专利名称：：水不溶性喜树碱衍生物的亚微粒纳米颗粒及其制备方法水不溶性喜树碱衍生物的亚微粒纳米颗粒及其制备方法[
技术领域：
]本发明涉及一种包括喜树碱衍生物、固体聚乙二醇和抗締合剂的纳米颗粒组合物，及其制备方法。特别地，本发明提供一种包括喜树碱衍生物的纳米颗粒的组合物，其是通过将水溶性差的喜树碱衍生物固体-分散在固体聚乙二醇中，并将该固体分散体溶于包含抗締合剂的水溶液中制备的。本发明的组合物将具有生理活性的喜树碱衍生物内酯形式稳定在pH4至7的水溶液中，因此可用作抗癌剂或用于治疗细胞分裂相关疾病。7-乙基-10-羟基喜树碱，被称为SN-38，是一种市售可获得的抗癌剂依立替康(CPT-11)的活性代谢物。据报道，SN-38通过结合拓朴异构酶I来抑制细胞分裂期间的DM合成而诱导细胞死亡，拓朴异构酶I是一种参与细胞分裂过程的酶。然而，SN-38的水溶性差，即水溶性为10jiig/ml或更低，因此，很难开发SN-38作为临床产物。为此，将SN-38转化成在水中具有较高溶解度的前药，即CPT-ll，其已经商业化。当将CPT-ll给药至人体时，在肝细胞或癌细胞中的酶羧基酯酶将其代谢成生理活性的SN-38,其显示出抗癌作用。然而，据报道，在人体中CPT-ll转化成活性SN-38的转化速率仅仅为约10%或更低。与CPT-11相比，SN-38抑制拓朴异构酶I的活性为约l，OOO倍或更高，体外细胞毒性为约2,000倍或更高。进一步地，已知SN-38在酸性条件下呈活性内酯形式存在，在碱性条件下呈非活性羧基阴离子形式存在，取决于水溶液的pH。SN-38的羧基阴离子形式可以以4mg/ml或更高的量溶于水中，但其活性内酯形式具有的水溶性为10jag/ml或更低。因此，如果SN-38可以以临床显著的浓度或更高浓度增溶，其可以被开发为优良的抗癌剂。为此，进行了有关包括SN-38的组合物给药至人体的研究。US5,447,936、US5,859,023、US5,674,874、US5,958,937、US5，900，419等公开了通过将SN-38溶于极性有机溶剂中得到的组合物，所述极性有机溶剂比如二曱基乙酰胺、N-曱基-2-吡咯烷酮、二甲基异山梨糖醇酯(dimethylisosorbide)等。然而，人体可耐受的这种极性有机溶剂的量受到限制，并且因为当与水混合时，药物可沉淀，因而所述药物的静脉注射受到限制。而且，当将溶解在有机溶剂中的组合物暴露于pH7.4的体内条件时，SN-38的活性所必需的内酯形式立即分解成其羧基阴离子形式。US-A-2003/0215492描述了一种通过形成SN-38和脂质的复合物得到的脂质体制剂。在该发明中，羧基阴离子形式的SN-38是在pH8-10的水溶液中形成的，由此得到脂质体制剂，内酯形式的SN-38是在酸性条件下制备的。WO2002/58622描述了一种包括SN-38的脂质体组合物和制备该组合物的方法，US-A-2004/0009229描述了一种由喜树碱与稳定剂比如聚合物、脂质等的复合物制备的纳米颗粒组合物。在该文献中，为了提供其中具有粒径为二十或几百纳米的纳米颗粒稳定地悬浮在水溶液中的组合物，不是将SN-38加热或粉碎，而是将其与聚合物或脂质混合形成SN-38/聚合物或SN-38/脂质复合物的纳米颗粒。然而，上述文献没有提及内酯形式的喜树碱是否稳定地保持着。所述组合物的另一个不利的方面是由于与聚合物、脂质等形成复合物的步骤，而使制备过程非常麻烦。进一步地，喜树碱衍生物，特别是SN-38在水中的溶解性非常差，因此其不容易制剂。当根据常规增溶技术将它们溶解时，它们很容易在体液(pH7.4)中转化成其非活性形式，即羧基阴离子形式。[技术问题]本发明人证实可以通过如下方法获得在体液中稳定地保持着的喜树碱衍生物的内酯形式，所述方法包括在高温下，将喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中，快速冷却，然后将其溶于水中，得到SN-38的纳米颗粒，从而完成了本发明。特别地，本发明的特点在于将喜树碱衍生物固体-分散在水溶性的聚合物聚乙二醇中，然后将其溶于水中，以有效地得到喜树碱衍生物的纳米颗粒，而不是粉碎所述喜树碱衍生物或者形成喜树碱衍生物与聚合物的复合物等。本发明的目的是将喜树碱衍生物配制成可以临床施用于人体的制剂。本发明人证实当经由静脉注射给药至身体时，转化成亚微粒纳米颗粒的形式的喜树碱衍生物在血液中显示出比由极性有机溶剂、胶束等增溶的现存组合物更优良的内酯稳定性。图1为在制备例1中制备的一甲氧基聚乙二醇-聚交酯嵌段共聚物(mPEG-PLA)的卞-NMR光傳。图2为在制备例2中制备的mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的^-NMR光谱。图3是显示使用小鼠的人大肠癌细胞系HT-29观察的平均相对肿瘤体积(RTV)随时间变化的图表，所述小鼠注射了含SN-38的纳米颗粒组合物、比较制剂或对照品。图4是显示使用小鼠的人胰腺癌细胞系MIA-PaCa-2观察的平均相对肿瘤体积(RTV)随时间变化的图表，所述小鼠注射了含SN-38的纳米颗粒组合物、比较制剂或对照品。本发明涉及一种喜树碱衍生物的纳米颗粒組合物，其包括所述喜树碱衍生物、固体聚乙二醇和抗締合剂，所述抗締合剂选自两亲性嵌段共聚物和固体表面活性剂。6本发明进一步涉及用于制备所述纳米颗粒组合物的方法，其包括如下步骤(a)将喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中；(b)通过冷却在步骤(a)中得到的熔化物，形成固体分散体；和(c)将在步骤(b)中得到的固体分散体溶于两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂的水溶液中。下面详细阐述本发明的含喜树碱衍生物的纳米颗粒组合物及其制备方法。本发明的纳米颗粒组合物包括(1)作为活性组分的水溶性差的喜树碱衍生物，(2)作为分散介质的固体聚乙二醇，和(3)作为抗締合剂的固体两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂。在本发明中，"纳米颗粒"指包含分散药物的纳米尺寸的微小颗粒。其微小尺寸不会引起毛细管或注射针头阻塞，因此，可以经由静脉注射给药。根据本发明的含喜树碱衍生物的纳米颗粒为混悬剂形式的组合物，其中包含喜树碱衍生物的纳米颗粒悬浮在水溶液中。纳米颗净立的尺寸优选地为100至1000nm。本发明的活性组分水溶性差的喜树碱衍生物具有的水溶性为10Hig/ml或更低。因此，临床使用喜树碱衍生物而不采用特定的增溶技术是不可能的。所述喜树碱衍生物是基本上具有内酯形式的喜树碱的化合物。在本发明中的喜树碱衍生物优选地是喜树碱或7-乙基-IO-羟基喜树碱(SN-38)。本发明的固体聚乙二醇用作用于分散所述喜树碱衍生物的介质。其在室温下呈固体存在，并可以具有40-60匸的熔点。聚乙二醇的重均分子量优选地为1，500至20，000道尔顿，但更优选地为2，000至IO，OOO道尔顿，最优选地为2，000至6，000道尔顿。当聚乙二醇的重均分子量为1,500道尔顿或更高时，其在室温下可以呈固体存在。当其重均分子量超过20,OOO道尔顿时，产生高粘性的问题。聚乙二醇可以以直链或支链结构存在，其中直链结构是优选的。聚乙二醇的两端优选地被下述基团保护羟基，烷基，优选(CH)烷基，或酰基，优选烷基羰基或芳基羰基(芳基包括苯基、萘基等)，例如(Ch》醜基，但更优选羟基。特别地，在实施本发明中，优选的聚乙二醇在水溶液中具有的pH值为4至8。具有超过8.0的pH值的聚乙二醇可能在将内酯形式的SN-38转化成羧基形式中起作用，因此，是不期望的。当药物喜树碱衍生物的含量相对于聚乙二醇增加时，纳米颗粒的尺寸增加。因此，为了保持纳米颗粒的尺寸为100至1000nm，优选地使用相对于喜树碱衍生物的重量为50至1000倍量的聚乙二醇。本发明的纳米颗粒包括作为必要成分的抗締合剂。如果将其中喜树碱衍生物分散在固体聚乙二醇中的固体分散体悬浮在水溶液中并如此静置，可能会出现纳米颗粒之间的締合，导致粒径增加。为了防止纳米颗粒之间的这种締合，本发明中必须使用抗締合剂。作为抗締合剂，固体两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂是优选的。因为为了使该组合物在长期储存期间保持稳定，所述纳米颗粒组合物优选地在最后步骤冷冻干燥，所以所述抗締合剂必须在室温下呈固体存在。因此，所述固体两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂应当在室温下是固体。所述抗締合剂优选地具有的熔点为3ox:或更高，水溶性为1mg/ml或更高，应当在水溶液中形成胶束，并且当施用于人体时，不应当显示出任何毒性，比如引起过敏反应等。符合上述要求的两亲性嵌段共聚物优选地为A-B型二嵌段共聚物，其中所述亲水性嵌段(A)具有的重均分子量为l，OOO至10，000道尔顿，所述疏水性嵌段(B)具有的重均分子量为500至10，000道尔顿。每个嵌段的重均分子量的下限为嵌段共聚物可以形成胶束的最小分子量。如果每个嵌段的重均分子量超过10，000道尔顿，由于高粘性不能保持溶液态，并且当给药人体后共聚物在血液中可能需要长时间分解，会引起不期望的毒性。特别优选的是所述嵌段共聚物以A-B型存在，其中亲水性嵌段(A)与疏水性嵌段(B)经由酯键结合。所述亲水性嵌段(A)与疏水性嵌段(B)的重量比可以是10-90%:90-10°/。。优选地，所述亲水性嵌段(A)为聚乙二醇或单曱氧基聚乙二醇，所述疏水性嵌段(B))选自聚乳酸、聚己8酸内酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚二噁烷-2-酮及乳酸和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物。特别地，为了增加所述两亲性嵌段共聚物A-B的疏水性，并最终提高所述喜树碱衍生物的亲和力，将选自月桂酸、棕榈酸(palmitoicacid)、硬脂酸、油酸、生育酚琥珀酸酯和胆固醇琥珀酸酯中的一种可以经由酯键加至疏水性嵌段(B)的末端。优选地，引入生育酚琥珀酸酯。两亲性嵌段共聚物的含量优选地为喜树碱衍生物重量的1至400倍，但更优选地为10至200倍。作为优选的抗締合剂的固体表面活性剂为在室温下是固体的非离子表面活性剂，优选聚乙二醇生育酚琥珀酸酯(TPGS)。合适的是所述聚乙二醇的重均分子量为1，000至5，000道尔顿。只有当聚乙二醇的重均分子量为1，000道尔顿或更高时，表面活性剂可以在室温下呈固体存在。如果重均分子量超过5，000道尔顿，可能产生不期望的高粘性问题。因此，这样的生理学可接受的和典型使用的表面活性剂如聚山梨酯、chremophore等作为用于本发明中的纳米颗粒的抗締合剂是不合适的，因为它们在室温下都呈液体存在。固体表面活性剂的含量优选地为喜树碱衍生物重量的l至400倍，但更优选地为IO至200倍。本发明的纳米颗粒可以配制成用于给药目的的多种药物形式。为了制备抗癌组合物，将本发明的纳米颗粒与可药用载体充分混合。这些药物组合物优选地配制成可以口服、肠胃外、皮下、直肠或局部给药以获得全身或局部作用的剂型。任何常见的药物栽体比如水、二醇、油、醇等都可以是口服液体制剂可接受的，这样的赋形剂如淀粉、糖、高冷土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等都可以是口服固体制剂可接受的。对于可注射的制剂，所述载体可以包括其它組分比如作为溶出助剂的半极性溶剂，但应当包括相当量的无菌水。作为在可注射的溶液中的载体，可以使用生理盐水、葡萄糖溶液或生理盐水和葡萄糖的混合物。可以使用合适的液体栽体、混悬剂等制备可注射的悬浮液。用于制备根据本发明的纳米颗粒组合物的方法包括下述步骤(a)将喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中；(b)通过冷却在步骤(a)中得到的熔化物，形成固体分散体；和(c)将在步骤(b)中得到的固体分散体溶于两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂的水溶液中。在步骤(a)中，将水溶性差的喜树碱衍生物与固体聚乙二醇混合，并优选地加热至60-180X:的温度。当加热时，应当持续搅拌该混合物至喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中。为了熔化固体聚乙二醇，溶化温度必须为60r或更高，持续搅拌有助于水溶性差的喜树碱衍生物溶于聚乙二醇中。为了避免喜树碱衍生物和聚乙二醇分解以及稳定地熔化它们，熔化温度必须为180X:或更低。考虑到喜树碱衍生物在聚乙二醇中的溶解性，所述喜树碱衍生物应当与固体聚乙二醇以可以充分熔化的比例混合。优选地，所述固体聚乙二醇以所述喜树碱衍生物重量的50至IOOO倍的重量比与所述喜树碱衍生物混合。另一方面，可以任选地将具有低沸点的有机溶剂用于上述熔化步骤中，以有效地将所述水溶性差的喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、二氯曱烷、丙酮和乙腈。喜树碱衍生物和固体聚乙二醇的熔化溶液是通过加入合适的有机溶剂，然后在减压下将有机溶剂除去制备的。如果在除去有机溶剂后，将该溶液连续地加热至60-180匸的温度，并均匀地搅拌，则可以满意地保持其中喜树碱衍生物熔化在聚乙二醇中的状态。在步骤(b)中，将从步骤(a)得到的其中喜树碱衍生物熔化在聚乙二醇中的熔化溶液快速冷却，优选地冷却至ox:或更低的温度，形成固体分散体。优选地使用例如液氮尽可能快速地冷却该熔化的溶液。如果緩慢地冷却该熔化的溶液，聚乙二醇可以结晶出，引起水溶性差的喜树碱衍生物的粒径增加。在步骤(c)中，将从步骤(b)得到的固体分散体溶于包含抗締合剂的水溶液中，得到包含喜树碱衍生物的纳米颗粒的水性混悬液，所述抗締合剂选自两亲性嵌段共聚物和固体表面活性剂。聚乙二醇可以溶于水溶液中，但是分散在聚乙二醇中的喜树碱衍生物不溶于水中。因此，聚乙二醇溶解，分散在纳米颗粒尺寸中的喜树碱衍生物悬浮在水溶液中。如果水溶液显示出pH7.5或更高的碱性，所述水溶性差的喜树碱衍生物会转化成其羧基阴离子形式，因此，优选地保持纳米颗粒的水溶液为pH4-7,以防止这种转化。可以使用的pH调节剂优选地为柠檬酸、乙酸、酒石酸、碳酸、乳酸、硫酸、磷酸或其碱金属盐，比如钠盐或钾盐、或铵盐，最优选乳酸。有可能地是，包含在上述制备的纳米颗粒悬浮液中的喜树碱衍生物的浓度范围为0.1-4mg/ml，但优选0.2-2mg/ml。将其中所述喜树碱衍生物分散在固体聚乙二醇中的固体分散体溶于包含抗締合剂的水溶液中，以制备其中悬浮包含喜树碱衍生物的纳米颗粒的水溶液。在本文中，优选地所述抗締合剂溶于所述水溶液中的浓度为1-200mg/ml，溶液的pH范围为4.0-7.0。为了增加固体聚乙二醇在水中的溶出速率，提高温度至0至60X:是可能的。优选地，溶出在30。C或更低的温度下进行。可以使用超声处理来增加聚乙二醇在水中的溶出速率，并且诱导包含水溶性差的喜树碱衍生物纳米颗粒的均匀分散。用于制备根据本发明的纳米颗粒的方法可以包括用于冷冻干燥从步骤(C)得到的水溶液的另一个步骤(d)。在步骤(d)中，冷冻干燥从步骤(c)得到的悬浮在水溶液中的包含喜树碱衍生物的纳米颗粒，在这期间，优选地将选自乳糖、甘露醇和山梨醇的冷冻干燥助剂加入所述水溶液中。如上制备的冷冻千燥形式的本发明的纳米颗粒可以通过在注射用水或生理盐水中稀释或重构来使用。如果用注射用水、生理盐水、5%的葡萄糖溶液等将本发明的纳米颗粒重构成喜树碱衍生物的浓度为0.1-1.Omg/ml，则该溶液中活性内酯形式的喜树碱衍生物的含量基本上为100%。该溶液可以口服或肠胃外给药。下述实施例将更清楚地解释实施本发明的方式。然而，应当理解这些实施例是用来阐述本发明，决不限制本发明的范围。本发明的其它方面对本发明所属领域的普通技术人员是显而易见的。制备例1单甲氧基聚乙二醇-聚交酯(mPEG-PLA)嵌段共聚物(AB型)的聚合将500g的单甲氧基聚乙二醇(重均分子量；Mw:2，000)引入到100ml的2-颈圆底烧瓶中，并在减压下加热至IOOX:2-3小时以除去水。用无水氮气充满该反应烧瓶。使用注射器以相对于D，L-丙交酯0.1。/。重量(lg,2.5mol)的量加入反应催化剂辛酸亚锡[Sn(Oct)2]。在搅拌30分钟后，将该混合物放置在130TC和减压(lmiiiHg)条件下1小时，以除去催化剂溶于其中的溶剂(甲苯)。加入1375g纯化的丙交酯，并在130C加热18小时。将得到的聚合物溶于二氯甲烷中，通过加入乙醚沉淀出。在真空烘箱中干燥如此得到的聚合物48小时。得到的mPEG-PLA具有的重均分子量为1,765-2，000道尔顿，通过1H-NMR确认其为A-B型(图1)。制备例2mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的合成在室温下，使在制备例1中得到的mPEG-PLAaOg)和生育酚琥珀酸酯(SigmaCo.，1.55g;聚合物的摩尔量的1.2倍)与二环己基碳二亚胺(DCC;0.76g)和催化剂二甲基氨基吡啶(DMAP;0.045g)在溶剂乙腈(50ml)中反应24小时。在反应完成后，通过玻璃滤器过滤除去副产物二环己基碳脲(DCU)。通过用盐酸水溶液萃取除去残留的催化剂。向纯化的产物溶液中，加入硫酸镁以除去残留水分。产物在正己烷/乙醚(v/v-7/3)的助溶剂系统沉淀出，重结晶，得到mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯。过滤沉淀的聚合物产物，并在真空中干燥，得到白色颗粒(10g;产率88.6%)，通过^-NMR确认其特性(图2)。制备例3mPEG-PLA-棕榈酸酯的合成12将在制备例1中得到的mPEG-PLA(lOg)和棕榈酰氯溶于乙腈(50ml)中，并回流6小时。在反应完成后，将反应产物加入到正己烷/乙醚(v/v=7/3)的助溶剂系统中，沉淀出mPEG-PLA-棕榈酸酯。过滤得到的聚合物沉淀物，并在真空下干燥，得到白色固体(12g;产率95%)。[实施例]实施例1SN-38/PEG4000/mPEG-PLA生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物纳米颗粒的制备将SN-38(5mg)和聚乙二醇(分子量4000道尔顿，1000mg)引入250ml的圆底烧瓶中，该圓底烧瓶置于160'C的油浴中。当用磁力搅拌器搅拌时，使该混合物在室温下静置2小时以将SN-38熔化在聚乙二醇中。接着，将该反应容器冷却至室温，然后，通过将该容器放置在液氮中快速冷却以产生SN-38分散在其中的固体聚乙二醇。将10ml在制备例2中得到的两亲性二嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯以50mg/ml的浓度溶于其中的水溶液加入其中。在超声处理下溶解该固体聚乙二醇，得到其中悬浮SN-38纳米颗粒的水溶液。加入500mg的乳糖一水合物并溶解。调节该水溶液的pH至4.0-7.0。通过具有孔径为800nm的过滤器过滤得到的包含SN-38纳米颗粒的水性悬浮液，并冷冻干燥。用注射用水重构该冷冻干燥的组合物，然后分析SN-38的产率、在重构后纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度、SN-38内酯的含量和纳米颗粒的尺寸。从最终回收的SN-38水溶液中的SN-38的含量相对于通过在合适的含水溶剂中透析或离心(30，000xg，lh)的SN-38的最初含量来确定样品的产率。将样品溶于甲醇中，通过HPLC来测量SN-38在样品水溶液中的浓度。根据在使用C18Vydac柱的HPLC分析中，在大约4分钟的羧基阴离子峰和在大约12分钟分钟的内酯峰值来测定SN-38内酯含量，计算相对于pH10的碱性水溶液中总羧基离子含量或pH2的酸性水溶液中总内酯含量而言SN-38水溶液中的内酯含量。通过DLS(动态光散射)方法来测量样品的粒径。-PEG4000/mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物的重量比2/1-SN-38的产率98%-在重构后，纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度0.5mg/ml-SN-38内酯的含量100%-纳米颗粒的尺寸400nm实施例2SN-38/PEG4000/mPEG-PLA-生育酚(tocophenrol)琥珀酸酯嵌段共聚物纳米颗粒的制备将SN-38(10mg)和聚乙二醇(分子量4000道尔顿，3000mg)引入500ml的圆底烧瓶中。加入100ml的曱醇和250ml的二氯甲烷以充分溶解SN-38和聚乙二醇。在减压下除去有机溶剂。然后，将得到的混合物加热至160匸，并使其静置2h，同时使用磁力搅拌器连续搅拌以将SN-38熔化在聚乙二醇中。将该反应容器冷却至室温，然后，通过将该容器放置在液氮中快速冷却以产生SN-38分散在其中的固体聚乙二醇。将10ml在制备例2中得到的两亲性二嵌段共聚物mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯以50mg/ml的浓度溶于其中的水溶液加入其中。在超声处理下溶解该固体聚乙二醇，得到其中悬浮SN-38纳米颗粒的水溶液。加入600mg的乳糖一水合物并溶解。调节该水溶液的pH至4.0-7.0。通过具有孔径为800nm的过滤器过滤得到的包含SN-38纳米颗粒的水性悬浮液，并冷冻干燥。用注射用水重构该冷冻干燥的组合物，然后分析SN-38的产率、在重构后纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度、SN-38内酯的含量和纳米颗粒的尺寸。-PEG4000/mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯嵌段共聚物的重量比6/1-SN-38的产率99%-在重构后，纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度0.5mg/ml-SN-38内酯的含量100%-纳米颗粒的尺寸500nm实施例3基于SN-38/PEG4000/mPEG-PLA嵌段共聚物的纳米颗粒组合物的制备根据如实施例l相同的方法制备SN-38纳米颗粒组合物，不同在于使用lg在制备例1中得到的mPEG-PLA嵌段共聚物(Mw;1，800-2，000)、8g的PEG4000和40mg的SN-38。用注射用水重构该制备的组合物，然后分析SN-38的产率、在重构后纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度和SN-38内酯的含量。-PEG4000/mPEG-PLA嵌段共聚物的重量比:8/1-SN-38的产率90%-在重构后，纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度0.4mg/ml-SN-38内酯的含量100%实施例4基于SN-38/PEG4000/mPEG-PLA-棕榈酸酯的纳米颗粒组合物的制备根据如实施例l相同的方法制备SN-38纳米颗粒水溶液，不同在于使用lOOmg在制备例3中得到的mPEG-PLA-棕榈酸酯、400mg的PEG4000和1.Omg的SN-38。用注射用水重构该制备的组合物，然后分析SN-38的产率、在重构后纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度和SN-38内酯的含量。-PEG4000/mPEG-PLA-棕榈酸酯的重量比4/1-SN-38的产率95%-在重构后，纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度0.5mg/mi-SN-38内酯的含量100%实施例5基于SN-38/PEG4000/生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)的纳米颗粒组合物的制备根据如实施例l相同的方法制备SN-38纳米颗粒水溶液，不同在于使用70mg的生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，维生素-E聚乙二醇一1000—號多白酸酉旨，EastmanChemicalCo.,KingsportTerm.，Mn;1，000)、21g的PEG4000和70mg的SN-38。用注射用水重构该制备的组合物，然后分析SN-38的产率、在重构后纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度和SN-38内酯的含量。-PEG4000/生育酚-聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS，Mn;l，OOO)的重量比300/1-SN-38的产率93%-在重构后，纳米颗粒水溶液中SN-38的浓度0.7mg/ml，-SN-38内酯的含量100%实施例6基于包含SN-38固体聚乙二醇的纳米颗粒组合物的制备根据固体聚乙二醇的分子量，制备仅使用在下表中显示的重量比的药物和分散介质固体聚乙二醇的组合物。根据如实施例l相同的方法制备每种组合物。然而，在最后的步骤中，加入不含有抗締合剂的pH5-6的水溶液(lml)，得到最终组合物。在室温下，在制备后(Oh)立即、4小时和24小时后，测量所得組合物的納米颗粒尺寸。用具有孔径为800nm的过滤器过滤组合物，并测量滤液中药物的浓度，以测定如在表l中显示的药物含量。[表l〗组合物l-9的组分比例、粒径和药物含量药物分散介质[固体聚乙二醇]粒径(nm)含量(mg/ml)SN-38(mg)PEG2000(mg)PEG4000(mg)PEG10，000(mg)0h4h24h组合物11200—-950130020000.15组合物21300—-930100017000,20组合物31400一-75090015000.45组合物41一200-600100015000.30组合物51—300-50090011000.50组合物61—400-權85010000.65组合物71——20040080011000.40组合物81一—30035075010000.65组合物91——楊憎70010000.75使用固体聚乙二醇而不含抗締合剂制备的SN-38纳米颗粒水性悬浮液显示出随时间不稳定的粒径，在室温下将其静置24小时后，得到lOOOnm或更高的粒径。因此，需要使用这样的抗締合剂作为表面活性剂来确保所述组合物的稳定性。实施例7包含SN-38的纳米颗粒组合物为了补充实施例6的结果，使用充当表面活性剂的抗締合剂来制备包含SN-38的纳米颗粒组合物。根据如实施例1相同的方法制备在下表2中显示的重量比的SN-38纳米颗粒组合物。向这些组合物中加入相对于总组合物重量比为15%的用作冷冻干燥时结块物质的D，L-甘露醇。在室温下，搅拌该混合物15分钟。用具有孔径为800nm的过滤器过滤得到的纳米颗粒水溶液，将等量的该物质分布在玻璃小瓶中以便包括相同含量的药物，并冷冻干燥。用生理盐水重构该冷冻干燥的组合物至浓度为0.5mg/ml。在室温下，在0小时(重构后立即)、4小时和24小时测量SN-38的粒径和pH，显示在表2中。17[表2〗组合物10-20的组分比例、粒径和药物含量<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>*a)mPEG-PLA-OH的分子量(道尔顿)[2K-1800]b)mPEG-PLA-生育酚琥珀酸酯的分子量(道尔顿)[2K-860-530]c)TPGS[d-oc-生育酚聚乙二醇IOOO琥珀酸酯]表2的组合物保持在水溶液中100%的内酯形式24小时。由于加入抗締合剂的结果，药物的粒径随时间是稳定的。试验例1包含SN-38的纳米颗粒组合物的稳定性将在实施例2、3和5中制备的每种注射用冷冻干燥的组合物贮藏在25'C下6个月。通过测量形态、保持比例(含量)、％内酯、再溶时间、pH变化和平均纳米颗粒尺寸来检验组合物的稳定性。将结果显示在表3中。[表3]注射用冷冻干燥的组合物的形态、保持比例(含量)、％内酯、再溶时间、pH变化和平均纳米颗粒尺寸(在25匸下贮存6个月后)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根据本发明制备的冷冻干燥的组合物甚至在长期储存后仍然稳定，据评价适于临床应用。试验例2包含SN-38的纳米颗粒组合物的药代动力学性质为了鉴定在实施例2、3和5中制备的每种冷冻干燥的组合物的药代动力学性质，将插管引入称重为200~250g的雄性Sprague-Dawley大鼠的颈静脉和颈动脉。经IO秒的时间间隔，经由尾部静脉以2mg/kg的剂量将每种组合物注入。在注射后5分钟、15分钟、30分钟、l小时、2小时、4小时和8小时，从颈动脉采集0.4ml的血液样品，离心得到澄清的上层血浆。向其中加入用10°/。的ZnS04和200mM的乳酸盐緩冲液(pH3.5)调节为pH5.5的甲醇，以分析血浆中药物的浓度。强力混合该混合物30秒，然后离心。收集上清液，转移到透明的管中。通过在下述条件的HPLC来测量浓度注射体积0.085ml流速1ml/分钟检测器FLD波长Ex355nm，Em515nm流动相乙腈/3%的三乙胺水溶液=80/20体积比的溶剂混合物，使用乙酸调节至pH5.5柱4.6x250mm(C18，Vydac，USA)分析从给药纳米颗粒中释放的SN-38内酯的血浆浓度，显示在表4中。作为比较制备例，使用在用生理盐水稀释后SN-38的水溶性前药，Campt(^注射剂(20mg/ml，CJPharma/Pfizer，USA)。[表4]从给药的纳米颗粒中释放的SN-38内酯的血浆浓度剂型SN-38内酯的血浆浓度Ug/ml)(mg/kg)5愤15愤30嫂1小时2小时4小时8小时实施例221.82620.43170.18730.05970.00730.00350.0027实施例324.08100.45820.15590.03680,00830.00290.0013实施例521.51900.18510.07450.02930.01700.00600.0066比较制鈔J60.21390.13030.05340.07050.04190.01790.003试验例3包含SN-38的纳米颗粒组合物的体内抗癌的活性使用在实施例2中制备的纳米颗粒组合物的功效来评价抗癌活性。作为比较制备例，使用在用生理盐水稀释至CPT-ll含量为1.5mg/ml的注射用Campto(20mg/ml，CJPharma/Pfizer,USA)。收集保存在液氮中的细胞，并进行体外细胞培养。收集细胞，用无菌磷酸盐緩冲盐水(PBS)洗涤，并计算活细胞。将细胞以约7xl07细胞/ml的数目再悬浮在无菌PBS中。将0.lml的包含7乂106人癌细胞(HT-29,MIA-Paca-2)的细胞悬液皮下注射至健康无胸腺棵鼠的右侧(nu/nu;20-25g，8周)。在癌生长至某一尺寸后，进行异种移植三次，以形成3-4mm的异种移植物。使用12标准规格的套管针(trocaneedle)，将该异种移植物皮下注射至健康无胸腺棵鼠(nu/nu;20-25g,8周)的右侧。在肿瘤体积达到100-300mm3后，给药药物。记录给药药物的当天，作为0天。在0天，将小鼠分成五(5)个组，在第0、1、2、3、4和5天，经由尾部静脉分别给药在实施例2中和在比较制备20例中制备的包含SN-38的纳米颗粒，并以不同的时间间隔测量肿瘤的体积。根据下述等式计算肺瘤体积。肿瘤体积(TV)-0,5xLxW2(L:主轴，W:短轴)相对肿瘤体积(RTVH(Vt/V。)xioo%(Vt:在t天的TV，V。在0天的TV)通过考虑平均肿瘤增殖曲线、最佳生长抑制(T/C。/。)和特定生长延迟(SGD)的所有方面来确定治疗效果。在最后注射后四周内的某天，通过治疗组比对照组的RTV中间值乘以100%(T/C。/。)来计算最佳生长抑制。经1至2个倍增时间如下计算SGD:特定生长延迟(SGD)=(TD处理组-T。对照组)/T。对照组TD:肺瘤倍增时间活性水平定义如下。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>为了证实试验的正确性，每个处理组使用至少7只小鼠，每组使用至少7种肺瘤。在处理开始时，初始肿瘤的直径为4mm，或体积为30mm3。将在最终给药所述药物后2周内死亡的动物归类为中毒性死亡，从评价中排除。具有超过三分之一动物死亡归于中毒性死亡的组，或者具有平均体重降低超过15%且没有显示出完全恢复迹象的动物的组被认为没有抗肿瘤活性。如从表5、图3和4可看到的，与对照组相比，用实施例2中制备的包含SN-38的纳米颗粒组合物处理的组显示出抗癌症生长相当大的抑制活性，其特别地高于比较制剂的抗癌活性。[表5]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*HT-29(CPT-ll20mg/kg，SN-3810mg/kg)**MIA-PaCa-2(CPT-ll10mg/kg，SN-3810mg/kg)[工业实用性〗根据本发明的纳米颗粒组合物为包含水溶性差的喜树碱衍生物的纳米颗粒混悬剂，其特征在于延迟了当用水溶液比如生理盐水稀释或重构时活性内酯形式向非活性形式的转化。而且，本发明的显著之处在于其提供水溶性差的喜树碱衍生物的增溶、纳米颗粒的制备及用于治疗癌症的新药的开发。权利要求1.一种喜树碱衍生物的纳米颗粒组合物，其包括喜树碱衍生物、固体聚乙二醇和抗缔合剂，所述抗缔合剂选自固体两亲性嵌段共聚物和固体表面活性剂。2.权利要求1的组合物，其中所述喜树碱衍生物是具有水溶性为10jug/ffll或更低的化合物。3.权利要求1或2的组合物，其中所述喜树碱衍生物是喜树碱或7-乙基-10-羟基喜树碱。4.权利要求1的组合物，其中聚乙二醇具有的重均分子量为l'500至20，000道尔顿。5.权利要求1或4的组合物，其中聚乙二醇的两端被羟基、烷基或酰基基团保护。6.权利要求1的组合物，其中所包含的聚乙二醇的量为所述喜树碱衍生物重量的50至1000倍。7.权利要求1的组合物，其中所述两亲性嵌段共聚物为A-B型二嵌段共聚物，其中所述亲水性嵌段(A)具有的重均分子量为1,000至10，OOO道尔顿，所述疏水性嵌段(B)具有的重均分子量为500至10，000道尔顿。8.权利要求7的组合物，其中所述亲水性嵌段(A)为聚乙二醇或单甲氧基聚乙二醇，所述疏水性嵌段(B)选自聚乳酸、聚己酸内酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚二噁烷-2-酮及乳酸和1,4-二噁烷-2-酮的共聚物。9.权利要求7或8的组合物，其中所述亲水性嵌段(A)为单甲氧基聚乙二醇，并且将选自月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、生育酚琥珀酸酯和胆固醇琥珀酸酯中的一种经由酯键加至所述疏水性嵌段(B)的末端。10.权利要求l的组合物，其中所述固体表面活性剂为聚乙二醇生育酚琥珀酸酯，其中的聚乙二醇具有的重均分子量为1，000至5，000道尔顿。11.权利要求l的组合物，其中所包含的每种抗締合剂的量为所述喜树碱衍生物重量的1至400倍。12.权利要求1的组合物，其中纳米颗粒的尺寸为IOO至1000nm。13.权利要求l的组合物，其中所述納米颗粒组合物以冷冻干燥的形式存在。14.权利要求l的组合物，其进一步包括可药用载体，并且用于治疗癌症。15.—种用于制备根据权利要求1的纳米颗粒组合物的方法，其包括步骤(a)将喜树碱衍生物熔化在固体聚乙二醇中；(b)通过冷却在步骤(a)中得到的熔化物，形成固体分散体；和(c)将在步骤(b)中得到的固体分散体溶于固体两亲性嵌段共聚物或固体表面活性剂的水溶液中。16.权利要求15的方法，其包括冷冻干燥在步骤(c)中得到的水溶液的另一个步骤。17.权利要求15的方法，其中在步骤(a)中的熔化温度为60-180r。18.权利要求15的方法，其中在步骤(a)中使用的有机溶剂选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮和乙腈，并且在减压下除去所述有机溶剂。全文摘要本发明涉及一种包含喜树碱衍生物、固体聚乙二醇和抗缔合剂的纳米颗粒组合物，及其制备方法。特别地，本发明提供一种包含喜树碱衍生物的纳米颗粒的组合物，其是通过将水溶性差的喜树碱衍生物固体分散在聚乙二醇中，并将该固体分散体溶于包含抗缔合剂的水溶液中制备的。本发明的组合物稳定了在体液中的具有有效的抗癌活性的喜树碱衍生物内酯形式。文档编号A61K9/16GK101516346SQ200780035833公开日2009年8月26日申请日期2007年9月20日优先权日2006年9月26日发明者任垠映,姜惠媛,徐敏孝申请人:株式会社三养社