专利名称：一种在生物降解性材料上锚定生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种在生物降解性材料上锚定生长因子的方法，具体地 说，涉及一种使生长因子在经过等离子体处理的生物降解性材料上有效固 定、保持生物活性，又能逐渐从该生物降解性材料上脱落、缓慢释放的方 法。
背景技术：
生长因子是具有传递生物信号、调节细胞行为功能的多肽，能够剌激 或阻止细胞的粘附、增殖、分化、迁移和基因表达，也能够影响其它生长 因子的分泌和行为。至今已被识别和表征的生长因子有成纤维生长因子
(FGF)、硷性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、皮肤生长因子(EGF)、 (3 转移生长因子(TGF-(3)、 a转移生长因子(TGF-a)、骨形态蛋白(BMP)、 血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素类生长因子(IGF-I)等。由于生 长因子已经在组织再生、伤口治愈和血管形成等方面显示出良好的治疗效 果，使对它们新功能的认识和新应用的开发研究也不断地被深入。
生长因子一般在有水存在及室温环境下是很容易失去生物活性的，因 此直接使用生长因子时就会由于体内生理环境的影响而使生长因子失活。 例如，将生长因子以溶液形式注入体内时就会导致活性下降而难以达到预 期的效果。由于生长因子的作用强弱及其使用效果同生长因子的有效浓度 间呈很强的依赖关系，因此，如何能在体内环境下仍然保持生长因子的生 物活性、并且使其具有较长的使用有效期，成为生长因子能否真正在临床 得以应用和发挥作用的关键所在。
根据药物控制释放的原理，利用大多数高分子材料都呈疏水性的特 点，用生物条件下可降解的高分子来包埋或微包囊生长因子，就既可达到 防止生长因子直接与水接触、防止失活的保护作用，又可利用高分子包埋 或包囊层屏障所起的限制和控制作用实现生长因子的缓慢释放，使生长因子的寿命和有效作用时间得到延长。而生物降解高分子包埋层或包囊层又 可在体内降解、最终自行消失、不会产生任何残留，在植入体内并生长因 子释放完后也不需通过手术从体内取出。因此关键是采用何种生物降解材 料，以及采用何种生长因子的保护和控制技术，达到既对生长因子具有物 理保护作用、又对生长因子的溶解和扩散起调节控制作用，从而实现生长 因子缓慢释放的目的。
发明内容
本发明目的在于提供一种在生物降解性材料上锚定生长因子的方法， 以期达到既能使生长因子在生物降解性材料上有效地固定，其生物活性得 到保护，尔后又能逐渐从该生物降解性材料上脱落、缓慢释放的目的。
为实现上述目的，本发明提供的在生物降解性材料上锚定生长因子的 方法，其步骤如下-
A) 将生物降解性材料进行等离子体处理；
B) 将步骤A处理后的生物降解性材料浸入生长因子的溶液中，进行
生长因子锚定处理；
C) 将步骤B处理后的生物降解性材料取出，冷冻干燥。 所述的方法，其中，所述的生物降解性材料是合成类生物降解高分子
或天然生物降解高分子，且具有几何形状和尺寸的致密或多孔结构的膜、 管、微球或支架。
所述的方法，其中，所述生物降解性材料选自聚L-乳酸(PLLA)、 聚DL-乳酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PL-DL-LA)、共聚 (乙交酯/丙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/ 己内酯)三元共聚物(PGLC)、聚己内酯/聚乙二醇嵌段共聚物(PCE)、 聚己内酯/聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)、聚羟丁酯(PHB)、 聚羟戊酯(PHV)、胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸其中一种，或它们间 的共混物。
所述的方法，其中，所述的等离子体处理条件是气压O.l — lOOPa; 等离子体处理功率IO—IOOW;处理时间3 — 120分钟。
所述的方法，其中，步骤A所述的等离子体处理是在氧气、空气、氨气、氮气、二氧化碳、氩气、氦气或它们的混合气体气氛中进行的。
所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子溶液其浓度是
50ng/ml-200吗/ml。
所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子是成纤维细胞生长因子
(FGF)、硷性成纤维细胞生长因子(b-FGF)、皮肤细胞生长因子(EGF)、 内皮细胞生长因子(ECGF)、神经细胞生长因子(NGF)、转移生长因子
(TGF)、骨衍生性生长因子(BDGF)、骨形态蛋白(BMP)、血小板衍生 生长因子(PDGF)或胰岛素类生长因子(IGF-I)。
所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子溶液中的溶剂是水、磷 酸缓冲液、Tris (三羟甲基氨基甲烷，tYishydroxymethylaminomethane)缓 冲液、MES (2-(N-吗啡啉)乙磺酸，2-(N-Morphilino)ethanesulfonic acid) 缓冲液、PIPES (哌嗪-N ， N-双 (2-乙磺酸)， piperazine-N,N-bis(2-ethanesulfomc acid))缓冲液、MOPS(3陽(N-吗啡啉)丙 石黄酸，3-(N-Morpholino) propane sulfonic Acid)缓冲液、Bicine(N,N—二羟 乙基甘氨酸，N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine)缓冲液、Glycylglycine(双甘 氨二肽)缓冲液或Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸， N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)缓冲液。
所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子锚定处理时间为3 — 300 分钟。
本发明提供的在生物降解性材料上锚定生长因子的方法，其生长因子 可有效地保持生物活性，并持续释放一周以上。可作为传输生长因子的载 体推动外源性生长因子发挥临床治疗的作用，也可用于生物降解性材料支 架的表面改性而应用于组织工程。
具体实施例方式
本发明提供的在生物降解性材料上锚定生长因子的方法中，操作步骤
是
O将生物降解性材料在是在氧气、空气、氨气、氮气、二氧化碳、 氩气、氦气或它们间混合气体的气氛下进行等离子体处理，并将经过等离 子体处理过的生物降解性材料在该等离子体处理的气氛下继续保持一定时间。
进行等离子体处理的条件是气压是O.l-lOOPa，功率为10-100瓦， 等离子体处理时间是3-120分钟。
本发明采用生物降解性材料是合成类生物降解高分子，也可为天然生 物降解高分子。合成类生物降解高分子为聚L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳 酸(PDLLA)、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)(PL-DL-LA)、共聚(乙交酯/ 丙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三 元共聚物(PGLC)、聚己内酯/聚乙二醇嵌段共聚物(PCE)、聚己内酯/ 聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物(PCEL)，以及聚羟丁酯(PHB)、聚羟 戊酯(PHV)和二者的共聚物等脂肪族聚酯类高分子或其共混物。天然生 物降解高分子为胶原、明胶、壳聚糖和/或透明质酸。
本发明发明采用的生物降解性材料是各种几何形状和尺寸的致密或 多孔结构的膜、管、微球和支架。
2) 同时，将生长因子溶于溶剂中，配成生长因子溶液，生长因子溶 液浓度是50ng/ml-200|ig/ml。
本发明采用的生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)、硷性成纤维细 胞生长因子(b-FGF)、皮肤细胞生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子 (ECGF)、神经细胞生长因子(NGF)、转移生长因子(TGF)、骨衍生性 生长因子(BDGF)、骨形态蛋白(BMP)、血小板衍生生长因子(PDGF) 和胰岛素类生长因子(IGF-I)。
本发明配制生长因子溶液的溶剂是水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、MES 缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Bicine缓冲液、Glycylglycine缓 冲液和Tricine缓冲液。
3) 将生物降解性材料立即浸入生长因子溶液，进行生长因子锚定处 理，浸泡时间为3-300分钟。
4) 将经过锚定处理的生物降解高分子从生长因子溶液中取出，进行 冷冻干燥；
5) 得到经过等离子体处理-生长因子锚定的生物降解高分子，备用。 通过上述方法固定在聚内酯支架上的生长因子，经酶联免疫吸附测定
法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)体夕卜模拟体内温度和剪切力环境进行固定效率和稳定性评估，在相同的生长因子溶液中，经等离 子处理固定的生长因子的数量和稳定性大大增加。
下列实施例旨在进一步描述本发明方法的各个方面，不只局限于所提 到的生长因子和生物降解性材料。通过改变等离子体处理的条件，还可在 任何几何形状和尺寸的生物降解性材料表面固定多肽或蛋白类的生长因 子。
实施例1
共聚(乙交酯/丙交酯)(PLGA)(分子量8万)溶解在三氯甲烷中
后，注入聚四氟乙烯模具，待三氯甲烷完全挥发后，再在室温真空条件下
脱溶剂48小时，得到厚度为0.1毫米的无孔致密结构PLGA膜，然后进
行以下条件的等离子体处理 气氛二氧化碳
气压50Pa
等离子体功率20 W 等离子体处理时间20分钟 在二氧化碳气氛下继续保持时间IO分钟。
将等离子体处理过的PLGA膜迅速浸入浓度为500ng/ml的碱性成纤 维生长因子(bFGF)的磷酸缓冲液溶液(pH 7.4)中120分钟后进行冷冻干 燥。将锚定有bFGF的PLGA膜在37"C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放， 释放时间可以持续7天。在锚定有bFGF的PLGA膜上进行成纤维细胞的 培养，结果显示成纤维细胞的生长状态及增殖都比没有锚定bFGF的PLGA 膜有很大的提高。
实施例2
同实施例1的方法，但生物降解性材料是聚(乙交酯/丙交酯/己内酯) 三元共聚物(PGLC)(分子量5万)，溶剂是二氧六环，在将该高分子 溶液注入聚四氟乙烯模具后，先在-40。C下冷冻，然后再在真空和-4(TC以 下脱溶剂48小时，得到厚度为2毫米的多孔结构支架。然后进行以下条 件的等离子体处理
气氛二氧化碳
气压30Pa等离子体功率50 W 等离子体处理时间15分钟 在二氧化碳气氛下继续保持时间20分钟。
将等离子体处理过的PGLC多孔结构支架迅速浸入浓度为200pg/ml 的重组骨形态蛋白(BMP—2)水溶液中120分钟后进行冷冻干燥。将锚 定有BMP—2的PGLC膜在37。C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放 时间可以持续28天。在锚定有BMP—2的PGLC多孔结构支架上进行成 骨细胞的培养，结果显示成骨细胞的生长状态及成骨能力都比没有锚定 BMP—2的PGLC多孔结构支架有很大的提高。
实施例3
同实施例l的制膜方法，但生物降解性材料是聚DL-乳酸(PDLLA) (分子量8万)，用的溶剂是四氢呋喃，得到厚度为0.2毫米的无孔致密 结构PDLLA膜，然后进行以下条件的等离子体处理 气氛氧气 气压40Pa
等离子体功率40 W 等离子体处理时间20分钟 在氧气氛下继续保持时间30分钟。
将等离子体处理过的PDLLA膜迅速浸入浓度为50ng/ml的神经细胞 生长因子(NGF)的Tris缓冲液(pH7.4)中150分钟后进行冷冻干燥。 将锚定有NGF的PDLLA膜在37'C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释 放时间可以持续8天。在锚定有NGF的PDLLA膜上进行神经细胞的培养， 结果显示神经细胞的生长状态及增殖都比没有锚定NGF的PDLLA膜有很
大的提高。 实施例4
同实施例2的方法，但是用的生物降解性材料是聚L-乳酸(PLLA) 共聚物(分子量12万)，在将该高分子溶液与80—100目的氯化钠颗粒 注入聚四氟乙烯模具并且混合均匀后，先在0。C下保持24小时，然后再在 真空和-40。C以下脱溶剂48小时，再用蒸馏水洗去氯化钠后得到厚度为3 毫米的PLLA多孔结构支架。然后进行以下条件的等离子处理气氛氮气
气压O.lPa
等离子体功率60 W 等离子体处理时间30分钟 在氮气氛下继续保持时间20分钟。
将等离子体处理过的PLLA多孔结构支架迅速浸入浓度为120pg/ml 的内皮细胞生长因子(ECGF) MES缓冲液中(pH 6.9)3小时后进行冷冻干 燥。将锚定有ECGF的PLLA多孔支架在37。C磷酸缓冲液溶液中进行体外 释放，释放时间可以持续30天。在锚定有ECGF的PLLA多孔结构支架 上进行内皮细胞的培养，结果显示内皮细胞的生长状态及增殖都比没有锚 定ECGF的PLLA多孔结构支架有很大的提高。
实施例5
同实施例4的方法，但是生物降解性材料是共聚(L-乳酸/DL-乳酸) (PLDLLA)(分子量15万)，溶剂是三氯甲垸，在将该高分子溶液与 60 — 80目的氯化钠颗粒注入聚四氟乙烯模具并且混合均匀后，先在室温下 保持24小时，然后用蒸馏水洗去氯化钠，再在真空和-4(TC以下脱溶剂48 小时后得到厚度为3毫米的PLDLLA多孔结构支架。然后进行以下条件的 等离子处理.-
气氛氨气和氧气混合气
气压20Pa
等离子体功率100W
等离子体处理时间5分钟 在混合气氛下继续保持时间10分钟
将等离子体处理过的膜迅速浸入20)_ig/ml骨衍生性生长因子(BDGF) 磷酸缓冲液溶液((pH 7.0)中90分钟后进行冷冻干燥。将锚定有BDGF的 PLDLLA多孔支架在37。C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放时间可以 持续30天。在锚定有PLDLLA的多孔结构支架上进行成骨细胞的培养， 结果显示成骨细胞的生长状态及增殖都比没有锚定BDGF的PLDLLA多 孔结构支架有很大的提高。
实施例6同实施例1的制膜方法，但是生物降解性材料是聚羟丁酯(PHB)(分 子量为20万)，然后将PHB致密膜进行以下条件的等离子处理 气氛氦气
气压30Pa
等离子体功率15W 等离子体处理时间100分钟 在氦气氛下继续保持时间15分钟
将等子体处理过的膜迅速浸入5pg/ml骨形态蛋白(BMP—7) MOPS 缓冲液溶液(pH7.2)中120分钟后进行冷冻干燥。将锚定有BMP — 7的 PHB膜在37。C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放时间可以持续10天。 在锚定有BMP—7的PHB膜上进行成骨细胞的培养，结果显示成骨细胞 的生长状态及成骨能力比没有锚定BMP—7的PHB膜有很大的提高。
实施例7
同实施例3的制膜方法，但是生物降解性材料是明胶，溶剂是去离子 水，得到厚度为0.5毫米的无孔致密结构明胶膜，然后进行以下条件的等 离子体处理
气氛空气
处理功率120 W 处理时间3分钟
在空气气氛下继续保持时间5分钟
将等离子体处理过的膜迅速浸入2pg/ml血小板衍生生长因子(PDGF) Tricine缓冲液溶液(pH6.6)中30分钟后进行冷冻干燥。将锚定有PDGF 的明胶膜在37。C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放时间可以持续10 天。在锚定有PDGF的明胶膜上进行基质干细胞的培养，结果显示持基质 干细胞的生长状态及增殖比没有锚定的PDGF的明胶膜有很大的提高。
实施例8
同实施例3的制膜方法，但是生物降解性材料是聚己内酯/聚乙二醇/ 聚丙交酯三元共聚物(PCEL)(分子量4万)，然后进行以下条件的等 离子体处理
气氛氨气气压60Pa
等离子体功率50 W 等离子体处理时间20分钟 在氨气气氛下继续保持时间15分钟
然后将等离子体处理过的膜迅速浸入120pg/ml人重组皮肤生长因子 (EGF)Tris缓冲溶液(pH 7.6)中3分钟后进行冷冻干燥。将锚定有EGF的 PCEL膜在37t:磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放时间可以持续12 天。在锚定有EGF的PCEL膜上进行皮肤细胞的培养，结果显示皮肤细胞 的生长状态及增殖都比没有锚定EGF的PCEL膜有很大的提高。
实施例9
同实施例4的PLLA多孔支架，然后对多孔支架进行以下条件的等离 子体处理
气氛氩气
气压lOOPa
等离子体功率10W 等离子处理时间110分钟 在氩气气氛下继续保持时间10分钟。
将等离子体处理过的PLLA多孔结构支架迅速浸入浓度为20吗/ml转 移生长因子(TGF — pi) Glycylglycine缓冲溶液(pH 7.5)中3小时后进 行冷冻干燥。将锚定有的TGF — (31的PLLA多孔支架在37'C磷酸缓冲液 溶液中进行体外释放，释放时间可以持续30天。在锚定有TGF — f31的 PLLA多孔结构支架上进行似成骨细胞的培养，结果显示似成骨细胞的生 长状态及成骨能力都比没有锚定TGF — (31的PLLA多孔结构支架有很大 的提高。
实施例10
同实施例4的(PLGA (分子量8万)+胶原粉)(重量比100: 1) 混合材料多孔支架，然后对多孔支架进行以下条件的等离子体处理-
气氛二氧化硫
气压lOOPa
等离子体功率15W等离子处理时间90分钟
在二氧化硫气氛下继续保持时间30分钟。
将等离子体处理过的(PLGA+胶原粉)多孔结构支架迅速浸入浓度为 20吗/ml的硷性成纤维细胞生长因子(b-FGF)磷酸缓冲液(pH 7.4)中2 小时后进行冷冻干燥。将锚定有的b-FGF的(PLGA+胶原粉)多孔支架在 37'C磷酸缓冲液溶液中进行体外释放，释放时间可以持续10天。在锚定 有b-FGF的(PLGA+胶原粉)多孔结构支架上进行似成软骨细胞的培养， 结果显示似成软骨细胞的生长状态及生成能力都比没有锚定b-FGF的 (PLGA+胶原粉)多孔结构支架有很大的提高。
对照例
将按实施例1 _ 10方法制得的无孔致密结构膜和多孔结构支架不进行 等离子处理及生长因子锚定而直接进行细胞培养，结果显示各种细胞的生 长状态及细胞数量与经过等离子处理及生长因子锚定的实施例1 —10的相 应结果比较，不仅细胞的生长情况大大变差、而且细胞数量大大减少、死 细胞数量大大增加。
权利要求
1、一种在生物降解性材料上锚定生长因子的方法，其步骤如下A)将生物降解性材料进行等离子体处理；B)将步骤A处理后的生物降解性材料浸入生长因子溶液中进行生长因子锚定处理；C)将步骤B处理后的生物降解性材料取出，冷冻干燥。
2、 如权利要求1所述的方法，.其中，所述的生物降解性材料是合成 类生物降解高分子或天然生物降解高分子，且具有几何形状和尺寸的致密 或多孔结构的膜、管、微球或支架。
3、 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述生物降解性材料选自-聚L-乳酸、聚DL-乳酸、共聚(L-乳酸/DL-乳酸)、共聚(乙交酯/丙交酯)、聚己内酯、聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物、聚己内 酯/聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯/聚乙二醇/聚丙交酯三元共聚物、聚羟 丁酯、聚羟戊酯、胶原、明胶、壳聚糖、透明质酸其中一种或它们间的共 混物。
4、 如权利要求l所述的方法，其中，所述的等离子体处理条件是 压力0.1 — 100Pa;等离子体处理功率10—100W;处理时间3 —100分钟。
5、 如权利要求l所述的方法，其中，步骤A所述的等离子体处理是 在氧气、空气、氨气、氮气、二氧化碳、二氧化硫、氩气、氦气或它们的 混合气体气氛中进行的。
6、 如权利要求l所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子溶液浓 度是50ng/ml-200吗/ml。
7、 如权利要求1或6所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子是: 成纤维细胞生长因子、硷性成纤维细胞生长因子、皮肤细胞生长因子、内皮细胞生长因子、神经细胞生长因子、转移生长因子、骨衍生性生长因 子、骨形态蛋白、血小板衍生生长因子或胰岛素类生长因子。
8、 如权利要求1或6所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子溶 液中的溶剂是水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Bicine缓冲液、Glycylglycine缓冲液或Tricine缓冲液。
9、如权利要求l所述的方法，其中，步骤B所述的生长因子锚定处 理时间为3—300分钟。
全文摘要
一种在生物降解性材料上锚定生长因子的方法，其步骤为A)将生物降解性材料进行等离子体处理；B)将步骤A的生物降解性材料浸入生长因子溶液中进行生长因子锚定处理；C)将步骤B的生物降解性材料取出，冷冻干燥。本发明既能保持生长因子原有的生物活性，又能持续地从生物降解性材料上释放。本发明通过有效地选择等离子体处理的气体种类、等离子体处理的参数和锚定条件可调节生长因子在生物材料上的固定效率以及控制释放行为，从而使生长因子有效地结合到生物材料制备的器件上，保持生物活性并在体内持续发挥作用。本发明还可同时达到改善生物降解性材料细胞亲和性的作用，从而推动聚内酯等合成类生物降解高分子在组织工程中的应用。
文档编号A61K47/34GK101411878SQ20071017597
公开日2009年4月22日 申请日期2007年10月17日 优先权日2007年10月17日
发明者红 沈, 王身国, 贝建中 申请人:中国科学院化学研究所