专利名称：：用于治疗退变性骨关节炎的硫酸化透明质酸的制作方法
技术领域：
：骨关节炎(OA)是一种非常常见的障碍，其特征是关节软骨进行性退变，关节软骨在损失细胞组分和细胞外组分后变薄并恶化，甚至可能完全消失。仅仅部分明确了这种疾病的病因。它们基本上似乎包括由影响整个关节的力学失衡所触发的一系列过程，例如在创伤或物理应激后。在软骨内，在衰竭细胞外基质的破坏与完整基质的形成之间存在着微妙的平衡。所有这些在很大程度上取决于软骨细胞所产生的酶(关节基质的一种细胞组分)。如果发生关节负栽过度或不平衡，会出现炎症状况。这会触发炎性细胞因子的释放，后者又刺激软骨细胞产生金属蛋白酶(MMP)(—种造成软骨破坏的酶)，由此改变了细胞外基质合成和降解之间的平衡。科学文献的细胞死亡过程(Cao等人，五jc/CW/及es，1999，246:527-37)。考虑到上述因素，退变性骨关节炎可以;陂定义为慢性疾病，其通常在炎症最初的急性期(称为炎性骨关节炎)后发生。关节处是否存在炎性状态(由细胞因子和MMP与其它物质引起)将疾病的急性炎症期(炎性骨关节炎)和慢性非炎症期(退变性骨关节炎)区分开。退变性骨关节炎不仅作为炎性骨关节炎的慢性期而发生，而且会由于关节软骨的生理衰老而发生。因此，细胞外基质的完整对于软骨细胞的存活而言是至关重要的，从而对于健康的软骨而言是必需的。软骨基质是由胶原蛋白分子和蛋白聚糖的聚集复合物组成的三维结构，蛋白聚糖的聚集复合物又通过以下成分形成-透明质酸(HA)骨架，-含有重复的葡糖胺或半乳糖胺的二糖单元的糖胺聚糖(GAG)，其又携带带负电荷的g或硫酸基，由于该原因，GAG形成带负电荷的长链，-多肽。HA是具有相当大粘弹性质的多糖分子。它在关节腔中作为滑液的基本成分而存在，在那里它作为润滑剂和减震剂起作用并保护软骨细胞对抗炎性细胞因子的作用(Asari等人，/^cA好&to/Q;to/，1995，58:65-76;Brun等人，Os^^r幼rC"W,7，2003，11:208-16;Stove等人，/6^狄o/及^，2002，20:551-5)。长久以来已经将HA本身或衍生形式的HA作为"粘性补充剂(viscosupplement)"或润滑剂来治疗退变性骨关节炎。各种产品包括(作为举例)Hyalgan⑧(按照EP138572Bl由雄鸡冠纯化的HA)、Synvisc(HylanG-F20,即与甲醛和二乙烯砜交联的HA，如专利US4,713,448中所述)和Artz(MW为620至1200KDa的HA)，以上产品仅能通过关节内途径施用。现有技术的口服治疗包括施用硫酸化GAG如硫酸葡糖胺和硫酸软骨素与HA和水解胶原蛋白的联合，以促进关节腔内的HA合成、减少炎症和保护骨关节炎关节中的软骨细胞(US6,645,948;US6,476,005)。科学证据清楚地证明了硫酸化GAG在增加炎性骨关节炎患者的滑液中HA含量方面的效力(McCarty等人，MM好"^A，2000，54:798-802;McCartyMF，M^/好j;;7WA，1998，50:507-510)。其它专利或专利申请也是已知的，它们描述了涉及关节内联合施用HA和硫酸化软骨素来治疗炎性骨关节炎的新疗法(US6,906,044)，或者要求保护了使用给定剂量的HA进行口服治疗(专利US6，607，745)，HA有可能与葡糖胺、硫酸化软骨素或硫酸化葡糖胺联合(US6，924，273);最后，高分子量HA在预防和治疗骨关节炎的用途是已知的(专利申请WO2005/032276)。除了硫酸葡糖胺和硫酸软骨素外，另一种用于软骨保护的硫酸化GAG是HA，适宜地是硫酸化HA,如现有技术中所述的那样，其被赋予抗炎、抗凝血和细胞粘附抑制效果。特别而言，US20040,053,885公开了硫酸化透明质酸(随后称为HA-S)在关节内治疗炎性关节炎和特别是类风湿性关节炎(自身免疫疾病)中的用途，而EP754460Bl要求保护了HA-S在胃肠道外注射治疗炎症状态、包括关节风湿病中的用途。本发明取代了现有技术，因为它涉及用于口服施用或关节内注射的基于在化学上被硫酸化的HA的制剂，其有效地延緩了关节退变和促进了受慢性退变性骨关节炎影响的关节中细胞外基质的重构，因而其不处于炎症状态(因此这些组合物不能用于治疗炎性骨关节炎)。根据一个特别优选的方面，本发明涉瓦基于如EP702699Bl中所述通过硫酸化被化学修饰的HA的制剂其申请人已经通过在骨关节炎软骨缺损治疗中与基于硫酸化糖胺聚^t的标准治疗相比正比了HA-S治疗效力，并将其效力与非石危酸化HA相比以清楚地证明了HA-S的药理作用优于GAG和HA。发明详述本发明涉M于通过硫酸化被化学修饰的HA的制剂，其在(优选口月良)治疗慢性形式的退变性骨关节炎中是有效的，且没有炎性后遗症。如已经指出的那样，退变性骨关节炎的过程引起关节软骨中细胞外基质的进行性损伤。这种损伤通过基质变薄和软骨细胞组分的丧失表现出来；该过程最后是关节软骨的完全破坏。这种障碍可以表现为炎性关节炎的长期化(chronicisation)或者代表了关节老化过程的生理发展。从形态学的观点来看，软骨从关节表面至软骨下骨可以分为四个不同的区域，即-区域I:最薄的最外面的部分，仅部分细胞化，-区域II:移行区，含有最高百分比的细胞，主要负责基质的产生，-区域III:辐射区，它是最大的区域，软骨的整体厚度取决于该区域的结构，-区域IV:钙化区，将辐射区与软骨下骨分开的薄层。受影响的区域越深，由退变性骨关节炎引起的损伤就越严重。无论是归因于炎性疾病还是产生于由增龄或过负荷引起的生理关节老化，其M过程相同，涉及相同的区域。这样的药理学治疗在疾病的长期化阶段将是最有用的能够给细胞外基质提供其重构其蛋白聚糖的复杂结构而需要的"结构单元"，以增强其承重骨架并预防细胞损失。本发明证明对于这些目的而言，施用硫酸化透明质酸代表了有效的治疗途径，因为其增加构成软骨基质的"骨架"的物质在关节内的存在，并通过确保其结构完整性防止其脱细胞化。因此，本发明的制剂还可用于预防软骨损伤。申请人进行的体内试^ii明HA-S以出人意料地比其它GAG和非硫酸化HA高的程度延緩了细胞外基质基本结构的降解并刺激了其再生。按照EP702699Bl中所述的方法制备适于本发明目的的硫酸化透明质酸硫酸化采用SO;j-吡啶复合物进行，其包括多糖链中存在的醇羟基。采用通过提取、发酵或技术手段产生的HA，从具有50,000至800,000D、优选100,000至230,000D的不同分子量的HA开始，硫酸化的程度可以为0,5至3.5(EP0940410Bl)，优选为0.5至1.5(平均等级定义为1:1的硫酸基:二糖基)。所获得的衍生物保持了起始聚合物的全部物理特征；特别而言，HA的分子量没有被硫酸化过程改变，由此允许保持了与起始多糖相同的粘性。通过将如下HA-S与未经处理的对照进行比较进行了下述试验所述HA-S通过发酵产生，平均分子量为180/200KD，平均硫酸化程度为1，进行基于Condral(硫酸半乳糖氨基葡糖醛酸聚糖(galactosaminoglucuronoglycan),石克酸软骨素的解聚合形式)的参t匕；台疗和基于HA(分子量为180/200KD)的治疗。试验没计退变性骨关节炎的诱导和治疗严格按照现行法规、使用成年兔进行试验。根据已确立的试验模型，通过手术切除前交叉韧带来单向地诱发右膝退变性骨关节炎(Yoshimi等人.a/wOr狄w及e/Wi^s，1994，298:296-304)。所用试验模型不会触发炎性过程，如通过所有经处置动物、包括对照动物的关节腔内完全没有血浆渗入所证明的那样(下表)。因此，手术切除韧带代表了实验性退变性骨关节炎的良好实例，其允许校正所测制剂的药理学评价。将动物分成4个均一的组(每组6只动物)，在手术后24小时每天采用如下物质进行口服处理，共61天-0.9%NaCl盐7jc溶液(对照)；-HA-S，剂量为5.5mg/kg;誦HA，剂量为20mg/kg;-Condral,剂量为20mg/kg。在治疗结束时，将动物处死，目视检查不存在全身毒性。然后，将股骨的外侧髁和内侧髁与胫骨板在緩冲至10%的福尔马林中固定并包埋在石蜡中。然后通过本领域技术人员已知的方法对该制品进行加工，以获得在用苏木精-伊红染色后可以在光学显微镜下进行分析的切片。然后将从内侧和外侧股骨髁除去的软骨组织进行半定量组织病理学分析和组织形态学分析。具体而言，将有关软骨降解和结构完整性以及软骨厚度磨损的程度的参数纳入考虑。结果分析表:組滑膜:血浆渗入软骨组织:血浆渗入对照00HAS0」0HA00Condral00如已经指出的那样，滑液和软骨中完全不存在血浆浸润证实，在用NaCl处置的对照组中和在所有研究组中关节腔中完全没有炎症。对动物及其器官的目测分析也证明，所测的药理组合物没有全身毒性。图l概括了由软骨检查收集的数据在用盐水溶液处理的动物组(对照)中，以细胞组分的形态学改变为特征的严重退变性是明显的。用Condral处理的动物的情况较好；在这种情况下，软骨退变估计为2.8，因此是中等/显著的；值得注意的是，该结果与用HA治疗获得的结果非常类似。用8HA-S治疗的动物的软骨的情况好得多降解水平轻孩i(1.7)。因此，口月良施用HA-S被证明在显著降低受退变性骨关节炎影响的关节的软骨降解过程方面是有效性。第二个重要的评价涉及软骨组织结构完整性的分析，其按照公认的标准针对表面和软骨结构的不规则进行测定(图2)。该图同前图一样，证实了与对照以及与Condraf治疗相比，使用HA-S治疗以显著的程度有助于保持良好的结构完整性。用HA-S治疗的动物组仅在移行软骨区呈现轻微的裂紋，而用Condral⑧治疗的那些动物则在辐射区呈现显著的损伤；与HA治疗有关的发现特别令人感兴趣，HA再次被证明与Condra^—样有效。最后，fi^说明了损伤沿软骨整体厚度的深度，最大损伤是软骨完全丧失后引起骨组织暴露的损伤。数据说明了外侧髁和内侧髁损伤的平均值；其再次证实HA-S口月良治疗在保持软骨基质完整性方面比单独的Condra^治疗或HA治疗更有效。本文提供的数据分析清楚地说明，HA-S在治疗非炎性骨关节炎方面比硫酸化GAG和HA更有效，无论非炎性骨关节炎产生于创伤/疾病还是由产生于正常的关节老化过程。如果需要的话，有可能将HA-S与其它可用于增强细胞外基质的分子如胶原蛋白(有可能是水解的)或其它GAG联合，或者与其它药理学和/或生物活性物质如生长因子和/或激素、维生素(尤其是维生素A、C、D和E，通常是B族维生素)、抗生素和矿物盐(尤其是钩、镁、硒盐和其它痕量元素)联合。因此，本文所述和所要求保护的方法代表了对所讨论障碍的现行口服治疗的确定改进。口服施用HA-S所获得的出人意料的结果以及透明质酸衍生物已知的化学物理特性和药理学特性也提示有可能通过注射、特别是关节内注射施用这些制剂，其受限于没有炎性症状的慢性退变性骨关节炎。在这种情况中，也有可能将HA-S与其它分子如其它GAG或其它药理学和/或生物活性物质如生长因子和/或激素、维生素、抗生素和抗病毒剂联合。以下通过非限制性举例的方式描述了用于口服和关节内施用的含有本发明的HA-S的制剂的一些制备实施例。HA-S可以根据现有技术的状态以所有已知的方式与稳定剂、赋形剂、防腐剂和/或其它祐^人为可用于获得最佳可能制剂的物质联合进行配制，用于制^粒、混悬液、溶液、胶嚢和片剂。口服制剂在这些制剂中使用的HA具有的平均硫酸化程度为1，平均分子量为180/200KD;活性成分的浓度范围为50至400mg/单位剂量。实施例1HA-S75mg硬明胶胶嚢<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>首先将HA-S、乳糖、玉米淀粉和无水胶体二氧化硅混合。向所得预混合物中加入硬脂酸镁并混合。将最终混合物分配至00号硬明胶胶嚢中。实施例2HA-S200mg石更明胶胶嚢<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>无水胶体二氧化硅5硬脂酸镁5首先将HA-S、微晶纤维素、玉米淀粉和无水胶体二氧化硅混合。向所得预混合物中加入硬脂酸镁并混合。将最终混合物分配至00号硬明皿嚢中。实施例3HA-S400mg硬明胶胶嚢组成量(mg/粒胶嚢)活性成分HA-S400赋形剂孩吏晶纤维素适于00号胶嚢容量的量玉米淀粉35.1无水胶体二氧化硅硬脂酸镁5首先将HA-S、微晶纤维素、玉米淀粉和无水胶体二氧化硅混合。向所得预混合物中加入硬脂酸镁并混合。将最终混合物分配至00号硬明皿嚢中。实施例4HA-S400mg颗粒组成量(mg/袋)活性成分HAS400赋形剂微晶纤维素65玉米淀粉15.511<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>首先将HAS1、微晶纤维素和玉米淀粉混合。然后与由水和聚乙烯吡咯烷酮组成的粘合剂溶液混合。当混合物均匀润湿时，过2mm筛制粒。将颗粒干燥，然后将干燥的颗粒过筛使其通过0.8mm筛。将颗粒粉末与山梨醇、柠檬酸、阿斯巴甜和桔子香精混合。将颗粒填充入小药嚢中。可注射制剂在无菌无热原盐水溶液中制备等级为1或2、平均分子量为180/200KD或500/750KD的HA-S的溶液，浓度为l-100mg/ml、优选5-50mg/ml、甚至更优选10-20mg/ml，其优选用于可注射的关节内制剂。最终的溶液必须是无菌和无热原的。还可以将其冷冻干燥并在使用时重构。权利要求1.含有硫酸化透明质酸的药物组合物，用于预防和/或治疗由退变性骨关节炎引起的软骨损伤和/或归因于关节结构老化的磨损。2.如权利要求1所要求的药物组合物，其中透明质酸的分子量为50,000至800,000D。3.如权利要求2所要求的药物组合物，其中透明质酸的分子量为100,000至230,000D。4.如权利要求2所要求的药物组合物，其中透明质酸的分子量为500,000至750,000D。5.如权利要求l-4所要求的药物组合物，其中硫酸化透明质酸的硫酸化程度为0.5至3.5。6.如权利要求5所要求的药物组合物，其中硫酸化透明质酸的硫酸化程度为0.5至1.5。7.如权利要求l所要求的药物组合物，其中透明质酸通过提取、发酵或技术手段产生。8.如权利要求1-7所要求的药物组合物，其中含有胶原蛋白和/或水解胶原蛋白和/或糖胺聚糖。9.如权利要求1-7和8所要求的药物组合物，其中含有药理学和/或生物活性物质。10.如冲又利要求9所要求的药物组合物，其中药理学和/或生物活性物质选自维生素和/或矿物盐和/或激素和/或抗生素和/或生长因子。11.如前述权利要求所要求的药物组合物，用于预防和/或口服治疗由退变性骨关节炎引起的软骨损伤和/或归因于关节结构老化的磨损。12.如权利要求11所要求的药物组合物，其中硫酸化透明质酸的浓度为75至400mg/单位剂量。13.如前述权利要求所要求的药物组合物，用于关节内治疗由退变性骨关节炎引起的软骨损伤和/或归因于关节结构老化的磨损。14.如权利要求13所要求的药物组合物，其中硫酸化透明质酸的浓度为1至100mg/ml。15.如权利要求14所要求的药物组合物，其中硫酸化透明质酸的浓度为10至20mg/ml。16.如前述权利要求的硫酸化透明质酸在制备适用于预防和/或口服治疗由退变性骨关节炎引起的软骨损伤和/或归因于关节结构老化的磨损的制剂中的用途。17.如前述权利要求的硫酸化透明质酸在制备适用于关节内治疗由退变性骨关节炎引起的软骨损伤和/或归因于关节结构老化的磨损的可注射制剂中的用途。全文摘要本发明涉及基于硫酸化透明质酸的口服和关节内制剂，其可有效治疗退变性骨关节炎。文档编号A61P19/02GK101454048SQ200780019656公开日2009年6月10日申请日期2007年5月3日优先权日2006年5月31日发明者D·雷尼尔,L·卡莱加罗申请人:菲迪雅制药股份公司