环化α-芋螺毒素肽的制作方法

专利名称：：环化α-芋螺毒素肽的制作方法环化a-芋螺毒素肽
背景技术：
：本发明涉及cx-芋螺毒素肽，特别是用于治疗人类疾病的环化cx-芋螺毒素肽。本发明特别涉及包含这些肽的口服和肠内制剂，这些肽在制备药物制剂中的用途，以及这种药物制剂在预防或治疗人类病况或疾病中的用途。芋螺类(Qwm)(锥型蜗牛)的海螺使用一种复杂的生化技巧来捕捉猎物。作为鱼，螺纹虫或其它软体动物的捕食者，锥形蜗牛给它们的猎物注射一种含有生物活性小肽的鸡尾酒的毒液。这些毒素分子，也就是芋螺毒素，可通过耙向多种离子通道或受体来干扰祌经传递。它们通常含有以线性排列的12到30个氨基酸。每一种芋螺类的毒素可能含有超过100种不同的肽。芋螺毒素可依据它们的生理识别目标分类。例如，a-芋螺毒素和V-芋螺毒素靶向尼古丁乙酰胆碱受体(nAchR)，导致神经节和神经肌肉的阻塞，而co-芋螺毒素靶向对电压敏感的钙(Ca2+)离子通道，抑制神经传递的释放。大多数芋螺毒素肽含有四(4)个或六(6)个结合成对的半胱氨酸残基，由此分别形成两(2)个或三(3)个二硫键，但也有两个半胱氨酸残基结合形成一个二硫键的(即conopressins)，或有多于三个二硫键的，还有没有半胱氨酸残基或二硫键的例子。一些上述的"活性"类型的肽包含由同样数量的半胱氨酸残基和同样的二硫键连接方式组成的结构模式。基于这个原因，开始发展一种新的"超家族"的分类系统。例如，co-芋螺毒素以及S-和(i-芋螺毒素类的成员们具有结合成对的六个半胱氨酸残基以在半胱氨酸残基I和IV，II和V，III和VI之间形成的三个二硫键，其中六个罗马字符表示从N-末端数起的六个半胱氨酸残基。具有这个结构模式的芋螺毒素属于芋螺毒素的O-超家族和M-超家族。同样的，p-芋螺毒素和大部分a-芋螺毒素具有结合成对的四个半胱氨酸残基以在半胱氨酸I和III，II和IV之间形成两个二硫键。这些芋螺毒素肽属于芋螺毒素的"A-超家族"。本发明涉及A-超6家族巾的a-芋螺毒素，也就是在半胱氨酸残基i和ni，ii禾niv之间形成的两个二硫键的(x-芋螺毒素肽。如前文所提到的，芋螺毒素肽与一系列不同的哺乳动物离子通道受体结合，相应地它们具有很多潜在的治疗上的应用，包括对人的止痛作用。然而，通常使用肽作为药物有一定的难度，包括一般较差的生物可行性，由蛋白酶分裂的敏感性，以及不希望的副作用。一类cd-芋螺毒素，MVIIA(也被称做SNX-lll，Zicontide和Prialt)，最近被美国食品及药物管理局批准可治疗伴随癌症，艾滋病和神经病的顽固性疼痛。鉴于上文提到的肽作为药物的难度以及由这种药物靶向的受体位于中央神经系统(CNS)，用药途径目前限于鞘内注入到脊髓。另一类已在进行临床试验的(d-芋螺毒素是CVID(AM336-ZenythPharmaceuticals),据报道该药具有较之Ziconitide从P/Q-型中选择N-型钙离子通道的改进选择性。然而，即使有了改进的对特定受体/通道的选择性，co类的芋螺毒素还伴随有对一些患者产生的不受欢迎的副作用。其他两种芋螺毒素(从地纹芋螺Com"geograp/nw中分离出的CGX-1160和CGX-1007)也正在临床试验中，然而，这些肽的用药方法也局限于鞘内途径。另一种正在研究的用于止痛的芋螺毒素是x类的(Xen2174-XenomeLtd)。同样，这种肽的用药方法也局限于鞘内途径。鞘内或脊柱用药的主要不利之处是必须由医生或护士来注入药物，而且用于长期治疗时，一种机械传导系统和脊柱导管要被优选地插入患者的脊柱。因此，此类治疗通常留给身患绝症和/或长期住院的患^"。a-芋螺毒素是芋螺毒素的一个亚类，大小通常为12到16个氨基酸，而且通常含有酰胺化的C-末端。(x-芋螺毒素已知可抑制尼古丁乙酰胆碱受体。a-芋螺毒素与肌肉和神经尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)都有作用，nAChR在一系列机能紊乱病症(包括阿尔茨海默氏早老性痴呆症，精神分裂症，抑郁症和小细胞肺癌)中已被发现，且还被发现在痛觉缺失和癖嗜中起作用。ct-芋螺毒素肽及其潜在的用途在科技文献中被广泛描述(参考LloydandWilliams,2000,JPharmacolExpTher292(2)461)。半胱氨酸残基之间的残基数用来区分不同类别的a-芋螺毒素。根据第二个和第三个半胱氨酸残基(环路1)与第三个和第四个半胱氨酸残基(环路2)之间的残基数，a-芋螺毒素可分为a3/5，a4/3，a4/4，a4/6和a4/7结构亚族。MII和Vcl.l(也称作ACVI-MetabolicPharmaceuticalsLimited)是有4/7环排列的a-芋螺毒素肽的两个例子。最小的a-芋螺毒素肽之一是具有4/3环路排列的IM1。儿种a-芋螺毒素肽己被研究来确定他们对不同亚族nAChR的选择性，特别是它们相对中央亚族对外周nAChR亚族的选择性。在整个CNS和外周神经系统(PNS)以较低程度表达nAChR，但不同的亚族有不同的分布。哺乳动物nAChR由亚单位的组合构成。七种亚单位(a2，a3，a4，a6，a7，a9禾na10)是牵涉到配体结合的主要成分，另四种亚单位(a5，(32，(33和(34)被认为是结构上的，给予受体功能和药理上的性质。不同的亚单位以多种方式组合(通常是以异种的五聚物)而形成具有特定的药理和电生理性质的受体。a3亚单位被认为是一种外周亚单位(由于存在于PNS),而a7亚单位被认为是在CNS里常见的亚单位。最初通过使用来自维多利亚芋螺Cowmv/cton'ae的毒液管的cDNA中的PCR筛选发现a-芋螺毒素Vcl.l(Sandall等人Biochemistry,2003，42,6904)。Vcl.l序列中的半胱氨酸间距显示它是a-芋螺毒素的4/7亚族的一种，该族包括已被深入研究的芋螺毒素Mil,Epl和PnIB。Vcl.l的三维结构包含一个小的跨距从P6到Dll的(x-螺旋残基，并被在其他a-芋螺毒素中均可见到的I-II，III-IV二硫键连接方式所支持(Clark等人，J.BiolChem.2006,281,23254)。除了在大多数ct-芋螺毒素中常见的酰胺化的C-末端，在线性的Vcl.l中，脯氨酸Pro6和谷氨酸Glu14还可能被相应地翻译后修饰成羟脯氨酸和Y-羧基谷氨酸。这种Vcl.l的翻译后修饰类似物涉及到神经再生，而不是疼痛(WO02/079236)。线性Vcl.l，牛嗜铬细胞中的神经nAChR的拮抗剂，在三个人类神经痛疾病的大鼠模型中显示出减缓神经痛，并可加速受损神经元的功能恢复(Satkunanathan等人,2005,BrainResearch1059(2)149-158)。此外，Livett等人还报告过ACV-1在糖尿病性神经病动物模型中可有效减缓神经痛。特别是在链脲霉素-诱导的外周神经病的糖尿病大鼠模型中，在ACV-1用药量30到300pg/kg，用药一小时内可观察到抗痛觉超每女的效果(IDrugs，15thWorldCongressonAnimal,PlantandMicrobialToxins,20069,<579-幼7)。作为镇痛药，据报告Vcl.l比Ziconotide更有活性(Sandall等人，2003，Biochemistry,42,6904-6911)。最近，显示出Vcl.l拮抗在分离出的人外周神经片段中去髓C-纤维轴突的由尼古丁-诱发升高的轴突兴奋性(Lang等人，2005，Neuroreport16,479-483)。如前文所提到的，祌经nAChR是由在CNS和PNS随处可见的a(a2到alO)和(3(f32到p4)亚单位的组合所构成的五聚体型配体门离子通道。电生理和免疫组织化学实验结果显示了由oG，a5和(34亚单位，而不是由a4，(32或a7亚单位组成的神经nAChR在去髓C-纤维轴突的功能性表达(Lang等人，2005，Neuroreport16，479-483;和Lang等人，2003，Neurophysiol90，3295-3303)。对神经nAChR在去髓外围神经纤维的阻断可以对去髓的交感神经轴突和/或感觉神经轴突有止痛效果。有趣的是，在嗜铬细胞中，合成的翻译后修饰的Vcl.l(ptmVc.1)被发现不再抑制对尼古丁的神经型反应，在两种大鼠神经痛症的试验中，该合成的翻译后修饰的Vcl.l也不再有活性。线性Vcl.l或ACV1已经开始了第二阶段的人类临床试验。尼古丁类的显效药曾被报道具有止痛活性。这样的显效药的例子是地棘蛙素(epibatadine)和ABT-594。条件是，这类药物通过降低对尼古丁受体的敏感度，造成通过这些受体的离子流量的减少。在这种条件下，这些显效药成了抗nAChR的有效的拮抗剂，因为此种原因，nAChR的拮抗剂被认为可以作为潜在的止痛化合物。芋螺毒素肽Vcl.l就被认为是这样的一种拮抗剂。有趣的是，对Vcl.l,在nAChR的a3，p4亚单位的IC50数值是在微摩尔的范围内(4.2(iM;Vinvcler等人，2006，PNAS，103，17881)。在体内，Vcl.l的止痛效果是在纳摩尔的浓度下出现。近来，有报道认为Vcl.l可以通过调制a9，alOnAChR来产生止痛作用(Vincler等人，supra)。Vcl.l对a9，alOnAChR的亲和力高于对a3，(34的100倍，而且是在纳摩的范围里(22.9nM)。因此，Vcl.l的一个生理靶标可以是已知分布广泛且位于背根的节神经元中、脑垂体中、淋巴细胞、皮肤角化细胞和精子中的a9，(xl0nAChR。然而，可以想象到，还可能有其他未被发现的耙标负责Vcl.l的止痛活性。与以前研究用来止痛或治疗其他情况的芋螺毒素肽不同，Vcl.l据称具有不必使用鞘内注射，而是皮下或肌内注射的优势。也就是说Vcl.l提供了显著优于其他芋螺毒素肽，包括Ziconitide的优势。然而，认为芋螺毒素肽Vcl.l缺少口服的生物可行性。根据日期是2006年1月发表在MetabolicPharmaceuticals的网站上的文献"ACV1-Anoveltherapeuticforneuropathicpain,TechnicalSummaryofPreclinicalData",ACV1不能口服，目前的发展是皮下注射疗法。还报道Vcl.l对一种炎症性疼痛的动物模型有效，并能加速受伤祌经和组织的康复。在MetabolicPharmaceuticalsLimited名下的WO2007/014432中，描述了一种通过将人类生长激素及其类似物的C-末端序列与肽药物的C-末端连接而改进肽药物的口服传递的方法。为肽药物加上人类生长激素c-末端序列据称给肽药物带来了口服的生物可行性。该专利申请描述了一种在神经痛症动物模型里显示具有活性的可口服的肽药物。肽药物包含具有连接于Vcl.lC-末端的氨基酸序列Tyr-Leu-Arg-lle-Val的Vcl.l。相应地，目前仍需要可通过口服或肠内用药的用oc-芋螺毒素治疗患者的有效方法，特别涉及产生止痛作用，治疗或预防神经痛症以及加速受损神经的康复。
发明内容本发明依据一项令人惊讶的发现，以产生一种具有酰胺环化骨架的化合物的cx-芋螺毒素肽的环化反应会引起具有口服药效的环化肽。相应地，在第一方面，本发明提供了一种口服或肠内用药的药物制剂，该药物制剂包含至少一条带有酰胺环化骨架的合成环化a-芋螺毒素肽，以使肽不含有游离的N-或C-末端，该肽包含结合成对的四个半胱氨酸残基以形成两个二硫键，其中在药学上适于口服或肠内用药的载体中，相应的线性/非环化芋螺毒素肽的N-末端由一个肽接头连接到C-末端。10优选地，肽接头为跨越于半胱氨酸残基I和IV之间的6到8个天然或非天然氨基酸。本发明进一歩提供一种治疗或预防疼痛的方法，该方法包括口服或肠内使用上述药物制剂的步骤。在另一具体实施方式中，本发明提供一种加速受损神经康复的方法，该方法包括口服或肠内使用上述药物制剂的步骤。木发明进一歩提供一种治疗或预防阿尔茨海默氏早老性痴呆症、精神分裂症、抑郁症、癲痫、小细胞肺癌、心血管紊乱、胃动力紊乱、尿失禁、尼古丁嗜癖、情绪病(例如躁郁症、单极性忧郁症、胸腺机能障碍、妥瑞氏综合症(TouretteSyndrome)和季节性情绪失调)或炎症的方法，该方法包括口服或肠内使用上述药物制剂的歩骤。在另一具体实施方式中，本发明提供环化a-芋螺毒素肽在制造用于治疗或预防疼痛或用于加速受损神经康复的口服或肠内使用的药物中的用途。本发明还提供环化(x-芋螺毒素肽在制造用于治疗或预防阿尔茨海默氏早老性痴呆症、精神分裂症、抑郁症、癫痫、小细胞肿癌、心血管紊乱、胃动力紊乱、尿失禁、尼古丁嗜癖、情绪病(例如躁郁症，单极性忧郁症、妥瑞氏综合症、胸腺机能障碍和季节性情绪失调)或炎症的口服或肠内使用的药物中的用途。优选具体实施方式的描述(x-芋螺毒素是芋螺毒素中很大的一类，文献中有对上百个例子的描述。大部分a-芋螺毒素肽是A-超家族的成员，具有在半胱氨酸残基I和III，II和IV之间形成两个二硫键的结合成对的四个半胱氨酸残基。表1中列举了--些文献中描述过的a-芋螺毒素肽的例子。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>上表中的Y代表Y-羧基谷氨酸，0代表4-羟脯氨酸。其余符号是常用代表自然生成的氨基酸。大部分上述肽具有一个酰胺化的C-末端。利用环化芋螺毒素肽来改进稳定性最先是由Craik等人在1999年9月14日中请的国际专利中请PCT/AU99/00769(WO00/15654)中提出的。相应地，根据本发明配制的环化(x-芋螺毒素可使用上述专利申请中描述的方法制备，全文引入作为参考。除非另行要求，此处当术语"线性"与芋螺毒素肽在一起使用时表示肽是在一个非环化的状态，也就是N-末端与C-末端不键连在一起(直接或通过接头)形成酰胺环化的骨架。尽管ct-芋螺毒素肽中的一个或多个二硫键的存在会给肽引入一定程度的环性，但如果没有通过由N-末端与C-末端键连形成的肽骨架的环化，有二硫键的肽仍被认为是"线性"的。此处使用的术语"口服/肠内的生物可行性"，"口服/肠内用药"，"适于口服/肠内用药"和"口服功效"是指通过口或肠内的途径使用环化肽以提供药学相关效果的能力，如治疗或预防疼痛、阿尔茨海默氏早老性痴呆症等，或加速受损神经的康复。尽管认为效果是通过由肽和它的假想的目标靶标相互作用而发生的，该术语并无意图来强加这样一个对本发明范围的限制。其他的或替代的目标耙标可以在体内在生理上进行参与，而且肽代谢物也可以参与提供药学相关效果。例如，已知止痛药吗啡通过与阿片类(opioid)受体结合并随后调控钙离子和/或钾离子通道来进行作用。线性ot-芋螺毒素肽可以是任何能够环化的cx-芋螺毒素肽。它可以是具有天然发生的a-芋螺毒素肽的序列，或它可以是其衍生物。优选地，a-芋螺毒素肽应为在其非环化的形式中具有对哺乳动物，譬如人的治疗活性。鉴于肽的环化具有改变肽活性或引入新活性的潜能，有可能一些环化的芋螺毒素肽较"线性"的芋螺毒素有更为改进的治疗性质。在有些情况中，环化的芋螺毒素肽会有与线性的a-芋螺毒素不同的二硫键连接方式。例如cysi到iv，n至i」in(带状构造)的连接方式和cysi到n，in到iv(珠串结构)的连接方式。肽还可用异构体的结合来表示。根据本发明的一个具体实施方式，可被环化的线性Ot-芋螺毒素肽是包含以下序列的4/7或4/6肽X叫CCSXaa2PX叫CX叫X叫X叫X聊X鄉X叫X叫oCSEQIDNO:l其屮Xaa,是甘氨酸或天冬氨酸，Xa&到Xaa7代表任何天然生成或非天然氨基酸，Xaas代表脯氨酸，羟脯氨酸或谷氨酰胺，Xaag代表天冬氨酸，谷氨酸或Y-羧基谷氨酸，且Xaa,。代表任何天然生成或非天然氨基酸或可以缺失。更优选地，Xaa,到Xaa,o可选自下述的Xaa,是甘氨酸或天冬氨酸，Xaa2选自天冬氨酸、天冬酰胺、组氨酸、酪氨酸、精氨酸或赖氨酸，更优选地，选自天冬氨酸、天冬酰胺或组氨酸，最优选地，天冬氨酸，Xaa;选自精氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸，更优选地，选自精氨酸、脯氨酸或丙氨酸，最优选地，精氨酸，Xaa4选fi天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸或赖氨酸，更优选地，选自天冬酰胺、丙氨酸或酪氨酸，最优选地，天冬酰胺，X犯5选自酪氨酸、组氨酸、丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、硫堇、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸或精氨酸，更优选地，亲水的氨基酸残基，最优选地，酪氨酸，Xaa6选自天冬氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸或组氨酸，更优选地，选自天冬氨酸或天冬酰胺，最优选地，天冬氨酸，Xaa7选自组氨酸、天冬酰胺或酪氨酸，更优选地，组氨酸，Xaas选自脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺或丝氨酸，更优选地，脯氨酸，Xaa9选自谷氨酸、7-羧基谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸或天冬酰胺，更优选地，选自谷氨酸、Y-羧基谷氨酸，最优选地，谷氨酸，Xaa,o选自异亮氨酸、酪氨酸、亮氨酸或des-Xaa1Q，更优选地，异亮氨酸，特别优选的具体实施方式为Xaa,是甘氨酸或天冬氨酸，Xaa2是天冬氨酸，Xaa3是精氨酸，Xaa4是天冬酰胺，Xaa5是酪氨酸，Xaa6是天冬氨酸，Xaa7是组氨酸，Xaa8是脯氨酸，Xaa9是谷氨酸，Xaa,。是异亮氨酸，在优选的具体实施方式中，用于环化的线性oi-芋螺毒素肽是(x4/7芋螺毒素肽。肽对特定的nAChR亚单位具有选择性。例如，肽具有相对于nAChR的a7亚型选择a3或a9/al0亚型的能力。在进一歩优选的具体实施方式中，用于环化的线性a-芋螺毒素肽是Vcl.l。尽管有些时候可能天然生成的ct-芋螺毒素肽或其衍生物的N-和C-末端不需要附加的键连部分而直接相连，但是根据本发明的环化的芋螺毒素肽通常是由一条N-和C-末端通过一个键连部分连在一起的a-芋螺毒素肽组成的。如果存在，键连部分可以是一个肽接头，以使环化反应产生酰胺环化肽骨架。这些肽不再具有游离的N-或C-末端。键连部分的肽序列有相当多的变异是可能的。鉴于该键连区域并无必要与(x-芋螺毒素的主要活性位点结合或使其闭塞，可以改进该键连区域从而改变芋螺毒素的生理化学性质，潜在地减弱芋螺毒素的副作用。在一些情况下，键连芋螺毒素的N-或C-末端时会有必要或有需要去掉或改进一个或多个N-或C-末端残基。这种对线性芋螺毒素序列的改进是在本发明的范围之内的。例如，如果线性芋螺毒素末端的正负电性都对其活性很重要，那么经过环化时丢失的正负电性可通过带有正或负侧链的氨基酸分站，如甘氨酸或谷氨酸来补救。有必要地，键连部分应有足够的长度来跨越芋螺毒素肽N-和C-末端之间的距离。在有肽接头的情况下，键连部分长度通常是2到10个氨基酸的阶数。有些情况可能需要更长或更短的肽接头。在一个具体实施方式中，键连部分是由甘氨酸和/或丙氨酸残基以及己经存在于线性ct-芋螺毒素中的其他的氨基酸残基组成。对于A超家族的oc-芋螺毒素肽，己经发现半胱氨酸残基I和IV之间的距离是充分守恒的。对于这类芋螺毒素肽，为允许键角和键长，接头的长度优选为在半胱氨酸I和IV之间的6到8个氨基酸。相应地，对于oc-芋螺毒素Vcl.l和MII，接头所需的其他氨基酸残基应为5到7个，从而允许N-末端己经存在的单个氨基酸。相应地，在进一方面中，本发明使用了具有酰胺环化骨架的合成环化(x-芋螺毒素肽，以使肽没有游离的N-或C-末端，所述肽含有结合成对的四个半胱氨酸以形成两个二硫键，其中相应的线性/非环化的芋螺毒素的N-末端由一个肽接头与其C-末端相连，该接头由半胱氨酸残基I和IV之间的6到8个氨基酸残基组成。优选地，接头的氨基酸数量选择为在半胱氨酸残基I和IV之间有7个氨基酸。根据线性肽的序列，一部分或全部残基来自线性序列。相应地，如果芋螺毒素肽的N-末端具有--个氨基酸紧连着第一个半胱氨酸残基，接头所要求的其他氨基酸的数量应为6个。当然，还可能替换一个或多个N-末端的残基为其他可形成接头一部分的残基。根据本发明，通过选择特定大小和/或类型的肽接头可能改进或加强芋螺毒素肽的活性。在芋螺毒素肽构造上通过引入键连基团而导致的小变化会改变肽特定结合位点的结合亲和力。相反，当活性要求与母芋螺毒素肽最为接近时，要选择构造上变化最小的接头。接头还可以为肽提供一个基本上不干扰其主要生物效果的"把手"。接头提供功能化分子以改进生理或生物药理性质(包括穿越生物膜的能力，如可能必要地提供由口导入的生物活性)的场所。线性芋螺毒素肽可通过几种方式环化。它们包括以下几种1.还原肽的环化后氧化以形成所需的二硫键。在此方法中，一条加长的线性肽最先"在树脂上"用固态的肽合成方法合成。该加长的线性肽包含从处在或靠近N-末端的半胱氨酸残基开始的基础序列(nativesequence)和含有新的键连部分的加长的C-末端。固态合成实际上以相反的顺序起始，也就是从加长线性肽的C-末端起始。从树脂分裂以后，加长的芋螺毒素环化成硫酯中间产物，并接下来重排成酰胺-环化肽。接着氧化该还原的肽以形成二硫键。图l显示关于环化反应的示意图。线性肽从树脂分裂下来时，接头和树脂(R)仍然是连接着的。R代表介于肽和树脂之间的接头，且与用于环化作用中的键连部分不同。第一个反应涉及在N-末端的硫醇和羧基末端之间硫酯的形成。硫酯接着进行硫，氮酰基的迁移以形成具有基础肽键的环化肽。2.还原线性肽的氧化，然后环化在此方法中，加长的肽是由固态肽合成法集合而成。加长的线性肽包含基础的芋螺毒素序列以及加在N-和/或C-末端的额外残基。(新的)N和C末端应优选为甘氨酸残基。肽折褶起来，而且在类似芋螺毒素肽的情况下，折褶后的分子的末端通常在空间上靠得很近。这促使肽用标准的化学方法在溶液中的环化。当序列屮有大量的赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸存在时，可能发生并发症(complications),于是方法1是优选的。3.将接头连接到已存在的芋螺毒素，然后环化此方法中，起始原料是成熟的芋螺毒素。肽接头合成后，使用连接肽的公开歩骤将其连接到芋螺毒素上。加长的肽继而环化和氧化。在上述方法中，可以以各种顺序进行步骤来提供具有所需二硫键的环化(x-芋螺毒素肽的产物。例如，方法].中，分裂步骤和环化歩骤可以同时进行或以不同的顺序进行。同样地，方法2中，环化和折褶步骤可以同时进行或以不同的顺序进行。还可能选择性地利用半胱氨酸残基上的保护基团来形成二硫键。对半胱氨酸残基以这种方式有选择的保护允许特定二硫键模式的产生。能保护半胱氨酸残基的基团有乙酰胺甲基(Acm)、4-甲基苯甲醇(MeBzl)和4-对甲氧基节基(Mob)。而且，考虑到最终产物的环化性质，合成步骤可以涉及到(X-芋螺毒素肽或加长的肽/接头的序列的环化的置换(permutation)。例如，可以通过在C-末端添加接头，环化改变N-末端的残基到C-末端，从而提供N-末端半胱氨酸，并按所述环化开始为ot-芋螺毒素的加长线性肽的设计。此处与自然生成的芋螺毒素肽有联系的术语"衍生物"，例如MII，是指通过一个或多个氨基酸的删除、添加、取代或侧链改变而与自然生成的肽所不同的肽。取代强调其中一个氨基酸被不同的、自然生成的氨基酸或非常规的氨基酸残基替换的氨基酸的改变。这种取代可被归类为"保守类"，其中，包含在多肽中的氨基酸残基被另一个具有类似的性质(无论极性、侧链功能性还是大小)的自然生成的氨基酸所代替。例如，Ser"ThrHProHHypHGly"Ala,VaWIleHLeu，His^LysHArg,Asn^GlnHAspHGlu或PheHTrpHTyr。据认为一些非常规的氨基酸也可作为自然生成氨基酸的合适替代物。例如，鸟氨酸，高精氨酸和二甲基赖氨酸可替代His,Arg和Lys。本发明包括的取代也可为"非常规"，其中，存在于多肽的氨基酸残基可被具有不同性质的氨基酸，如属于不同类别(例如，用丙氨酸取代带电的或亲水的氨基酸)或用非常规的氨基酸替代自然生成的氨基酸的自然生成的氨基酸所替代。氨基酸取代通常是单个残基，也可为多个残基，成群的或分散的。优选地，氨基酸取代是保守的。添加包括添加一个或多个自然生成的或非常规的氨基酸残基。删除包括删除一个或多个氨基酸残基。如上所述，本发明包括氨基酸的一个或多个发生侧链修饰的肽。本发明所预期的侧链修饰包括氨基酸基团的修饰，如与醛反应发生还原烷基化，接着被NaBH4还原；用乙亚氨酸甲酯脒基化；用醋酸酐酰化；用氰酸盐甲氨酰化氨基酸基团；用2，4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苯化氨基酸基团；用琥珀酸酐和四氢苯酐酰化氨基酸基团，并用磷酸吡哆醛来吡哆化(pyridoxylation)赖氨酸，接着被NaBH4还原。可以用例如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛的试剂形成杂环縮合产物来修饰丙氨酸的硫氰酸胍基团。可以通过形成O-acylisourea及后续的柱后衍生的方式碳二亚胺活化修饰羧基，例如，成相应的酰胺。可用例如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；用其他巯基化合物形成混合二硫键；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他可取代的马来酰亚胺反应；用4-氯代汞基苯甲酸盐、4-氯代汞基苯基磺酸、氯化苯基汞、2-氯代汞基-4-硝基苯酚和其他荥化物形成含汞衍生物；氰酸盐在碱性pH下甲氨酰化的方法修饰巯基基团。任何对半胱氨酸残基的修饰务必不能影响肽形成二硫键的能力。也可能替换半胱氨酸的巯基基团为硒等同物，以使肽形成代替一个或多个二硫键的二硒键。通过，例如，N-溴代琥珀酰亚胺的氧化作用或2-羟基-5-硝基苯甲基溴或卤化磺酸苯基对刚哚环的烷化作用修饰色氨酸残基。此外，可通过四硝基甲烷的硝化作用修饰酪氨酸残基以形成3-硝基酪氨酸衍生物。由碘乙酸衍生物的烷化作用或焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化作用来进行对组氨酸残基的咪唑环的修饰。例如，在4-位上羟基化修饰脯氨酸残基。表2列举了一些具有修饰侧链的氨基酸和其他非天然氨基酸。表2非常规氨基酸L-a-氨基丁酸a-氨基-cx-甲基丁酸羧酸氨基环丙垸酯氨基异丁酸羧酸氨基降冰片酯环乙基丙氨酸环戊基丙氨酸D-丙氨酸D-精氨酸D-天冬酰胺编码非常规氨基酸AbuMgabuC.proAibNorbChsxaCpenD八laDArgDAsn编码L-a-甲基组氨酸L-a-甲基异亮氨酸L-a-甲基亮氨酸L-a-甲基甲硫氨酸L-a-甲基正缬氨酸L-ot-甲基苯丙氨酸L-a-甲基丝氨酸L-a-甲基色氨酸L-a-甲基缬氨酸1^^-(2,2-二苯基乙基)-氨基甲酰甲基甘氨酸l-羧基-l-(2，2-二苯基乙酰基)环丙烷MhisMileMleuMmetMnv3MpheMserMtrpMvalNnbhmNmbcD-天冬氨酸DAspD-半胱氨酸DCysD-谷氨酰胺DGLnD-谷氨酸DGluD-组氨酸DHisD-异亮氨酸DIleD-亮氨酸DLeuD-赖氨酸DLysD-甲硫氨酸DMetD-鸟氨酸DOrnD-苯基丙氨酸DPheD-脯氨酸DProD-丝氨酸DSerD-苏氨酸DThrD-色氨酸DTrpD-酪氨酸DTyrD-缬氨酸DValD-a-甲基丙氨酸DMalaD-ot-甲基精氨酸DMargD-a-甲基天冬酰胺DMasnD-a-甲基天冬氨酸DMaspD-a-甲基半胱氨酸DMcysD-(x-甲基谷氨酰胺DMglnD-a-甲基组氨酸DMhisD-a-甲基异亮氨酸DMileD会甲基亮氨酸DMieuD-a-甲基赖氨酸DMlysD-a-甲基甲硫氨酸DMmetD-a-甲基鸟氨酸DMornD-a-甲基苯基丙氨酸DMpheD-cx-甲基脯氨酸DMproD-a-甲基丝氨酸DMserD-a-甲基苏氨酸DMThrD-tx-甲基色氨酸DMTrpD-a-甲基酪氨酸DMtyD-a-甲基缬氨酸DMvalL-N-甲基丙氨酸NmalaL-N-甲基精氨酸NmargL-N-甲基天冬氨酸NmaspL-N-甲基半胱氨酸NmcysL-N-甲基谷氨酰胺NmglnL-N-甲基谷氨酸NmgluL-N-甲基组氨酸NmhisL-N-甲基异亮氨酸NmileL-N-甲基亮氨酸NmleuL-N-甲基赖氨酸NmlysL-N-甲基甲硫氨酸NmmetL-N-甲基正亮氨酸NmnleL-N-甲基正缬氨酸NmnvaL-N-甲基鸟氨酸NmornL-N-甲基苯基丙氨酸NmpheL-N-甲基脯氨酸NmproL-N-甲基丝氨酸NmserL-N-甲基苏氨酸NmthrL-N-甲基色氨酸NmtrpL-N-甲基酪氨酸NmtyrL-N-甲基缬氨酸NmvalL-N-甲基乙基甘氨酸NmetgL-N-甲基叔丁基甘氨酸NmtbugL-正亮氨酸NleL-正缬氨酸Nvaa-甲基-氨基异丁酸甲酯Maibcc-甲基-Y-氨基异丁酸甲u^酉旨Mgabua_甲基_环乙基丙氨酸Mchexact-甲基-环戊基丙氨酸Mcpena-甲基-a-萘酯丙氨酸Manapa-甲基青霉素MpenN-(4-氨丁基)甘氨酸NgluN-(2-氨丁基)甘氨酸NaegN-(3-氨丙基)甘氨酸NornN-氨基-a-甲基丁酸NmaabuD-N-甲基丙氨酸D-N-甲基精氨酸D-N-甲基天冬酰胺D-N-甲基天冬氨酸D-N-甲基半胱氨酸D-N-甲基谷氨酰胺Y-羧基谷氨酸4-羟脯氨酸5-羟赖氨酸2-氨基苄(氨茴酰)环乙基丙氨酸苯甘氨酸4-苯基-苯丙氨酸L-瓜氨酸1^-1,2,3，4-四氢异喹啉-3-甲酸L-哌可酸(高脯氨酸)L-高亮氨酸L-赖氨酸(二甲基)L-萘酯丙氨酸L-二甲基多巴或L-二甲基羟基苯丙氨酸L-噻唑-4-甲酸L-高酪氨酸L-3-吡啶丙氨酸L-2-呋喃丙氨酸L-组氨酸(苄氧基甲基)L-组氨酸(3-甲基)D-N-甲基谷氨酸D-N-甲基组氨酸D-N-甲基异亮氨酸D-N-甲基亮氨酸D-N-甲基赖氨酸DNmalaa-萘酯丙氨酸Anap。N服rgN-苯基甘氨酸NphemN-(2-氨基甲酰乙基)甘氨\T,。Nmasn矿厶Ngln酉发DNmaspN-(氨基甲酰甲基)甘氨酸NasnDNmcysN-(2-羧基乙基)甘氨酸NgluDNmglnN-(羧基甲基)甘氨酸NaspGlaN-环丁基甘氨酸NcbutHypN-环葵基甘氨酸NcdecHlysN-环月桂基甘氨酸NcdodAbzN-环辛基甘氨酸NcoctN-环戊基甘氨酸NcproChaN-环H^—烷基甘氨酸NcimdPhgN-(2,2-二苯乙基)甘氨酸NbhmBibN-(3,3-二苯戊基)甘氨酸NbheCitN-(羟乙基)甘氨酸NserTicN-(唑基乙基)甘氨酸NhisN-(3-吲哚乙基)甘氨酸NhtrpPipN-甲基-y-氨基丁酸NmgabuD-N-甲基甲^t氨酸DnmmetHieN-甲基环戊基丙氨酸NmcpenDMKD-N-甲基苯丙氨酸DnmpheNalD-N-甲基脯氨酸DnmproDMDD-N-甲基苏氨酸DnmthrN-(1-甲基乙基)甘氨酸NvalTHZN-甲基-萘酯丙氨酸NmanapN-甲基青霉素NmpenhTyrN-(对羟苯基)甘氨酸NhtyrPYAN-(硫甲基)甘氨酸NcysFLA青霉素PenHBOL-a-甲基丙氨酸MalaHMEL-a-甲基天冬酰胺MasnDNmgluL-a-甲基-叔丁基甘氨酸MtbugDNmhisL-甲基乙基甘氨酸MetgDnmileL-a-甲基谷氨酸MgluDNmleuL-a-甲基高苯丙氨酸MhpheDNmlysN-(2-甲基硫代乙酯)甘氨NmetN-甲基环乙基丙氨酸NmchexaD-N-甲基鸟氨酸DNmornN-甲基甘氨酸NalaN-甲基氨基异丁酸NmaibN-(l-甲基丙基)甘氨酸NileN-(2-甲基丙基)甘氨酸NleuD-N-甲基色氨酸DNmtrpD-N-甲基酪氨酸DNmtyrD-N-甲基缬氨酸DNmvalL--丁甘氨酸TbugL-乙基甘氨酸EtgL-高苯丙氨酸HpheL-a-甲基精氨酸MargL-a-甲基天冬氨酸MaspL-a-甲基半胱氨酸McysL-a-甲基谷胺酰胺MglnN-环庚基甘氨酸NchepN-(3-呱基戊基)甘氨酸Narg酸L-a-甲基赖氨酸MlysL-a-甲基正亮氨酸MnleL-a-甲基鸟氨酸MomL-ot-甲基脯氨酸MproL-a-甲基苏氨酸Mthra-甲基酪氨酸MtyrL-N-甲基高苯丙氨酸NmhpheN-(N-(3,3-二苯基戊基)氨基甲酰甲基甘氨酸O-甲基-L-丝氨酸OmserO-甲基-L-高丝氨酸OmhserO-甲基-L-酪氨酸MeYy-氨基丁酸GabuO-甲基-L-高酪氨酸OmhtyrL-3-高赖氨酸BHKL-鸟氨酸OrnN-环乙基甘氨酸NchexD-N-甲基丝氨酸DNmser如果将肽导入个体或用作诊断制剂，这些类型的修饰对稳定肽会很重要。本发明考虑到的其他衍生物包括从完全未糖基化的分子到修饰的糖基化分子的各种糖基化变体。改变的糖基化格式可以是重组分子在不同寄主细胞中表达的结果。优选地，环化的a-芋螺毒素肽要保持Cys残基和特征性二硫键格式。衍生物可包括其余的Cys残基，说明它们在二硫键形成过程中被保护。优选地，根据本发明的芋螺毒素肽具有12到40个氨基酸，更优选地15到30个。根据本发明的环化芋螺毒素肽可用作治疗试剂。a-芋螺毒素肽与尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)结合，该受体曾被显示可治疗疼痛和加速神经损伤的康复。这样的受体还被发现涉及于多种祌经精神紊乱症(包括精神分裂症、抑郁症、嗜癖症、癫痫、22阿尔茨海默氏早老性痴呆症、帕金森综合症和妥遂氏症)的病理生理学，由此(X-芋螺毒素具有预期治疗这些病症的潜在性。根据本发明的环化(X-芋螺毒素肽靶向其他受体或离子通道是可能的。环化的(x-芋螺毒素肽据信对治疗或预防神经痛症疼痛尤其有用。疼痛如果来源于神经系统自身，则被认为是神经痛。祌经系统的涉入可为不同的程度祌经、神经根和位于脊髓和脑的中央痛觉通道。祌经痛症疼痛可能是受损神经异常活性的结果，且是最难治疗的一类疼痛。神经痛症疼痛是一种慢性痛，持续产生并对受感染个体没有任何有益功能。受神经痛症疼痛困扰的患者通常受异常性疼痛(痛来自于一般非致痛性刺激)和痛觉过敏(对一个致痛刺激的增强响应)的困扰。有多种已被深入研究的神经痛症动物模型示范异常性疼痛和痛觉过敏的特征性疼痛症状。神经痛症中的大鼠慢性压迫性神经损伤(ChronicConstrictionInjury,CCI)模型涉及给坐骨神经实施绑缚法,引起造成神经压迫和神经病的发炎。部分结扎模型(partialnerveligationPNL)涉及到在部分坐骨神经的周围建立一个紧密结扎，保持神经的其他部分不受损而得到异常性疼痛和痛觉过敏的痛觉反应。链脲佐菌素(StreptozotocinSTZ)模型涉及引起胰腺(3细胞的糖尿病，造成神经痛症状例如机械痛敏和触诱发痛。使用以上提到的活性评估化合物的试验可为体内或体外，且为本领域技术人员所熟知。例如，用来评估在nAChR的活性的试验包括那些在WO00/15654(Hogg等人，1999，JBiolChem.274(51):36559-64;禾口Hogg等人，2003,ReviewsofPhysiology,BiochemistryandPharmacology1:1-46)中所描述的。优选地，哺乳动物需要这种治疗，尽管肽可以预防疾病的意义使用。本领域技术人员易于理解的是，给药途径(口服和肠内)以及药学上可接受的载体的性质取决于病情和被治疗的哺乳动物。据信，对特定载体或传递系统的选择和给药途径可以容易地由本领域技术人员确定。在本发明的口服和肠内用药的配方中，活性肽可使用惰性稀释液或可同化的可食用载体来配制，或包覆在硬质或软质的贝类白明胶胶囊中，或被压制成片剂，或直接掺进通常所吃的食物。对于口服治疗使用，活性化合物可与赋形剂混合并以可吸收的片剂，口腔的或舌下含片，药片，胶囊，西也剂(elixirs),悬浮液，糖桨，晶片(wafer)和类似的形式使用。可以理解的是，这些口服配方形式，如口腔和舌下含片，具有避免肝新陈代谢的潜力。然而，本发明的环化肽也可能被输送到胃，这样肝的新陈代谢可能会被涉及到。这样的组合物和制剂优选包含至少1重量％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以不同，且可以方便地位于约5重量％到约80重量％之间。治疗上可用组合物中的活性化合物的量在于获取适当的剂量。片剂、药片、药丸、胶囊等也可包含以下列出的组成结合剂，如香口胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或白明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；滑润剂，如硬脂酸镁；和加入的甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，如胡椒薄荷、鹿蹄草油或樱桃调味料。当剂量单位的形式是胶囊时，除以上提到的材料，还可包含一种液态载体。其他可出现的不同材料可以是包衣，或另外改变剂量单位的物理形式。例如，片剂，药丸，或胶囊可被虫胶，糖或二者同时包裹。糖浆或西也剂可包含活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的木精和对羟基苯甲酸丙酯，染色剂和调味剂如樱桃或甜橙口味。当然，各种用来制备各种剂量单位形式的材料应该是药学上纯的和在所用量上基本上无毒的。此外，活性化合物可被掺入到持续释放的制剂和配方中。液态配方也可通过胃管或食管从肠内使用。可通过混合合适的基质，如乳化基质或水溶性基质，以栓剂的形式制备肠内配方。本发明的环化肽还可能，但不是必须，局部应用，鼻内应用，阴道内应用，眼内应用等。药学上可接受的载体包括各种和所有溶剂，分散介质，包衣，抗菌和抗病毒试剂，等渗的和延缓吸收的试剂等。这些用于药学上活性的物质的介质和试剂的使用在
技术领域：
中己广为熟知。除非任何常规的介质或试剂与活性成分都不相容，在治疗组合物中活性成分的使用是可预料的。能够将辅助的活性成分加入到组合物中。以易于使用和统一剂量的剂量单位的形式配制口服或肠内的组分尤其有利。这里使用的剂量单位形式是指适于被治疗的哺乳动物个体的单一药剂的物理上离散的单位；每一个单位包含计算出可产生所需治疗效果的预定量的与所需药学上可接受的载体有关的活性材料。本发明对新型剂量单位形式的说明是被规定并直接依据于(a)活性材料的独特性质和要达到的特定疗效，及(b)对治疗有患病惜况的生物体的疾病的活性材料进行化合在
技术领域：
内的固有局限性，其中下面将详细阐述对身体健康造成的破坏。如上所述，为方便和有效地给药，以剂量单位形式使有效量的主要活性成分与合适的药学上可接受的载体化合。单位剂量形式能够，例如，包含0.25fig到约2000mg的主要活性成分。按比例表达，主要活性成分通常以载体的约0.25昭到约2000mg/ml存在。在包含辅助活性成分的组合物的情况中，通过参考所述成分的通常药量和给药形式来确定剂量。在本发明的一些方面，非口服或肠内的给药形式和途径可为，例如，局部用药，如霜、洗液、透皮贴剂、喷雾剂和凝胶，或适于吸入或鼻内传递的组合物，如溶液或千粉。发明详述现将参考所附的描述一些环化芋螺毒素肽的产生及其生物活性的实施例和附图来说明本发明。然而，应理解的是以下说明的特殊性不用于取代对本发明前述说明的一般性。关于附图图1为通过C-末端硫酯的肽环化的图解。N-末端半胱氨酸的游离硫与C-末端的硫酯相互作用形成中间产物，该中间产物发生S，N，酰基迁移而形成带有基础肽键的环化肽。图2为芋螺毒素MI1，cMII-6和cMII-7的三维结构图示，且包括这些结构的覆盖图。二硫键由球体和棍状体表示。这些结构由NMR光谱确定。图3为描述通过增加MII，cMII-5，cMII-6禾ncMII-7浓度，在分离的牛嗜铬细胞中由尼古丁(5pM)弓l起的儿茶酚胺释放的抑制的浓度-响应曲线。结果显示环化肽的活性可比拟线性MII。图4为描述通过内切酶，EndoGluC内切酶温育肽评估的MII，cMII-6和cMIl-7相对于蛋白水解酶降解的相对稳定性的曲线图。残余的完整肽的数量由RP-HPLC确定。图5为描述50%的人血浆中MII，cMII-6和cMII-7相对于酶的相对稳定性的曲线图。残余的完整肽的数量由RP-HPLC确定。图6为Vcl.1(黑)和环化Vcl.l-6(灰)的三维结构图示。这些结构由NMR光谱确定。每一个肽的二十个最低能量结构的骨架以覆盖图显示，表示Vcl.l的基础构象保留在cVcl.l-6中。图7为描述通过测量从牛肾上腺嗜铬细胞中释放的儿茶酚胺进行评估的cVcl.l-6和Vcl.l的相对生物活性的曲线图。用所示数量的肽温育嗜铬细胞20分钟，然后在抑制剂的连续存在下用lO)iM尼古丁刺激20分钟。转移分装后，如前文所述(Meunier等人，2002)对儿茶酚胺的分泌做荧光学检测(n=6次实验)。图8为描述对小于6g到约10g的CCl-大鼠身体同侧后爪以快速灌注方式皮下注射(s.c.)Vcl.l和cVcl.l-6(剂量100|ig/kg)后升高的平均机械縮爪阈值(PawWithdrawalThreshold,PWT)的曲线图。图9为描述对小于6g到约10g的CCI-大鼠以快速灌注方式口服Vcl.l和cVcl.1-6(剂量10(Vg/kg)后升高的身体同侧后爪平均机械縮爪阈值(PWT)的曲线图。图10为描述对CCi-大鼠以快速灌注方式皮下注射(s.c.)或口服Vcl.l和cVcl.1-6(剂量100(ig/kg)后的身体对侧后爪平均机械縮爪阈值(PWT)的曲线图。图11为描述对CCI-大鼠以快速灌注方式口服Vcl.l(0.03-3mg/kg)，在身体同侧后爪产生的取决于剂量的触诱发痛的释放后的平均PWT的曲线图。图12为描述由抗异常性疼痛(APWTAUC值)的程度和持续时间与剂量作图以产生剂量-响应曲线；近似的ED5。剂量估计为lmg/kg的曲线图。实施例l:环化的MII类似物需要跨越基础Mil肽的N和C末端的接头的大小是由已知的分子模拟法确定。Mil的三维模型下载于蛋白质数据库(ProteinDataBank,PDB)。分子模拟程序，Accelrys用来确定合适的接头长度(InsightIIModelingEnvironment,Release2000,SanDiego,AccelrysInc.2001)。简要地，此处涉及在N-和C-末端间建立氨基酸接头，随后锁住母芋螺毒素肽的结构构象且进行简单的能量极小化。接下来解锁母芋螺毒素肽的结构构象，且重小化整个肽的结构。接头太小的模型导致具有比那些接头长度不影响基础结构的模型更高能量的结构。已被确定，需要跨越N-到C-末端的接头含有至少5个残基。因此，合成含有5个残基(GGAAG)的接头，6个残基(GGAAGG)的接头和7个残基(GGAGAAG)的接头，除了N-末端甘氨酸的肽。这相应于长度跨越6到8个残基的半胱氨酸总长度。距离测量接头中的每一个残基需要跨越大约2.0到2.4埃(注意这比跨越约3.5埃的因而代表松弛构象的延展构象要小)。甘氨酸和丙氨酸是相对较惰性的氨基酸，有不易与基础肽的其他残基相互作用的小侧链，或相比于更大的或高官能化的氨基酸残基不易干扰基础肽的折褶，因此被选为接头氨基酸。W靴層类欽激船成由使用硫酯接头的原位中和反应通过BOC/HBTU化学法合成肽(Schnmzer等人，(1992)Int.J.Pept.ProteinRes.40，180-193;Dawson等人，(1994)Science266,776-9;Tam等人，(1999)J.Am.Chem.Soc.121，4316-4324;Yan,L.Z.禾QDawson,P.E.(2001)JAmChemSoc123,526-33)。接头通过以下合成用4当量S-三苯甲基-(3-巯基丙酸，4当量多肽縮合剂(HBTU)和5当量二异丙基乙胺(DIEA)在二甲基甲酰胺DMF中处理Gly聚丙烯酰胺(PAM)树脂(2x30分钟)。随后用三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷氾20(96:2:2)处理2x20分钟去除三苯甲基基团。然后在标准偶合条件下将肽的C-末端残基加到接头上。具有C-末端硫酯的肽还可根据标准文献步骤用FMOC化学法产生[Ingenito,R.,Bianchi,E.,Fattori,D.andPessi,A.(1999)JAmChemSoc121,11369-74;Shin,Y"Winans，K.A.，Backes,B丄，Kent,S.B.H.，Ellman,J.A.andBertozzi,C.R.(1999)JAmChemSoc121,11684-89;Clippingdale,A.B"Barrow,C丄andWade,J.D.(2000)JPeptSci6,225-34;Camarero,J.A.,Hackel,B丄，DeYoreo，J丄andMitchell,A.R.(2004)JOrgChem69,4145-51]。一旦肽发生了成肽反应，它就会被HF从树脂上分裂，以加甲酚皂液和硫代甲酚皂液作为净化剂。随后用RP-HPLC通过一个Cl8柱纯化，梯度为0-80%B(A=0.05%TFA水溶，B=90%乙腈，9.95%水，0.05%TFA，)提纯粗肽混合物80分钟以上。收集馏分，进行MS分析，集合含有所需产物的馏分并将其干粉化。对纯化的线性还原肽的氧化和环化是如下达到的将肽溶于0.1MNH4HC03(pH8.1)或50/500.1MNH4HC03//PrOH，浓度大约0.3mg/mL。室温下将反应混合液搅拌过夜，且将所得混合液通过RP-HPLC使用上述条件纯化。肽具有下面给出的序列。6位残基接头环化的Mil以45:55的大约比例形成两类各异的异构体。相反地，5位残基接头环化的Mil的粗氧化物的HPLC图谱显示出一系列区分不清的峰值。最后，7位残基接头环化的MII形成一个主要(>90%)的，NMR数据显示具有良好秩序的异构体。6位残基接头(除了N-末端甘氨酸以外)环化的MII类似物的粗氧化物的少量峰数提供了这是Mil的最佳最小尺寸的初歩指示。将粗混合物的各个峰分别采集并做MS分析。其中包含有与环化和氧化的肽大量一致的峰进行了分析RP-HPLC。根据HPLC的分析，将馏分合并再干粉化。测量足够数量的环化肽的1D'HNMR光谱。根据'HNMR光谱，5残基接头环化肽的一个异构体显示具有良好秩序的结构。对于6残基接头肽，后洗脱的更加富集的异构体据'HNMR光谱显示具有良好秩序的结构。根据NMR光谱，7残基环化Mil肽也具有良好秩序的结构。Mil的环化肽类似物的序列如下(a)cMII-5GlyCysCysSerAsnProValCysHisLeuGluHisSerAsnLeuCysGlyGlyAlaAlaGly,SEQIDNo.2(b)cMII-6GlyCysCysSerAsnProValCysHisLeuGluHisSerAsnLeuCysGlyGlyAlaAlaGlyGly_ISEQIDNo.3(c)cMII-7GlyCysCysSerAsnProValCysHisLeuGluHisSerAsnLeuCysGlyGlyAlaGlyAlaAlaGly,SEQIDNo.4W观慮微激麟麟,随后获得三个具有良好秩序的类似物(现称为cMII-5，cMII-6和cMII-7)的二维NMR光谱数据。产生完整的NMR赋值并与基础MII比较Ha和Hw质子的化学位移。化学位移的比较结果可提供结构近似性的指示。结果显示cMII-5的化学位移与MII的那些匹配极弱，显示有结构上的变化。相反地，cMII-6和cMII-7的化学位移与基础芋螺毒素高度一致。这显示cMII-6和cMII-7获得了与基础Mil非常近似的结构，而cMII-5明显地从基础结构衍生而来。根据氧化图谱和NMR数据，证明有5个外加残基的接头太短，因而干扰芋螺毒素的正确折褶，而有6个或7个外加残基的接头具有足够大小以允许环化类似物形成类似基础肽的结构。确定cMII-6和cMlI-7的完整三维结构(3D)以确认基础MII和其环化配对物之间的紧密相关的结构。用NMR光谱法确定cMII-6的3D结构。由BmkerDMX750光谱仪在280和287K下获得谱图。所记录的同核光谱包括双量子过滤DQF-COSY[Ranee,M.,S0rensen，O.W.,Bodenhausen,G"Wagner,G.，Ernst,R.R.andWiithrich,K.(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.117,479-485.]，使用MLEV17自旋锁序列的TOCSY[Bax,A.andDavis,D.G.(1985)J.Magn.Reson.65,355-360.]，等方性混合时间为80ms;ECOSY[Griesinger,C.,S0rensen,O.W.andErnst,R.R.(1987)J.Magn.Reson.75，474-492]，禾口NOESY[Jeener,J.，Meier,B.H.，Bachmann,P.andErnst,R.R.(1979)J.Chem.Phys.71,4546-4553;Kumar,A.,Ernst,29R.R.andWiithrich,K.(1980)Biochem.Biophys.Res.Commun.95,1-6]，混合时间150到350ms。在DQF-COSY和ECOSY实验中，由松弛延迟过程中的低能辐射抑制水共振。在TOC.SY和NOESY实验巾，用修饰的WATERGATE序列达到水的抑制[Piotto,M.，Saudel(,VandSklenar,V.(1992)J.Biomol.NMR2，661-665]。通常在相当于12ppm的谱宽内，在G维从4096数据点且在fl维从512增量采集二维波谱。为确定低速交换的酰胺，将样品溶于D20后，立即进行一系列一维和TOCSY光谱分析。全部光谱分析使用XWINNMR(Bruker)在一个硅绘制工作平台上进行。在傅里叶变换前，fl维被零点充填到2048实体数据点，fl和f2维被乘以移位90°的正弦平方函数。用XEASY程序分析并赋值处理过的光谱[Eccles，C，Guntert,P.,Billeter,M.andWUthrich,K.(1991)J.Biomol.NMR1,111-30]。由连续赋值法赋ft光谱[W说hrich,K.(1986)Wiley-Interscience，NewYork]。由DYANA软f牛包的一部分的自动赋值程序NOAH辅助部分处理过程[Guntert,P.,Mumenthaler，C.andW说hrich,K.(1997)J.Mol.Biol.273，283-98]。在XEASY中整合并校准了NOESY记录的在90%H20,10%D20中混合350ms和150ms的交叉峰值，距离约束由DYANA得出。主链两面角限量通过由与VH,a耦合的在DQF-COSY光谱中分裂的反向交叉峰常量的线型分析测量得出。角度限制为，当V冊Hu〉8.5Hz时，-120。±30。和当VHNHa<5Hz时，-60。±30。。p-亚甲基质子和xl二面角的立体特殊赋值由Vap耦合常量得到，由ECOSY光谱结合NOE峰强度测得。用DYANA内的扭转角模拟退火法计算初步结构。由模拟退火和CNS1.0版本的能量最小法计算最终结构[Briinger,A.T"Adams,P.D.andRice,L.M.(1997)Structure5，325-336]。起始结构用随机phi，psi二面角产生并能量最小化以得到具有正确局部几何的结构。该方法涉及包含4000步0.015ps扭转角动力学的高温期，带有4000步0.015ps扭转角动力学的冷却期，在此期间温度降至0K，最后，包含5000步Powell最小化的能量最小化期。结构进一歩在水斗(watershell)中用分子动力学和能量最小化法精制[Linge，J.P.andNilges,M.(1999)J.Biomol.NMR13，51-9]。在explicitwater中的精制涉及以下几步。首先通过100K的间距加热至500K，其中每一步包含50步0.005ps笛卡尔动力学。其次，在500K的2500步0.005ps笛卡尔动力学，然后一个冷却期，在此期间温度以100K的间距降低，每一歩包含2500歩0.005ps笛卡尔动力学。最后，2000歩Powell最小化法最小化结构。用PromotifandProcheck分析结构[Hutchinson,E.G.andThornton,J.M.(1996)ProteinSci.5，212-220;Laskowski，R.A.,Rullmannn，J.A.,MacArthur，M.W"Kaptein,R.andThornton,J.M.(1996)J.Biomol.NMR8，477-86]。对cMII-6禾nMil的比较显示Mil的基础构型在cMII-6中全部保留。两个肽的惊人相似程度在图4中阐明。问cM//-<5游遂摔丝^成尽管非选择性氧化是合成环化芋螺毒素的优选方法，但它们还可使用以cMII-6示范的直接二硫键形成法合成。肽由上述方法合成，但半胱氨酸3和16的侧链被Acm基团保护。肽从树脂分裂，纯化，并在上述条件下氧化/环化。第二个二硫键由在位置3和16的半胱氨酸选择性地用12解保护/氧化来形成。肽(20mg)以1mg/mL的浓度溶于50%的乙酸水溶液，用氮气冲灌烧瓶。烧瓶中加以2mLlMHCl以及足够的0.1M溶于50%乙酸水溶液的12使溶液呈白黄色(大约lmL)。反应接着在氮气的存在下室温搅拌1.5小吋。通过加入1M抗坏血酸终止反应，直至反应混合物呈无色。接着用缓冲液A稀释混合物，并用RP-HPLC纯化以生成环化的完全氧化的肽。该肽与c謹I-6同时洗脱，因而证实了cMII-6与基础肽相应的二硫键连接方式，也就是Cys2-Cys8和Cys3-Cys16(1-3，2-4)。fe)cM//-6^姓激兹丝如标准文献歩骤所述[Lawrence,G.W.,Weller,U.andDolly,J.O.(1994)EurJBiochem222,325-33;Meunier,F.A.，Mattei，C，Chameau,P"Lawrence,G.，Colasante,C,Kreger，A.S.,Dolly,J.O.andMolgo,J.(2000)JCellSci113(Pt7),1119-25;Meunier,F.A.,Feng,Z.P.,Molgo,J"Zamponi，G.W.andSchiavo,G.(2002)EmboJ21，6733-43.]，从牛肾上腺提取嗜铬细胞并培养于24-孔培养板(Nimc)。完整的细胞用缓冲液A(mM):NaCl，145;KC1，5，Na2HP04,1.2;蔗糖，10;HEPES-NaOH,20(pH7.4)简单润洗一次，且与基础和环化的芋螺毒素在2mMCaCl2的存在下孵化20分钟，并用尼古丁(5pM)刺激20分钟。每个实验31结朿时收集上清液并分装，并将细胞用l%(v/v)TritonX-100(Sigma)裂解。两组样品都用儿茶酚胺做荧光测量试验，按文献所述，释放量被表示为对照组的百分比(见上)。生物活性试验结果表示在图3，并显示环化的肽与线性Mil的活性可比拟。仿cMZ/-6游濃定丝通过用水解酶Glu-C(EndoGlu-C)温育肽来评估cMII-6和cM:II-7抵抗蛋白水解酶的能力。MII，cMII-6和cMII-7具有相同的潜在加工位点，(在Mil中)位于末端反面，(在cMII-6和cMII-7中)位于接头上。肽以20吗/mL的浓度溶于0.1MNH4HC03(pH8.0)缓冲液里。EndoGlu-C接着以肽:酶(wt/wt)为50:1的比例加入溶液并在37°C温育。从第0到第10小时每隔1小时取出分装液GpL)并用5%的甲酸(57pL)终止反应。样品接着进行LC/MS分析且确定在每一时间点保持完整的肽数量。每一组试验重复三次，并配有合适的阳性(带有一个EndoGluC酶切位点的线性非二硫键肽)和阴性(在不加酶缓冲液中的肽)对照。稳定性试验的结果显示于图4。经过整个10小吋阶段，环化肽保持完整，尽管基础Mil具有大约10小吋的半衰期。cMII-6和cMII-7表现的增长的稳定性是令人惊奇的，因为MII和环化肽被推断的加工位点是相同的(也就是在谷氨酸的C-末端一侧)，且远距末端(在MII中)和cMII-6及cMII-7的肽接头。此外，期待的是，增加的稳定性对且只对对N-末端有活性的外切酶而言(Mil在其C-末端酰胺化)，而Glu-C是一个内切酶。因此，线性芋螺毒素显示出超出了所期待的仅保护末端的增强稳定性。,c層-7^W激媳定實为检验cMII-6和cMII-7对蛋白水解的抑制力，并与Mil比较，将这些芋螺毒素在人血浆中温育。MII，cMII-6和cMII-7(10nM)在50%的人血浆中温育24小时。在几个时间点取样后，用15%的三氯乙酸水溶液终止反应并离心。取上清做RP-HPLC分析。每一组试验重复三次。图5显示本实验的结果。cMII-6禾PcMII-7的稳定性明显比Mil高。基础Mil具有大约16小时的半衰期，而cMII-6和cMII-7在24小时后的剩余量接近90%。32实施例2:环化Vcl.l的合成与特征鉴定(x-芋螺毒素Vcl.l是oc-芋螺毒素的4/7类的一科'，包括Mil并具有治疗疼痛的潜力(SandallDW，SatkunanathanN,KeaysDA,PolidanoMA:LipingX，PhamV,DownJG，KhalilZ,LivettBG,GaylerKR，Biochemistry200342(22):6904-l1)。文献中尚无Vcl.l的结构数据，因此对环化Mil类似物的设计不能依照上述歩骤。然而，因为其他的具有相同构架的芋螺毒素的结构己被研究过，Vcl.l最佳接头长度由简单的距离测量本家族中其他成员，包括MII和PnIA，来进行估算。在蛋白质数据库(PDB)中，除重复的结构和芋螺毒素GID(—种在N-末端带有延伸的灵活"尾巴"的结构)夕卜，(x4/7芋螺毒素有四个结构。将这四种化合物的这些结构的N-和C-末端之间的距离值取平均，所得数值非常一致(12.2士0.8A)。接下来，Vcl.l的三维结构已被报导(Clark等人J.Biol.Chem.(2006)28123254-23263)并揭示Vcl.l的N禾PC末端的间距为11.9±0.5A，落于计算出的a4/7芋螺毒素的平均范围内。因此可估计环化Vcl.l的合适的接头长度与用于环化Mil的接头相似，如大约6到7个残基。再次说明，这6个残基在N-末端另加于存在的甘氨酸残基上。⑤if化Kc7」齡c7J船淑斜鄉f使用所述合成环化MII的歩骤(实施例1)来进行环化Vcl.l的合成。环化Vcl.l的环化/氧化缓冲液为0.1MNH4HCO3(pH8.1)。环化/氧化得到一个纯化并用}HNMR光谱分析的主要异构体(现称为cVcl.l-6)。Vcl.l(C-末端酰胺化)和cVcl.l-6的序列如下。GlyCysCysSerAspProArgCysAsnTyrAspHisProGlulieCysSEQIDNO.5GlyCysCysSerAspProArgCysAsnTyrAspHisProGlulieCysGlyGlyAlaAlaGlyGly_SEQIDNO.6使用原位中和反应BOC/HBTU化学法在MBHA-酰胺树脂上合成线性Vc].l。肽在室温下在0.1MNH4HC03中折褶过夜，并得到一个单一异构体。合成的Vcl.l和cVcl.l-6的二硫键连接方式用标准还原/烷化法[G6ransson,U.andCraik,D丄(2003)J.Biol.Chem.278，48188-96]及MS/MS测序法确定为Cys2-Cys8，Cys3-Cys16。三维NMR结构随后确定用以与cVcl.l-6比较。Vcl.l和cVcl.l-6的三维结构均山上述用于线性Mil的NMR光谱法确定。如图6所示，Vcl.l的基础构型保留在cVc].l-6中。二藏經厫游绘激在低pH值的柠檬酸盐缓冲液里用TCEP温育部分还原Vcl.l。反应混合液用RP-HPLC提纯，一个二硫键的物种与N-乙基马来酰胺烷化。烷化后的肽随后完全还原并用MS/MS分析。MS/MS数据清晰显示C2和C8已被N-乙基马来酰胺烷化。观察肽两端的片段模式且完全被提议的烷化模式支持。因此，结论为Vcl.l的二硫键连接方式是从C2到C8及C3到Cl6。这与在其他a-芋螺毒素中观察到的I-m,II-IV二硫键结合模式是一致的。问c'Fc7丄6游—生激舒丝按照上述分析环化MII样品的方法，通过测量牛肾上腺嗜铬细胞儿茶酚胺的释放来分析cVcl.l-6的生物活性。实验结果示于图7，显示在实验误差范围内，cVcl.l-6的活性与线性Vcl.l等同。&9cFc7./-6游惹定'丝使用为环化Mil概括出的实验来评估cVc1.1-6抵抗蛋白水解酶的能力。实施例1中给出的方案还可用来评估在哺乳动物胃液和血浆中的抗降解能力。(Pct-手凝毒實j^畫资"CMI'，,粼游遂齊丝在表达不同种nAChR亚单位组合的非洲爪蟾(Ze"o/mv)卵母细胞中测试Vcl.l对ACh诱导产生的电流的抑制。每10分钟评估一次ACh引起的响应，且在显效剂和毒素同时加入前4分钟先加毒素水浴。Vcl.l(lOpM)无论是通过中央nAChR亚型，a4p2和a4p4,或是通过骨骼肌肉nAChR亚型,ocPYS，都不能抑制ACh引起的电流(n=7-12)。同样地，10(iM的Vc1.1只抑制了14±2%通过homopentameric神经的nAChR，a7引起的电流(n=ll)。然而，10|iM的Vcl.l以相似的程度抑制外周nAChR亚型a3(32和a邓4，分别为对照组的58±7%(11=8)和56±7%(n=12)。当将a5亚单位加入到nAChR组合，a3a5卩2(n=7)中可观察到相似的效力，但Vcl.l显示出超过5倍的更低效力以抑制a3a5(34(n=15)。对带有a6的nAChR亚型，a3a6|32(n=13)，30|iM的Vcl.l只抑制了50%ACh引起的电流振幅。对带有a3的nAChR，用浓度^100nM的Vcl.l水浴没有拮抗ACh引起的电流，也没有单独引出可观察到的响应(也就是〉50nA)。。^丄7-6游/7#^^^7^^#游劝.麥用来比较Vcl.l和cVcl.1-6当通过皮下(s.c.)和口服药丸剂量使用时，使用明确的神经痛模型(CCI-大鼠)，展开抗-痛觉超敏(止痛)效果的研究。触觉痛觉超敏，祌经痛的定义性症状，是由在大鼠左腿的坐骨神经捆绑四条松动的结扎线来引起慢性压迫性神经损伤(CCI)造成对同一边后腿(也就是同侧后腿)轻微接触的超敏。使用校准的vonFrey纤维对CCI-大鼠同侧后腿施加分级的非毒害压力评估触觉痛觉超敏。在未受伤大鼠和CCI-大鼠未受伤(对侧的)的后腿中，vonFrey机械缩爪阈值(PWT)为12g，而CCI术后14天，同侧PWT为^6g。治疗的目的是减轻触觉痛觉超敏，以使同侧后腿的PWT从6增加到12g。通过皮下(s.c.)或口服路径摄取一个快速灌注剂量(100pg/kg)的Vcl.l和cVcl.1-6对触觉痛觉超敏产生了显著的缓和，表现在同侧后腿的PWT均峰从〈6g到10g的增高。Vcl.l的环化显示造成较母线性肽更长的作用持续时间，不论是通过哪一种给药方式(图8和图9)。皮下(s.c.)或口服给药Vcl.l或cVcl.1-6都不增加对侧后腿的PWT，这与期望的是一致的(图IO)。结果显示在神经痛活体模型中，cVcl.1-6比线性Vcl.l具有显著活性。它比Vcl.l还具有更长的半衰期，更稳定，且在动物中有口服生物可行性。,組"微微遊教微虔及效力展开cVcl.l-6在CCI-大鼠口服快速灌注剂量下的抗痛觉超敏的效能引证的研究。每只CCI-大鼠(n=6)得到不超过5个口服快速灌注剂量的cVcl.l-6，剂量之间有至少2天的洗脱期，用来识别有效剂量范围。使用该方法，环化Vcl.l的有效抗痛觉超敏的剂量为0.3mg/kg到3mg/kg。由于可得的肽量不够，没有检测更大的剂量。对照组动物得到了口服快速灌注剂量的空载体(n=3)。环化Vcl.l或空载体使用Hamilton玻璃注射器以500fiL的体积注射，PWT是由以上2(h)中所述步骤确定。CCI-大鼠得到1个cVcl.l-6口服快速灌注剂量lmg/kg(n=3)。对照组动物得到1个口服快速灌注剂量的空载体(11=3)。cVcl.l-6或空载体使用Hamilton玻璃注射器以500的体积注射，PWT是由以上2(h)中所述步骤确定。实验程序完成后，将大鼠用100%C02处理并以颈椎骨脱位法处死。冷冻大鼠尸体直到被昆士兰大学生物废弃物转移服务运走。将CCI-大鼠注射每一个剂量的cVcl.l-6及空载体的平均(±SEM)PWT相对时间绘制曲线图。PWT值用减去分别的给药前基线值来标准化，和用梯形整合法估算标准化响应下的面积相对时间的曲线(AUC)。将AUC值对药剂量作图并估算EDso值(图12)。正如所预期的，CCI手术后21天的触觉痛觉超敏在同侧后腿(4.8士0.2g)的PWT均值(士SEM)相对于分别的对侧(未受伤)后腿(10.6土0.2g)的PWT均值(土SEM)显示出明显降低(P<0.05)。治疗目标是触觉痛觉超敏的全部逆转，也就是vonFreyPWTs在同侧后腿为llg。根据"洗脱"程序，给CCI-大鼠注射完1个口服快速灌注剂量的cVcl.l-6(0.3to3mg/kg)后，在同侧后腿出现了触觉痛觉超敏的缓解的快速开始。对于全部检测过的剂量，用药后0.5h在同侧后腿出现了依赖于药剂量的痛觉超敏的峰值，相应的作用持续时间在l-1.25h。在检测的cVcl.l-6最高剂量下(3mg/kg)，PWTs均值(士SEM)从用药前的5.2(±0.4g)增加到用药后0.5h的峰效(9.5±lg)。CCI-大鼠同侧后腿的平均(士SEM)抗-痛觉超敏(APWTAUC值)的程度和36持续时间以依赖于剂量的方式升高。cVcl.l-6的ED5。剂量估算为1mg/kg，选择该剂量注射未用药的CCI-大鼠。在CCI-大鼠中口服不超过3mg/kg剂量的cVcl.l-6对对侧后腿产生了不显著的抗促伤害作用(antinocieption)(图11)。对未用药的CCI-大鼠注射完1个口服快速灌注剂量的cVcl.l-6(lmg/kg)后，在同侧后腿出现了触觉痛觉超敏的缓解的快速开始。与使用"洗脱"程序的实验发现一致，同侧后腿的抗痛觉超敏发生在用药后0.5h且相应的平均作用持续吋间为1.5h。尤其地，CCI-大鼠同侧后腿的平均(士SEM)PWT值从用药前的4(±0g)增加到峰效时(0.5h)的8.7(士0.7)g。在未用药的CCI-大鼠中口服lmg/kg的cVcl.l-6对对侧后腿产生了不显著的抗促伤害作用。在本研究中，检测的cVcl.l-6的1个口服快速灌注剂量(0.3-3mg/kg)对CCI-大鼠未产生可辨别的不利行为影响。给CCI-大鼠口服1个快速灌注剂量(0.3-3mg/kg)的cVcl.l-6可在同侧(受伤的)后腿产生依赖于剂量的抗痛觉超敏反应，但未产生对相应的对侧后腿的抗促伤害作用。所观察到的cVd.-6未在相应的对侧(非受伤)后腿产生抗促伤害作用与cVcl.l-6通过调节前-感受伤害(前-疼痛，pro-pain)路径，而不是通过放大内源疼痛抑制机制来产生止痛效果的观点一致。本说明书中对早先出版物(或源自其中的信息)，或已知的任何事件的参考，不能，也不应该被拿来作为认可或承认或任何形式的建议早先出版物(或源自其中的信息)或己知事件形成了与本说明书有关的研究领域中的一般知识的一部分。本领域技术人员可以理解除了那些特别描述的，所述发明还允许变更和修改。应理解本发明包括了所有这些在本发明的精神和范围内的变更和修改。本发明还包括，单独地或集合地，所有提到的或说明书中指示的步骤，特征，组合物和化合物，以及任何和全部的任意两种或两种以上所述步骤或特征的组合。权利要求1、一种口服或肠内用药的药物制剂，该制剂包含至少一条带有酰胺环化骨架的合成的环化α-芋螺毒素肽，以使该肽不含游离的N-或C-末端，该肽包含结合成对四个半胱氨酸残基以形成两个二硫键，其中在药学上适于口服或肠内用药的载体中，相应的线性/非环化芋螺毒素肽的N-末端由一个肽接头连接到C-末端。2、根据权利要求1所述的药物制剂，其中相应的线性/非环化(x-芋螺毒素肽选自Xaa!CCSXaa2PXaa3CXaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10CSEQIDNO:l其中Xaa!是甘氨酸或天冬氨酸，Xaa2至Xaa7代表任何天然生成的或非天然氨基酸，Xaa8代表脯氨酸，羟脯氨酸或谷氨酰胺，Xaa9代表天冬氨酸，谷氨酸或"T羧基谷氨酸，Xaa,。代表任何天然生成或非天然氨基酸或可以缺失。3、根据权利要求2所述的药物制剂，其中选自下述的Xaa,到Xaa,o:xaai是甘氨酸或天冬氨酸，Xaa2选自天冬氨酸，天冬酰胺，组氨酸，酪氨酸，精氨酸或赖氨酸，Xaa3选自精氨酸，脯氨酸，丙氨酸，缬氨酸或丝氨酸，Xaa4选自天冬酰胺，丙氨酸，精氨酸，酪氨酸，组氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，异亮氨酸或赖氮酸，Xaa5选自酪氨酸，组氨酸，丙氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，亮氨酸，丝氨酸，硫堇，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸或精氨酸，Xaa6选自天冬氨酸，天冬酰胺，丝氨酸，酪氨酸，谷氨酸，甘氨酸，精氨酸或组氨酸，Xaa7选自组氨酸，天冬酰胺或酪氨酸，Xaa8选自脯氨酸，羟脯氨酸，谷氨酰胺或丝氨酸，Xaa9选自谷氨酸，Y-羧基谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸或天冬酰胺，Xaa,o选自异亮氨酸，酪氨酸，亮氨酸或des-Xaa,()。4、根据权利要求2所述的药物制剂，其中选自下述的Xaa,到Xaan):Xaa,是甘氨酸或天冬氨酸，Xaa2是天冬氨酸，Xaa3是精氨酸，Xaa4是天冬酰胺，Xaa5是酪氮酸，Xaa6是天冬氨酸，Xaa7是组氨酸，Xaa8是脯氨酸，Xaa9是谷氨酸，Xaa1G是异亮氨酸。5、根据权利要求1所述的药物制剂，其中相应的线性/非环化a-芋螺毒素力太是Vcl.l。6、根据权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述的接头选择为在第一个和第四个半胱氨酸残基之间有7个氨基酸残基。7、根据权利要求6所述的药物制剂，其中所述的接头由甘氨酸和/或丙氨酸残基以及任何已存在于线性(x-芋螺毒素的氨基酸残基组成。8、根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述的肽接头为6至8个跨越在半胱氨酸残基I和IV之间的天然或非天然氨基酸。9、根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述的合成的环化肽选自GlyCysCysSerAsnProValCysHisLeuGluHisSerAsnLeuCysGlyGlyAlaAlaGlyGly_I序列No.3GlyCysCysSerAsnProValCysHisLeuGluHisSerAsnLeuCysGlyGlyAlaGlyAlaAlaGly序歹ijNo.4GlyCysCysSerAspProArgCysAsnTyrAspHisProGlulieCysGlyGlyAlaAlaGlyGly_I序列NO.6。10、根据权利要求8所述的药物制剂，其中合成的环化肽为:GlyCysCysSerAspProArgCysAsnTyrAspHisProGlulieCysGlyGlyAlaAlaGlyGly,序列NO.6。11、一种治疗或预防疼痛的方法，包含使用根据权利要求1至10中任一项所述药物制剂进行口服或肠内用药的步骤。12、根据权利要求11的一种方法，其中该疼痛是神经痛。13、根据权利要求11的一种方法，其中该疼痛是炎性痛。14、根据权利要求2的一种方法，其中该祌经痛是糖尿性神经痛。15、一种加速受损神经康复的方法，包含口服或肠内使用根据权利要求1到10中任一项所述的药物制剂的步骤。16、一种治疗或预防阿尔茨海默氏早老性痴呆症，精神分裂症，抑郁症，癫痫，小细胞肺癌，心血管紊乱，胃动力紊乱，尿失禁，尼古丁嗜癖，情绪病(例如躁郁症，单极性忧郁症，胸腺机能障碍和季节性情绪失调)或炎症的方法，包括根据权利要求1到10中任一项所述的口服或肠内用药步骤。17、--种合成的环化a-芋螺毒素肽在制备治疗或预防疼痛的口服或肠内用药的药物中的应用。18、根据权利要求17的应用，其中该疼痛是神经痛。19、根据权利要求18的应用，其中该神经痛是糖尿性神经痛。20、根据权利要求17的应用，其中该疼痛是炎性痛。21、一种合成的环化oc-芋螺毒素肽在制备加速受损神经康复的口服或肠内用药的药物中的应用。22、一种合成的环化cx-芋螺毒素肽在制备治疗或预防阿尔茨海默氏早老性痴呆症，精神分裂症，抑郁症，癫痫，小细胞肺癌，心血管紊乱，胃动力紊乱，尿失禁，尼古丁嗜癖，情绪病(例如躁郁症，单极性忧郁症，妥瑞氏综合症(Tourettesyndrome),胸腺机能障碍和季节性情绪失调)或炎症的口服或肠内用药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种口服或肠内用药的药物制剂，该制剂包含至少一条带有酰胺环化骨架的合成的环化α-芋螺毒素肽，以使该肽不含游离的N-或C-末端，所述肽具有抑制尼古丁乙酰胆碱受体的能力，并包含结合成对的四个半胱氨酸残基以形成两个二硫键，其中在药学上适于口服或肠内用药的载体中，相应的线性/非环化芋螺毒素肽的N-末端由一个肽接头连接到C-末端。文档编号A61K38/12GK101448516SQ200780018581公开日2009年6月3日申请日期2007年4月3日优先权日2006年4月13日发明者D·J·克雷克,R·克拉克申请人:昆士兰大学