醉，在无菌条件下腹主动脉采血，4'C离心，3000rpm，30min，抽取血清，56°C，30min水浴灭活补体活性，经0.22um滤膜滤抽滤除菌，分装，一20'C保存备用。MTT法测定成骨细胞增殖率(朱文菁，金慰芳，张丽丽，等.上海医科大学学报，1995，22(4):254—255):细胞以5X103/孔接种于96孔板内，第2天更换为含有加药血清的培养液，培养34天后，PBS冲洗，更换无血清的MEM培养液，同时加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37'C继续孵育4h,终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150ulDMSO，振荡10min,在波长490nm处测定各孔OD值。采用SPSS11.5软件进行方差分析。结果显示，本发明的不同部位的提取物对体外培养成骨细胞的增殖率的影响，以生理盐水组为判断标准，多糖<1万、多糖15万、多糖>5、总多糖、醇溶部分、本发明复方全方组(简称全方组)和肾气丸组的成骨细胞增殖率大于生理盐水组，说明有一定的促进成骨细胞增殖的作用，其作用强度由大到小依次为多糖<1万、全方组、肾气丸组、总多糖组、多糖1~5万组和总黄酮组；桂枝汤对成骨细胞的增殖率略低于生理盐水，说明无促进成骨细胞增殖的作用；离心部分组和多糖>5成骨细胞增殖率明显低于生理盐水组。统计处理结果显示其中多糖<1万组与生理盐水组相比有显著性差异(P<0.05)，而其他组包括阳性对照药组一金匮肾气丸组成骨细胞增殖率数值高于生理盐水组，但无统计学差异。本发明设定生理盐水组的成骨细胞增殖率为判断的阈值，确定本发明复方中的多糖<1万，多糖15万，总黄酮组为有效部位。表18是不同提取部位的含药血清对成骨细胞增殖率的影响(n=8)。表18.组别成骨细胞增殖率多糖<1万0.595±0.195*多糖1~5万0-466±0.120多糖>50.421±0.076总多糖0.468±0.067总黄酮组0.465±0.089离心部分0.305±0.048全方0.512±0.236桂枝汤0.437±0.110肾气丸0.501±0.125生理盐水0.442±0.077其中*表示P<0.052权利要求1、一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂，其特征是由下列重量份的原料药组分制成淫羊藿2份，黄芪1.5份，制何首乌1份，骨碎补1份，枸杞子1份。2、一种治疗骨质疏松症的中药有效部位，其特征是含有权利要求1所述的的复方制剂中的总多糖和总黄酮部位提取物，所述的多糖截留分子量为〈1万部位或15万部位，所述的总黄酮部位提取物的总黄酮含量大于50%。3、按权利要求2所述的治疗骨质疏松症的中药有效部位，其特征是所述的总黄酮部位含淫羊藿苷、柚皮苷和二苯乙烯苷。4、按权利要求3所述的治疗骨质疏松症的中药有效部位，其特征是所述的总黄酮部位所含淫羊藿苷、柚皮苷和二苯乙烯苷含量比例为34:57:1。5、按权利要求2所述的治疗骨质疏松症的中药有效部位，其特征是通过下述方法和步骤制备取权利要求1所述的重量份的原料药，加水10倍，浸泡30分钟,第一次煎煮1小时，第二次加水10倍，煎煮1小时，过200目网，合并提取液，管式分离机离心16000r/min，取上清夜，减压浓縮至提取液lml含lg生药，加乙醇醇沉13次至含醇量为6090%，得沉淀部分和醇溶部分；沉淀部分加水稀释至1040%以药材量计，用板框式超滤机过1万和5万截留分子量的超滤膜，得截留分子量〈1万部位和截留分子量15万部位，减压浓縮、干燥得总多糖部位；醇溶部分经减压回收乙醇至无醇味，加水稀释至lml含lg生药材，采用DM301大孔吸附树脂，径高比为l:10，以0.25BV/h速度上样分别用与湿树脂量相比310倍的蒸馏水洗和与湿树脂量相比310倍量的10%乙醇洗去杂质，然后用70%乙醇洗脱纯化总黄酮，收集吸脱液，减压回收乙醇，减压浓縮、干燥得总黄酮部位；上述制得的〈1万多糖部位，15万多糖部位和总黄酮部位提取物经粉碎，加入淀粉，混匀，装入胶囊即得。6、按权利要求3所述的方法，其中所述的大孔吸附树上样步骤中，湿树脂投量与生药比为2:1。7、按权利要求3所述的方法，其中所述的用70%乙醇洗脱纯化总黄酮步骤中，洗脱容剂用量与生药比为10:1，吸脱速度为lml/min。全文摘要本发明属中药领域，涉及一种治疗骨质疏松症的中药复方制剂，更具体的涉及所述的中药复方中的有效部位及其制备方法。本发明以中医补肾益精理论为依据，采用淫羊藿、黄芪、制何首乌、骨碎补和枸杞原料药，通过大孔吸附树脂、超滤等分离纯化技术，提取纯化上述复方中的截留分子量为＜1万和1～5万的总多糖和总黄酮部位为有效部位，制得治疗骨质疏松症的中药复方制剂。经对上述有效部位的含药血清的体外实验，结果显示，所述的有效部位对体外培养的成骨细胞增殖率有明显的促进作用。文档编号A61K36/185GK101468104SQ20071017298公开日2009年7月1日申请日期2007年12月24日优先权日2007年12月24日发明者力刘,瑾刘,史万忠,徐德生,石印玉,詹红生,赵咏芳申请人:上海中医药大学附属曙光医院