专利名称：制备活化的具有α氮基团的聚合物的方法
制备活化的具有a氮基团的聚合物的方法发明领域本发明涉及制备活化的聚合物，如聚环氧烷的方法。尤其是，本发明涉 及以高纯度制备直链的含a氮基团的聚合物的方法。发明背景水溶性聚环氧烷(polyalkylene oxide)与治疗部分，如蛋白质和多肽的轭 合物(conjugation)是已知的。参见，例如，美国专利4,179,337，其公开内容 在此引入作为参考。'337专利公开了被PEG修饰的生理学活性的多肽在体 内循环延长的时期，且具有降低的免疫原性和抗原性。为了轭合聚环氧烷，聚合物的羟基末端必须首先转化为反应性的官能 团。该方法通常称为"活化"，且产物称为"活化的聚环氧烷"。其它聚合物 被相似地活化。共同转让的(commonly assigned)美国专利5,730,990描述了一种用于解 决一些聚合物轭合反应伴随的一些问题的方案。具体而言，确定聚合物轭合 物具有与未修饰的蛋白质、酶等不同的pl。例如，PEG化，即聚合物与赖氨 酸《氨基的连接导致等电点的降低和最适pH(即在观察到最大生物活性的 pH)的改变。如'990专利中的报导，恢复原始的pl或甚至改变聚合物轭合的 pl值以使在生理pH下的生物活性最佳化是有利的。经过几年，确定在'990专利中描述的用于制备活化的聚合物的合成方 法需要改进的，尤其是当需要高纯度时。'990专利的实施例10表明在75° 下，使PEG-C1与肌氨S臾反应4天仅得到80 %纯的N-甲基甘氨酸PEG中间 体。也发现部分PEG-C1转化为PEG-OH，因此难于得到高纯度的活化的连 接基或用其制得的PEG轭合物。综上所述，需要提供活化的具有a氮基团聚合物的改进的制备方法。本 发明解决了该需要。发明简述备在其上具有含孤电子对部分的 聚合物的方法。更优选地，本发明提供了活化的在其上具有(x氮基团的聚合物和聚合物轭合物。该方法包括在石威的水溶液中，在温度约10至约80"C下， 反应，反应时间小于约24小时，<formula>formula see original document page 0</formula> (I)式(I)中R,为基本上非抗原性的聚合物； R2为封端基团，LG或LG-(L,)n-; Lj为双功能连接基；LG为离去基团，如曱苯石黄酸基团或下述的其它基团；且 n二O或正整数。在本发明的更优选的方面中，R，为分子量为约2,000至约100,000的PEG。在本发明的一些优选的方面中，式(I)的聚合物与在其上具有含^ 瓜电子对基团的式(m)化合物反应<formula>formula see original document page 0</formula>(III)式(m)中Z为O、 S或NR7; X为O、 S或NR8; m为正整数，优选1;且R4、 R5、 R6、 R7和Rs独立地选自H、 C,—6烷基、C3.12支链烷基、C3.8环 烷基、Cw取代的烷基、(33.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 C,—6杂烷基、取代的Cw杂烷基、C"烷氧基、苯氧基和C，.6杂烷氧基；条 件是，当Z为NR7时，R4和R7不都是H。在式(in)中，z优选为NR7，且x优选为o。 一个尤其优选的式(m)化合物为N-曱基-甘氨酸或肌氨酸。反应导致形成相应于式IV(a)和IV(b)的化 合物(<formula>formula see original document page 10</formula>一旦在其上具有含"l瓜电子对部分的聚合物以高纯度形成，它可以与任何量的在其上具有活化基团的化合物反应形成活化的在其上具有含a氮或孤电 子对部分的聚合物。 一个尤其优选的在其上具有活化基团的化合物为N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)，且所得的活化的聚合物为<formula>formula see original document page 10</formula>将被理解的是任何一个本领域认可的活化基团可以与高纯度的中间体 相连，使得活化的聚合物可以用于与多种生物学活性的亲核物质相连，并形 成PEG-辄合物。 一些尤其优选的生物学活性的亲核物质包括天门冬酰胺酶、 腺苷脱氨酶和精氨酸脱亚氨酶。伴随本发明优选方面的一个主要优点为以高纯度制备所得含a氮-的聚 合物，如其聚环氧烷衍生物。因此，产物污染物(contaminants)，即起始物料 和mPEG-OH,不以可识别的量存在。事实上，在本发明的大多数方面中， 发现污染物的量少于约5%,优选少于约2%。当优选的含a氮的PEG衍生 物以高纯度更经济的形成时，技术人员能够更有效并以较低成本制备终产 物，该中产物中引入了 PEG衍生物。该效果结果，部分由于含所需a氮中 间体(如肌氨酸)的分离，是不需要的，且基本上消除了 PEG-OTs向PEG-OH 的转化。而且，不需要冗长的离子交换或RP HPLC技术来提供所需的聚合 物。因此，本发明提供了高纯度的含a氮的PEG-胺，而不需要昂贵的柱色另一个优点是下述事实，从本文描述的方法制备的含a氮的聚合物将完 全不改变PEG的骨架。因此，将与现在和将来对于活化的PEG'S的应用是 兼容的。发明详述本发明的方法大体上涉及形成在其上含有至少一个a氮基团的聚合物。 在本发明的大多数方面中，使用本文描述的方法》务饰的聚合物为基本上非抗 原性的聚合物。在该类的聚合物中，优选聚环氧烷，且更优选聚乙二醇(PEG)。 为了便于描述的目的而不是为了限制，该方法有时描述为使用PEG作为原 始类型的(prototypical)聚合物。然而应该理解，该方法可用于许多聚合物， 所述聚合物可以是直链、基本上直链、支链等。然而一个要求是在本文所述 的条件下，该聚合物含有用于共价连接在其上具有含孤电子对基团的部分的 方式。个优选方面包括在碱的水溶液(aqueous base)中，温度约10至约80°C下，使 小时，<formula>formula see original document page 11</formula>(I)式(I)中R,为基本上非抗原性的聚合物； R2为封端基团，LG或LG-(L,V LG为离去基团； L,为双功能连接基；且n二O或正整数，优选约I至约IO，且更优选l。在一些优选方面中，温度范围为约30至约60°C,而在其它方面中，温 度范围为约45至约50。C。优选的反应时间小于约18小时，且更优选约12 小时或更少。所需的最少时间为足以基本上完成反应的时间。在大多数方面 中，优选的反应过程为至少约4小时。一些优选的式I聚合物包括<formula>formula see original document page 12</formula>其中R2为甲氧基；且 R,为聚环氧烷。令人惊奇的发现，当离去基团限定为本发明具体描述的基团，且反应温 度和反应时间条件如本文所述控制时，可以形成高纯度的含a氮的聚合物。比^ 其太P U杀ffl抑右枯^ 4: M那此#"占封端基团如上所述，R2可以为封端基团、另外的(another)离去基团(LG)、或另 外的离去基团和双功能连接基。对于本发明的目的，封端基团应该理解为指 聚合物末端出现的基团。在大多数方面中，优选曱氧基。也可以使用其它本 领域普通技术人员理解的末端基团。其中R3优选为曱基，且所述LG为曱苯磺酸基(tosylate)。或者，113可以为 卤素、硝基、氟曱基、二氟曱基、三氟曱基、被取代的羧基、或多卣素取代12和(lib)R2--O离去基团在本发明的一些优选的方面中，所述离去基团(本文中为LG)为的苯磺酰基。适合的可替换的离去基团的非限制性例示包括曱磺酸基(mesylate)、对溴苯磺酸基(brosylate)、三氟乙磺酸基(tresylate)和对硝基苯磺 酸基(nosylate)。 PEG-甲笨磺酸酯(PEG-tosylate)和其它相应于式(IIa)和(IIb)的 化合物可以从市售源得到作为基本上纯的起始物料或可以使用标准技术制 得而不用过度的实验。双功能连接基本发明的聚合物还可以包括双功能连接基团(L,),所述双功能连接基团 用于本领域认可的目的，包括在PEG部分和LG中间插入间隔基或其它任选 基团。因此，L，部分可以选自双功能连接基团，如下述非限制化合物中的一 种-NH(CH2CH20)y(CH2)q-， -NH(CH2CH20)yCH2CH2-，-C(0)(CR化Rn)qNHC(0)(CR^2)q陽，-C(0)0(CH2)q-，-C(O)(CR10R")q--C(0)NH(CH2CH20)y(CH2)q-，-C(0)0-(CH2CH20)yCH2CH2-， -C(O)NH(CR10R")q-， -C(O)O(CR10R")q-, -C(0)NH(CH2CH20)yCH2CH2-，-NH(CR,oR")q——^ ^~~(CR13R12)tOC(0)CH2CH2-,和-NH(CFtioRn)<CR13R12)tNR9C(0)CH2CH2-，其中119.13独立地选自d-6烷基等，且优选各自为H或CH3;R,4选自与119.13定义相同的基团，以及N02、 Cw卤代-烷基和卤素;q、 t和y各自独立地选自正整数，1至约12。13L,部分如对于式(I)所示R2————(h)n——LG可以理解，当需要双活化的(bis-activated)聚合物时，旋转L,基团以便在 Ro和LG之间保持合适的方向。1^和基本上非抗原性的聚合物R,还优选为在室温下可溶于水的聚合物，如聚环氧烷(PAO)，且更优 选为聚乙二醇，如mPEG或双-活化的PEG。因此这些聚合物的非限制性的 实例包括聚环氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇，聚氧乙烯化的多 元醇，其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物在水中的溶解度。为了说明而不是限制，R,的聚乙二醇(PEG)残基部分可以为 -CH2CH2—0-(CH2CH20)x-CH2CH2画其中x为聚合度，即约10至约2,300。聚合物的聚合度表示在聚合物链中重复单元的数量，且依赖于聚合物的 分子量。虽然基本上非抗原性的聚合物，PAO和PEG的重均分子量可以有 很大变化，但在本发明的大多数方面中优选的R，的重均分子量为约200至 约100,000道尔顿。更优选地，基本上非抗原性的聚合物的重均分子量为 2,000至约48,000道尔顿。&还可以为"星状-PEG，，或多臂PEG,如NOF Corp. Drug Delivery System catalog, 2005中所述，其公开内容在此引入作为参考。尤其是，R,可 以为下式<formula>formula see original document page 14</formula>其中:j为约10至约340的整数，使得优选提供具有约12,000至约40,000总 分子量的聚合物；该残基的最多3个末端部分被曱基或其它低级烷基封端。 也参见Nektar Catalog 2005-2006, 26页M-armPEG",其内容在此引入作为参 考。在与式III化合物或肌氨酸反应前，这些化合物优选包括H3C—(OCH2CH2)KQH3C—(OCH2CH2)j、00z(CH2CH20)j^^CH2cH2、LGH3C—(OCH2CH2)KO.H3C—(OCH2CH2)j、a0z(CH2CH20)j~^ch2ch2、lgH3C—(OCH2CH2)K.O、LG-'CHzCHz (OCH2CH2)j、Q',0z(CH2CH20)j~"CH2CH2、lg,(CH2CH20)CH2CH2——(OCH2CH2)KOLG--CH2CH2—(0ch2CH2)j、o■0z(CH2CH20)j---CH2CH:O',(CH2CH20)j.H3C—(OCH2CH2)j—0.H3C—(OCH2CH2)j-0—(CH2CH2C^—CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH3H3C—(OCH2CH2)「0 H3C—(OCH2CH2)f-QO—(CH2CH20)j—CH3(CH2CH20)「CH2CH2—LGH3C—(OCH2CH2)j—OH3C—(OCH2CH2)j0_(CH2CH20、一CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j—0 H3C—(OCH2CH2)jZQ0_(CH2CH20h—CH2CH2—LG-(CH2CH20)j——CH3H3C_(OCH2CH2)j—O LG-CH2CH2—(OCH2CH2)jZ00—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH3H3C—(OCH2CH2)j—O LG-CH2CH2—(OCH2CH2)jZ00—(CH2CH20、一CH2CH2—LG、(CH2CH20))—CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j—0 H3C-(OCH2CH2)jZ0O—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)j——CH2CH2—LGLG-CH2CH2—(OCH2CH2)j_0.LG—CH2CH2—(OCH2CH2)j-和0—(CH2CH20)-CH2CH2—LG、(CH2CH20)「CH2CH2—LG其中LG优选为oII—o——s-0或本文描述的其它基团。同样在本发明考虑范围内的是形成其它在其上具有含孤电子对部分的PEG-基的化合物，包括共同转让的美国专利5,605,976, 5,643,575, 5,919,455 和6,113,906所述的支链聚合物残基，这些公开内容在此引入作为参考。这 些对应于式I的具体聚合物的代表性的示例包括 (2a)<formula>formula see original document page 0</formula>其中LG、 x和L,与上述相同，且L2和L3独立地选自与定义相同的基团， 或L2可以为支链连接基团，如二氨基烷基或赖氨酸残基。参见，例如 上述美国专利6,113，卯6;且 z为1至约120的整数。在另一实施方案中，作为PAO-基的聚合物，R，任选选自一个或多个有 效的非抗原性物料，如葡聚糖、聚乙烯醇、糖-基的聚合物、羟基丙基曱基 丙烯酰胺(HPMA)、聚环氧烷、和/或其共聚物。也参见共同转让的美国专 利6,153,655，其内容在此引入作为参考。本领域普通技术人员将理解本文所 述的相同类型的活化用于PAO's,如PEG。本领域技术人员还将知道上述列在本发明的另一方面中，当需要双-活化的聚合物时，R2可以为且反应物用于制备含双-a氮的聚合化合物。这些双-活化的聚合物可以为式(Ia): <formula>formula see original document page 18</formula>(la)其中X与上述相同孤电子对或含a-氮的聚合物的生成在本发明的一些方面中，在石咸的水溶液中，式(I)的聚合物与在其上含有 孤电子对基团的化合物反应。 一些在其上含有孤电子对基团的优选的化合物 对应于下式<formula>formula see original document page 18</formula>其中Z为O、 S或NR7; X为O、 S或NR8; m为正整数，优选l;且R4、 R5、 R6、 R7和Rs独立地选自H、 Cw烷基、C3.12支链烷基、(:3.8环 烷基、Cw取代的烷基、Cw取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 C,.6杂烷基、取代的d.6杂烷基、C,—6烷氧基、苯氧基和d.6杂烷氧基；条件是当Z为NR7时，R4和R7不都是H。在本发明该方面中更优选式(m)化合物，其中X为O， m为l， R4为曱 基，且Rs和Re每个为H。更优选的式(III)化合物为N-曱基-甘氨酸(肌氨酸)。 形成在其上含有孤电子对部分的聚合物中的反应结果，如式(IVa)化合<formula>formula see original document page 0</formula>其它化合物包括<formula>formula see original document page 0</formula> 在实施例(下述)中化合物3为优选的对应于式(IV)的mPEG-肌氨酸化合物的实例。本发明的方法优选在碱的水溶液中进行，所述碱的水溶液如包含NaOH<formula>formula see original document page 0</formula>(优选)、KOH、 LiOH、 Mg(OH)2、 Ca(OH)2等或其混合物的水溶液。视需要， H20和四氢呋喃(THF)、 二曱基曱酰胺(DMF)和二哺烷的混合溶剂可以连同 辅助溶剂一起使用。在任何本领域承认的方法中可以卩吏用高纯度的含a-氮的PEG-衍生物。 例如，没有限制，其可以用任何本领域承认的方法(包括下述讨论的那些)活 化，然后用于直接与酶、蛋白质、肽等缀合(conjugation)。或者，C02H衍生 物可用于可释放地连接生物学活性化合物(紫杉醇、喜树碱等)上的OH残基。含a-氮聚合物的活化如本发明的优选方面，实例表示用NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)和DIPC (二 异丙基碳二亚胺)活化mPEG-肌氨酸。也将被理解的是，使用根据具有所需 能够与特定亲核物质反应的官能团选择的化合物，进行任何本领域承认的末 端C02H的转化是可能的。在大多数情况中，对于聚合物轭合物(conjugation) 的靶点上的亲核基团将具有胺、羧酸基团、反应性羰基、羟基、巯基等。不 是为了具体限制，适合的能与胺反应的官能团选自a) 碳酸酯(carbonates),包含对硝基苯基或琥珀酰亚胺基；b) 羰基咪唑；c) 二氬p恶唑酮(azlactones);d) 环状亚胺石克酮；e) 异氛酉臾酉旨(isocyanates)或异石克氛酉吏酉旨(isothiocyanates);禾口f) 其它活性酯，包含N-羟基琥珀酰亚胺基。 根据本发明的这个方面， 一些活化的聚合物包括相似的，能够与羧酸基团和反应性羰基基团反应的适合的官能团可以选 自肼和酰肼官能团，包括酰基酰肼(acylhydrazide)、肼基曱酸酯(carbazates)、肼基半曱酸酯(semicarbazates)和肼基硫代曱酸酯(thiocarbazates),如<formula>formula see original document page 21</formula> 其可以通过mPEG-肌氨酸与肼反应制备。用于轭合的生物学活性部分一旦活化，高纯度的含a氮的聚合物可以与任何或多种生物学活性的亲 核物质反应。本发明所关注的生物学活性的亲核物质包括，但不限于，蛋白 质、肽、多肽、酶、天然的有机分子和合成的有机分子，如药物化学物质等。关注的酶包括糖-特异性的酶、蛋白水解酶、氧化还原酶、转移酶、水 解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。没有限制为具体的酶，所关注的酶的实例 包括天门冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱亚氨酶、腺苷脱氨酶、超氧化物歧 化酶、内毒素酶(endotoxinases)、过氧化氢酶、糜蛋白酶、脂酶、尿酸酶、 腺苷二磷酸酶、酪氨酸酶和胆红素氧化酶。所关注的糖-特异性的酶包括葡 萄糖氧化酶、糖香酶、半乳糖苦酶、葡糖糖脑苷脂酶(glucocerebrosidases)、 葡萄糖醛酸酶等。所关注的蛋白质、多肽和肽包括，但不限于，血红蛋白、血清蛋白，如 血液因子，包括因子VII、 VIII和IX;免疫球蛋白、细胞因子如白介素、a-、 P-和Y-干扰素、集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长 因子和磷脂酶-活化蛋白(PLAP)。其它通常的生物学或治疗感兴趣的蛋白质 包括胰岛素、植物蛋白如凝集素和蓖麻毒素、肿瘤坏死因子、生长因子、组 织生长因子、TGFa's或TGFp's和表皮生长因子、激素、生长介素、促红细 月包生成素、色素激素(pigmentaryhormones)、下丘脑释放因子、抗利尿激素、 催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡成熟激素、促曱状腺激素、组织纤维蛋 白溶酶原激活剂等。所关注的免疫球蛋白包括IgG、 IgE、 IgM、 IgA、 IgD 及其片段。一些蛋白质，如白介素、干扰素和集落刺激因子，也以非糖基化形式存 在，通常是由于使用重组技术。非糖基化物质也包括在本发明的生物学活性 的亲核物质中。任何部分。其包括氨基酸序列、反义部分等，抗体片段、单链抗原结合蛋白(参见，例如美国专利4,946,778，其公开内容在此引入作为参考)、结合分子 包括抗体或片段的融合、多克隆抗体、单克隆抗体、催化抗体、核苷酸和寡 核苷酸。可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术，如组织培养、从动物源 中提取、或通过重组DNA方法，制备或分离蛋白质或其部分(portions)。转 基因源的蛋白质、多肽、氨基S吏序列等也在本发明的考虑范围内。这些物质 从转基因的动物即小鼠、猪、牛等得到，其中所述蛋白质在奶、血液和组织 中表达。转基因的昆虫和杆状病毒表达体系也作为来源考虑。而且，突变的 (mutant)蛋白质，如突变的TNFs和突变的干扰素也在本发明的范围中。其它关注的蛋白质为变应原性蛋白质，如豕草、抗原E、蜜蜂毒液、螨 变应原等。有用的生物学活性的亲核物质不限于蛋白质和肽。基本上任何生物学活 性的化合物包括在本发明的范围中。包括化疗分子，如药物化学物质，即抗 肿瘤药、心血管药、抗瘤形成药、抗感染药、抗焦虑药、胃肠药、活化中枢 神经系统药、镇痛药、生育或避孕药、消炎药、甾体药、anti-urecemic agents、 心血管药、血管扩张剂、血管收缩剂等。在本发明优选的方面中，在进行聚 合物和化疗部分之间的酯连接的条件下，进行羧酸衍生物的反应。 一个尤其 优选的生物学活性的亲核基团为天门冬酰胺酶，其来自天然的大肠杆菌(E co/z')发酵，即左旋门冬酰胺酶(Elspar),或其它细菌、真菌、酵母等，或重组 表达源，如ECAR-LANS，其来自胡萝卜软腐欧文氏菌(五nWm'a caratowra) 的重组L-天门冬酰胺酶或其它人重组L-天门冬酰胺酶。质也包括在本发明的范围内。辄合反应(conjugation reaction),有时称作PEG化反应，通常在溶液中， 用相对于要被轭合的蛋白质从大约等摩尔至约过量几倍摩尔量的活化聚合 物进行。优选地，对于蛋白质过量的活化的聚合物的摩尔量为约10-倍或更 大。 一种保持蛋白质生物活性的方法是基本上避免连接到与与蛋白质活性位 点相关的氨基酸残基上。例如，对于精氨酸脱亚氨酶蛋白，，在聚合物偶连 过程中需要避免连接到那些与活性位点相关的精氨酸脱亚氨酶赖氨酸g氨基上。由于偶连反应的通常的非特异性，该理论的步骤通常难以实际实现。 在一些任选的实施方案中，将轭合的蛋白质被设计为在远离任何活性位点的 位置包括特定残基，如，通过在蛋白质结构的特异性位点插入设计的半胱氨 酸或寡赖氨酸残基，然后使用含有(X氮(优选在那些设计的残基轭合)的本发 明的活化的聚合物。在相对温和的条件下进行辄合反应以避免使蛋白质失活。温和的条件包括维持反应溶液的pH为6-8，且反应温度为约10°-20° C。适合的缓冲剂包 括能够维持pH范围6-8，而不干扰轭合反应的緩冲溶液。适合的緩冲剂的 非限制性列表包括，如磷酸盐緩冲剂、柠檬盐緩沖剂、乙酸盐緩冲剂。虽然本文所述的反应条件可以产生一些未修饰的蛋白质，但该未修饰的影响轭合的反应条件还包括对于蛋白质或其它靶标使约等摩尔至约过 量的大摩尔量的活化的聚合物进行连接反应。例如，该方法可以以过量约 l-600-倍摩尔量的聚合物进行；优选以过量约l-100-倍摩尔量的聚合物，且 最优选以过量约1.75-5-倍摩尔量的聚合物。将被理解，依赖于技术人员的选 择，活化的聚合物可以作为固体或以溶液形式加入到目标蛋白中。在温度范 围约10至约20° C下进行轭合反应。反应时间还将根据技术人员的选择改 变，且范围可以从小于1小时至24小时或甚至更长，这依赖于所选择的活 化的聚合物。任选进行反应淬灭。实施例下述实施例进一步提供了对本发明的理解，但不是为了将本发明的有效 范围限制在任何方式中。<formula>formula see original document page 0</formula>(1) 室温，过夜 () 50。C,过夜 ("<formula>formula see original document page 0</formula>实施例1制备5kmPEG-Ts:将5k mPEG-OH (化合物1, 50 g, 10 mmol)和DMAP (5.89 g， 48 mmol)溶 解于300 ml的CH2C12中。将对曱苯磺酰氯(9.35 g， 50 mmol)单独溶于200 ml的CH2Cl2中。然后用加料漏斗经2至3小时将制备的对甲苯磺酰氯溶液 加入到5k mPEG-OH溶液中。在室温下，搅拌反应混合物过夜。将250 ml 的CH2Cb加入到反应混合物中，然后用0.1 N的HC1洗涤反应混合物2次。 分离CH2Cl2层并用MgS04干燥。尽可能除去溶剂。将残余物溶于75 ml的 CNCH3中，且通过加入1500 ml的IPA沉淀产物。过滤固体，然后用IPA洗 涤两次，并用乙醚洗涤两次。在40。C下真空干燥终产物(化合物2)(48.4g,产 率96.8%)。通过NMR检测，纯度> 990/0。13C丽R (CDC13) S 21.3 (-CH3), 58.6 (-OCH3), 68.2-71.4 (OCH2CH20在 PEG中)，127.4， 129.3， 132.5, 144.1 (芳香C).实施例2制备5kmPEG-肌氨酸(3):将NaOH (3.49 g， 87.31 mmol)和肌氨酸(7.77 g, 87.31 mmol)溶于180 ml 的H20中。加入5k mPEG-Ts (化合物2， 45 g， 8.73 mmol)。将反应混合物加 热至45-50。C，并在此温度下保持12小时，然后冷却至室温。用CH2Cl2萃 取反应混合物2次。用1120反洗涤合并的CEbCl2层。用MgS04干燥有机层。 除去溶剂，且残余物溶于110ml的0.25NHC1中。用0"12<:12萃取产物2次。 合并的CH2Cb层用MgS04干燥。除去溶剂，且残余物溶于130 ml的CH2C12， 然后产物用900 ml乙醚沉淀。过滤终产物(化合物3),用乙醚洗涤，然后在 40。C下真空干燥(38.8g，产率86.2%)。通过NMR检测，纯度> 95%。13C丽R (CDC13) 3 42.0 (-NCH3), 54.2 (-CH2NCH2-)， 58.6 (-OCH3)， 65.5-71.4 (OCH2CH20在PEG中)，166.0 (-C=0).实施例3制备5k mPEG-肌氨酸NHS:将5k mPEG-肌氨酸(化合物3， 15 g, 2.958 mmol)溶于100 ml的CH2C12。加入N-羟基琥珀酰亚胺(510 mg, 4.437 mmol)、 二异丙基石友二亚胺(559 mg， 4.437 mmol)和4-二曱基氨基-吡啶(361 mg， 2.958 mmol)。在室温下4觉拌混合 物过夜。过滤反应混合物。尽可能移除溶剂。将残余固体溶于30 ml的CH2C12， 然后用350 ml乙醚沉淀。过滤固体并用乙醚洗涤。湿的固体从750 ml的IPA 中重结晶。过滤固体，用IPA洗涤2次，乙醚洗涤2次。在40。C下真空干燥 产物(化合物4)(产量=13.5g)。产率90% 。纯度>95%。13C丽R (CDC13) 5 25.1 (-CH2CH2-)， 42,0 (-NCH3)， 54.8-54.9 (-CH2NCH2-)， 58.5 (-OCH3), 68.8-71.4 (OCH2CH20在PEG中)，165.3 (-C=0)， 168.5 (-0=CNO0-).实施例4PEG-肌氨酸-ASN-酶伴随快速搅拌，将PEG与蛋白质的反应摩尔比为100:1的PEG粉末加 入到在0.1 M磷酸钠中的5 ml的5 mg/ml天门冬酰胺酶(Elspar-Merck)中, pH7.6。反应在N2下，在30。C下进行60分钟，通过降低pH至6.0停止反 应，或立即在空间排阻柱色谱(size exclusion column)上纯化。反应混合物用20 mM磷酸钠，pH 6.0稀释至50 ml,通过0.45 过 滤器过滤，并在HiLoad Superdex 200柱(Amersham, NJ)上分离。该柱在140 mM的NaCl， 20 mM的NaP, pH 6.0中平衡，且轭合物以10 ml/级分/分钟 洗脱出来。在SDS-PAGE上收集被鉴定的峰的级分，并使用Ultrafree 30K (Millipore Corp., Bedford, MA)浓缩得到PEG-肌氨酸-ASN酶。实施例5PEG-肌氨酸-寡核苷酸(Genasense)向Genasense (25 mg， 3.9 (amol) (Genta， Berekeley Heights, New Jersey) 在PBS緩冲剂(5 mL, pH 7.8)中的溶液中加入mPEG-肌氨酸NHS 4 (150 mg: 39)Limo1)，并在室温搅拌5小时。反应溶液用DCM(3xl0mL)和盐水(10mL) 萃取，然后干燥合并的有机层(MgS04)，过滤，然后减压下蒸发溶剂。将残 余物溶于2倍的蒸馏水(5mL)中，并负载到DEAE快速流动的，弱离子交换柱 (27 mm x 250 mm,柱床体积~ 50 mL)上，该柱用20 mM的Tris-HCl緩沖液， pH7.4预平衡。未反应的PEG连接基用水(3至4倍柱体积)洗脱，然后产物被梯度洗脱，洗脱条件为经10分钟，0-100%的1 M NaCl在20 mM Tris-HCl緩冲 液中的溶液，pH7.4;然后100%的1 MNaCl在20mMTris-HCl緩冲液中的 溶液，pH7.4,以3mL/分钟的流速维持10分钟。收集含有纯产物的馏分，并 用Amicon搅拌的细胞浓缩器(stirred cell concentrator), 4吏用分子量截止为 5000的Ultmce11膜脱盐，然后冻干所得溶液以得到纯PEG-^t^酸-Genasense (15.7 mg, 2.42 |amol, 60 %)。 ESI-MS测得释放的寡核苦酸的质量为5879.1 ， 计算质量为5879.8。比较例6-7为了证明本发明提供了提高的纯度，检索到美国专利5,730,990的实施 例10-11中所述的合成方法。如下所示 实施例6合成mPEG-肌氨酸将5k mPEG-Cl (25 g， 4.98 mmol)加入到N-曱基甘氨酸(肌氨酸)在NaOH 溶液(150ml，0.33M)中的溶液中，然后将混合物置于密封的聚丙烯瓶中，并 在75。C下加热4天。将反应混合物冷却至室温，并用稀HCl将pH调节至 6.0/6.5。该水溶液用CH2Cl2萃取，并在减压下除去溶剂。所得固体从2-丙醇 中重结晶以得到标题化合物，产率77%。 13C画R: (CDC13) S; 41.31 (NCH3); 54.57 (CH2N); 57.85 (CH2C); 58.04 (OCH3); 167.98 (CO)。通过"C-丽R检 测，纯度为 80%。实施例7制备5kmPEG-肌氨酸NHS:将5k mPEG-肌氨酸(18 g， 3.55 mmol)溶于无水二氯曱烷(90 ml)中，然 后加入N-羟基-琥珀酰亚胺(612 mg, 5.32 mmol)和二异丙基碳二亚胺(671 mg， 5.32 mmol)。该混合物在室温下搅拌过夜。过滤所得固体，并在真空中 除去溶剂。粗产物从2-丙醇中重结晶以得到标题化合物，产率94%。 13C NMR: (CDC13) 5; 24.73 (CH2琥珀酰亚胺)；41.60 (N-CH3); 54.57 (NCH2); 54.44 (CH2C); 58.11 (OCH3); 165.13 (CO) 168.48 (C琥珀酰亚胺)。检测纯度为约 80%。比较结果方法PEG-N-COOH的纯度％-PEG-C1作为LG,以延长的反应时间和高温 80%PEG-OTs作为LG (新)，以较短的反应时间和较 低的反应温度〉95%从上述内容可见，通过使用本文描述的方法明显提高了纯度，且可以有效制备C-GMP级活化的聚合物。
权利要求
1.制备在其上含有孤电子对部分的聚合物的方法，该方法包括在碱的水溶液中，温度约10至约80℃下，使式(I)的聚合物与在其上具有含孤电子对基团的化合物反应，反应时间少于约24小时，R2-R1-(L1)n-LG(I)式(I)中R1为基本上非抗原性的聚合物；R2为封端基团，LG或LG-(L1)n-；L1为双功能连接基；LG为离去基团；和n＝0或正整数。
2. 权利要求1的方法，其中所述温度为约30至约60°C。
3. 权利要求1的方法，其中所述反应时间少于约18小时。
4. 权利要求1的方法，其中LG选自其中R3为曱基、卤素、硝基、氟曱基、二氟曱基、三氟曱基、被取代 的羧基、或多卣素取代的苯磺酰基；曱磺酸基、对溴苯磺酸基、三氟乙磺酸基和对硝基苯磺酸基。
5.权利要求6的方法，其中LG为
6. 权利要求1的方法，其中R2为甲氧基。
7. 权利要求1的方法，其中所述在其上含有孤电子对基团的化合物为<formula>formula see original document page 3</formula>(III)其中Z为O、 S或NR7; X为O、 S或NR8; m为正整数；且R4、 R5、 R6、 R7和Rs独立地选自H、 d—6烷基、C3-12支链烷基、C3-8 环烷基、Cl6取代的坑基，(:3.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 d-6杂烷基、取代的d.6杂烷基、C,-6烷氧基、苯氧基和d-6杂烷氧基； 条件是当Z为NR7时，R4和R7不都为H。
8. 权利要求7的方法，其中X为O， m为l， R4为曱基，且R5和R6每 个为H。
9. 权利要求7的方法，其中所述式(III)化合物为N-曱基-甘氨酸(肌氨酸)。
10. 权利要求1的方法，其中112为<formula>formula see original document page 3</formula>
11. 权利要求l的方法，其中R,为聚环氧烷。
12. 权利要求l的方法，其中所述式(I)的聚合物选自<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>j为约10至约340的整数； x为约10至约2,300的整数； L!、 L2和L3为双功能连接基；且 z为1至约120的整数。
13. 权利要求12的方法，其中所述聚环氧烷为下式的聚乙二醇-CH2CH2-0-(CH2CH20)x-CH2CH2 -其中x为约10至约2,300的整数。
14. 权利要求1的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有约200 至约100,000道尔顿的重均分子量。
15. 权利要求14的方法，其中所述基本上非抗原性的聚合物具有约 2，000至约48,000道尔顿的重均分子量。
16. 权利要求l的方法，其中所述式(I)的聚合物为<formula>formula see original document page 6</formula>其中R2为曱氧基；且 R,为聚环氧烷。
17. 权利要求16的方法，其中R,为聚乙二醇。
18. 权利要求1的方法，其中所述碱的水溶液选自NaOH、 KOH、 LiOH、 Mg(OH)2、 Ca(OH)2及其混合物。
19. 权利要求18的方法，其中所述碱的水溶液包括NaOH。
20. 权利要求7的方法，其中所述在其上含有孤电子对部分的聚合物选自<formula>formula see original document page 6</formula>和<formula>formula see original document page 6</formula>
21. 权利要求1的方法，该方法还包括使在其上含有孤电子对部分的 聚合物与在其上具有活化基团的化合物反应形成活化的在其上含有孤电子 对部分的聚合物。
22. 权利要求21的方法，其中所述活化的在其上含有孤电子对部分的 聚合物为
23. 权利要求21的方法，其中所述在其上具有活化基团的化合物具有能与亲核基团反应的官能团。
24. 权利要求1的方法，其中通过所述方法形成的在其上含有孤电子 对部分的聚合物的纯度大于95%。
25. 权利要求1的方法，其中通过所述方法形成的在其上含有孤电子 对部分的聚合物的纯度大于98%。
26. 权利要求22的方法，该方法还包括在足以形成轭合物的条件下使与天门冬酰胺酶反应。
27. 权利要求26的方法，其中所述天门冬酰胺酶来自重组的来源。
全文摘要
本发明公开了以高纯度制备基本上非抗原性的聚合物的方法，该聚合物具有含孤电子对的部分。所述聚合物用作合成胺-基的聚合物和对于与亲核物质轭合形成活化聚合物的中间体。本发明公开了轭合物和制备方法以及用这些轭合物的治疗。得到的聚合物-胺足够纯使得避免了药物级别聚合物所需的昂贵的和费时的纯化步骤。
文档编号A61K38/16GK101405018SQ200780009499
公开日2009年4月8日 申请日期2007年1月8日 优先权日2006年1月17日
发明者乌德春, 洪 赵 申请人:安佐制药股份有限公司