专利名称：：修饰型促红细胞生成素的制作方法修饰型促红细胞生成素相关申请的交叉参者本申请要求于2006年8月4日提交的序号为60/835,429的美国临时申请的权益，该申请的全部内容在此引作参考，适于所有目的。1.发明领域本发明涉及新的蛋白缀合物、特别是新的PEG化蛋白、及其制备方法和用途。本发明的一个方面涉及与目前的促红细胞生成素制剂相比临床疗效更高且储存和运输期间稳定性更高的PEG化促红细胞生成素。2.背景近年来，非抗原水溶性聚合物(如聚乙二醇("PEG"))已用于具治疗和诊断重要性的多肽的共价修饰。PEG是一种无毒、非免疫原性、高水溶性并容易由体内清除的聚合物。PEG有许多应用，常用于食品、化妆品、々欠料和处方药。药用级PEG在美国已获FDA批准使用，其被广泛用作生物药物载体，已知其具有高度的生物相容性。PEG化可以修饰生物药物的某些特性而不改变其功能，因此提高其治疗效果。—般情况下，聚乙二醇分子通过蛋白质上存在的反应基团与蛋白质连接。氨基(如赖氨酸残基上或N末端的氨基)适合于该连接。可以用各种化学方法，通过链两端的羟基将PEG偶联到活性生物药物上。例如，据报道，将PEG共价连接到治疗性多肽，如白细胞介素类(Knauf，M.J.等，J.Biol.Chem.1988，263,15,064;Tsutsumi，Y.等，J.ControlledRelease1995，33,447)、干扰素类(Kita，Y.等，DrugDes.Delivery1990,6,157)、过氧化氢酶(Abuchowski,A.等，J.Biol.Chem.1977，252,3,582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp，C.O.等，Anal.Biochem.1983,131，25)和腺苷脱氨酶(Chen,R.等，Biochim.Biophy.Acta1981，660，293),可以延长它们在体内的半衰期，和/或减少它们的免疫原性和抗原性。已利用带不同反应部分的曱氧基化PEG("mPEG")通过氨基将PEG分子连接在多肽上。这类聚合物包括mPEG-琥珀酸琥珀酰亚胺酯、mPEG-碳酸琥珀酰亚胺酯、mPEG-亚氨酸酯和mPEG-氰尿酰氯。或者，通过固相合成，在生长激素释放因子的有效模拟物的N末端、侧链和C末端进行了位点特异性PEG化(Felix，A.M.等，Int.J.PeptideProteinRes.1995,46,253)。还用醛活化PEG进行了N末端的位点特异性PEG化；但是，该反应需要长反应时间且严重依赖于pH值。例如，该反应需要18-36小时，而且一般只在酸性pH有特异性，在中性或更高的pH时成为随机性(参见例如美国专利号6,077,939和5,985,265,它们中的每一个的全部内容皆在此引作参考)。这将可用多肽限制于能够经受长时间酸性条件的多肽。另外一个使用的方法涉及通过N末端苏氨酸的高碘酸钠氧化作用产生的N末端的活性醛基，以位点特异性方式将多肽连接到脂质体表面嫁接的PEG链的末端(Zalipsky,S.等，Bioconj.Chem.1995,6，705)。但是，该方法限于带有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的多肽。在多肽的C末端特异性地引入活性基团的酶辅助方法也已有描述(Schwarz,A.等，MethodsEnzymoL1990,184,160;Rose,K.等,BioconjugateChem.1991，2，154;Gaertner，H.F.等，J.Biol.Chem.1994,269,7224)。通常情况下，这些活性基团可以是酰肼、醛和芳基-氨基，用于随后将功能性探针连接至多肽。定点诱变是已被用于制备供聚合物定点连接用的多肽的另一种方法。WO90/12874描述了通过插入半胱氨酸残基或用其它残基取代半胱氨酸残基而修饰蛋白质的定点PEG化。该公开说明书还描述了通过将半胱氨酸特异性mPEG衍生物与EPO上重组引入的半胱氨酸残基反应，制备mPEG促红细胞生成素("mPEG-EPO")。同样，在定点突变后，将白细胞介素-2在其糖基化位点PEG化(Goodson，R.J.等，Bio/Technology1990，8，343)。糖蛋白提供碳水化合物作为修饰的额外輩巴点。业已对过氧化物酶用PEG-二胺通过其碳水化合物部分进行了〗奮饰(Urrutiogoity:M.等，Biocatalysis1989,2,145)。WO94/28024描述了通过高碘酸氧化的碳水化合物制备mPEG-EPO的方法。涉及的化学反应是，mPEG-酰肼与EPO上碳水化合物部分的醛基反应，形成腙。这种类型的修饰通过可以潜在地氧化碳水化合物部分中的各种糖残基和多肽中的某些氨基酸残基(如曱硫氨酸)的氧化步骤而产生活性醛基。促红细胞生成素需要改进的PEG化方法的示范蛋白是促红细胞生成素。红细胞生成是产生红细胞以补偿细胞损伤。红细胞生成是一种受控的生理机制，使得能够有足够的红血细胞以满足适当的组织氧合作用。天然存在的人促红细胞生成素(hEPO)是由肾脏产生的一种多肽，是刺激红细胞产生的体液血浆因子[Carnot,P和Deflandre,C(1906)C.R.Acad.Sci.143:432;Erslev，AJ(1953)Blood8:349;Reissmann,KR(1950)Blood5:372;Jacobson,LO,Goldwasser,E,Freid，W和Plzak,LF(1957)Nature179:6331-4]。天然存在的EPO刺激骨髓中定向祖红细胞的分裂和分化，并通过与红细胞前体上的受体结合而发挥其生物活性[Krantz，BS(1991)Blood77:419]。利用重组DNA技术已生物合成制造了促红细胞生成素[Egrie,JC，Strickland,TW,Lane，J等.(1986)Immunobiol.72:213-224]，该促红细胞生成素是将插入中国仓鼠卵巢组织细胞(CHO细胞)并在其中表达的克隆人促红细胞生成素基因的产物。主要的完全加工型hEPO的一级结构见SEQIDN0:1的图解。在Cys乙Cys161和Cys29-Cys33之间有二个二硫桥。无糖基组分的EPO多肽链的分子量是18,236Da。在完整的EPO分子(分子量约为33kD)中，使蛋白在其糖基化位点糖基化的碳水化合物基团占了大约40%的分子量[Sasaki，H,Bothner,B,Dell,A和Fukuda，M(1987)J.Biol.Chem.262:12059]。由于人促红细胞生成素在红细月包的形成中是必不可少的，所以在治疗特征为低或有缺陷的红细胞产生的血液病和扩大红细胞产生有利于患者的其他疾病时，该激素是有用的。例如，EPO已被用于治疗慢性肾功能衰竭患者(CRF)的贫血症[Eschbach,JW，Egri,JC，Downing,MR等(1987)NEJM316:73-78;Eschbach,JW,Abdulhadi，MH,Browne,JK等(1989)Ann.Intern.Med.Ill:992;Egrie,JC，Eschbach,JW，McGuire，T，Adamson，JW(1988)KidneyIntl.33:262;Lim，VS，Degowin,RL,Zavala,D等(1989)Ann.Intern.Med.110:108-114]和接受化疗的AIDS患者和癌症患者的贫血症[Danna，RP,Rudnick,SA,Abels,RI,在于MB,Gamick编辑，ErythropoietininClinicalApplications—AnInternationalPerspective.NewYork,N.Y.:MarcelDekker;1990:p.301-324]。然而，市售蛋白治疗药(如EPO)的生物利用度因其血浆半衰期短且易于被蛋白酶降解而受到限制。这些缺陷使他们无法实现最高的临床效力，一般要求更频繁的治疗或施用更大量的药物，这可导致副作用频率和严重程度提高以及患者对治疗时间表的依从性不足。蛋白质，包括天然EPO及其衍生化形式和修饰形式，一般都是用白蛋白(HSA或血清)调配，在降低温度的条件下储存和运输，以帮助保持产品的稳定性至使用。含有HSA血清的制剂是不符合要求，因为有污染人类感染性因子的风险，以及与药用级HSA和相关生物测定有关的高费用。ARANESP(达贝泊汀a,darbepoietinalfa)是市售EPO衍生物。这是有165个氨基酸的蛋白质，其与重组人红细胞生成素的不同之处在于它含5条N联寡糖链，而重组人红细胞生成素含3条链。额外的二个N-糖基化位点来自促红细胞生成素肽骨架上的氨基酸取代。额外的糖链使糖蛋白的近似分子量从30,000道尔顿增加至37,000道尔顿。ARANESP⑧以带不同赋形剂的两种制剂供应，一种含有吐温80,另一种含有白蛋白(HSA)(人血液的衍生物)。PEG化蛋白质(如EPO衍生物)已被公开(美国公开号2002/0115833、2003/0120045和2003/0166566)。然而，用于制备这些组合物的方法难以实施和控制、成本高、在合成中使用有毒化合物或有其他质量控制问题。此外，已知他们不能产生其生物活性高于未修饰型多肽天然功能的多肽缀合物。这样，仍迫切需要PEG化组合物和/或其生产方法，其中该生产方法实施更容易而成本更低，最重要的是更容易控制，以便制备可预见的和具一致性的产品。具体就EPO而论，需^^目对于现有制剂而言血浆半衰期改善、活性增强且对蛋白酶降解的易感性降低的制剂。此外，该制剂最好能够以无蛋白制剂和/或在标准条件下包装、运输和储存。本文中引用的包括专利文献在内的所有科学出版物，以其全部在此引作参考，并适于所有目的。3.发明概述本发明基于对新形式的一PEG化和二PEG化蛋白质[如促红细胞生成素("EPO")]及其混合物的意外发现。如使用EPO所证明的，相对重组人EPO和/或其他市售EPO治疗而言，本发明制剂表现出改善的体内活性，包括血浆半衰期与稳定性提高。本发明的EPO分子和组合物进一步表现出在无蛋白制剂中的长期稳定性，和/或在标准储存条件(即存储在标准温度，例如约25。C)下保持稳定。在某些实施方案中，本发明涉及药物制剂，其包含至少一个促红细胞生成素蛋白群体，其中每个促红细胞生成素蛋白与至少一个聚乙二醇分子共价连接；和无蛋白药用载体。在一个具体实施方案中，每个促红细胞生成素蛋白与一个聚乙二醇分子共价连接。在另一实施方案中，每个促红细胞生成素蛋白与二个聚乙二醇分子共价连接。在再一实施方案中，所述至少一个促红细胞生成素蛋白群体是第一群体和第二群体，其中第一促红细胞生成素蛋白群体连接一个聚乙二醇分子，第二群体连接二个聚乙二醇分子。在另一实施方案中，第一群体与第二群体之比为小于l比约100、约10比约90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于1,其中小于1包括用本领域已知的标准方法枱r测不到的数量。在又一实施方案中，每个促红细胞生成素蛋白通过特定的赖氨酸残基与至少一个聚乙二醇分子共价连接。在某些实施方案中，本发明包含组合物，其具有通过促红细胞生成素蛋白的氨基末端与至少一个聚乙二醇分子共价连接的至少一个促红细胞生成素蛋白，其中该共价连接不是通过醛基连接。在其它实施方案中，本发明包含组合物，其具有通过特定的赖氨酸残基与至少一个聚乙二醇分子共价连接的至少一个促红细胞生成素蛋白，其中该赖氨酸残基是赖氨酸116。在另一实施方案中，该制剂能够在无载体蛋白的制剂中存储较长时间周期，而不发生促红细胞生成素的实质降解。本发明还涉及到新型PEG化蛋白(如EPO)的制备方法和应用，特别在药物制剂中的应用。使用本文提供的制备方法，本发明的PEG化蛋白是一种缀合物，其中蛋白与至少一个聚乙二醇分子共价连接。在具体的实施方案中，本发明的PEG化蛋白是与一个或二个聚乙二醇分子共价连接的EPO分子。在本发明该方面的一个实施方案中，共价连接的方式是通过蛋白质的氨基末端。在本发明该方面的另一个实施方案中，共价连接通过EPO蛋白的赖氨酸残基(例如赖氨酸116)进行。因此，本发明的PEG化蛋白包括与至少一个聚乙二醇分子共价缀合的蛋白。在特定的实施方案中，本发明包括与一个或二个聚乙二醇分子共价缀合的EPO蛋白(即分别为一PEG化EPO或二PEG化EPO),和/或它们的混合物。在某些实施方案中，本发明的PEG化蛋白缀合物包括一PEG化蛋白。本发明的一PEG化蛋白在以下方面可以是一致的对于每个缀合物而言，聚乙二醇("PEG")分子通过相同的氨基酸残基共价连接到蛋白质。在其它实施方案中，本发明的一PEG化蛋白就以下方面而言包含多元缀合物(aplurialityofconjugates):对于每一缀合物而言，单个PEG分子与EPO蛋白通过该蛋白的不同氨基酸残基或N末端(即蛋白质的a-氨基)共价缀合，其中所述氨基酸残基是适合如本文所述的共价缀合PEG的氨基酸残基之一。在另外的实施方案中，本发明的PEG化蛋白缀合物包括具有多个PEG化位点的蛋白质，如，二PEG化蛋白。本发明的多PEG化蛋白在以下方面可以是一致的对于每个缀合物而言，两个或更多个PEG分子在相同的位点共价连接到每一蛋白质。在其它实施方案中，本发明的多PEG化蛋白就以下方面而言包含多元缀合物对于每一缀合物，两个或更多个PEG分子于蛋白中本文所述的适合共价结合PEG的氨基酸残基中的任两个或更多个可用氨基酸残基或蛋白的N末端与蛋白缀合。例如，在特定的实施方案中，本发明的EPO缀合物包含多种一PEG化和二PEG化EPO，其中EPO蛋白和PEG分子间的缀合位点不一致。因此，在特定的实施方案中，本文提供的制备方法可制备包含多元EPO缀合物(aplurialityofEPOconjugates)的组合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中所述多元缀合物包含于蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接的至少一个的缀合物，位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛连接。在另一实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含缀合物，其于蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接的至少一个，位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接；和以下缀合物中的一种或多种或全部缀合物，其在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中的至少一个；缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸52有所述一个或两个共价连接中的至少一个；和/或缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸154有所述一个或两个共价连接中的至少一个。在其它实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所迷缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含缀合物，其在蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中的至少一个，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接；和缀合物，其在本文所述或本领域已知的适于该连接的任何位点有所述一个或两个共价连4妄。在某些实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含缀合物，其在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中的至少一个。在另一实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含缀合物，其在赖氨酸116有所述一个或两个共价连"l妄中的至少一个；和以下缀合物中的一种或多种或全部缀合物，其在蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中的至少一个，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接；缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸52有所述一个或两个共价连接中的至少一个；缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸154有所述一个或两个共i^介连接中的至少一个。在另一实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含缀合物，其在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中的至少一个；和缀合物，其在本文所述或本领域已知的适于该连接的任何位点有所述一个或两个共价连接。在一个具体的实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含一PEG化EPO,其具有通过赖氨酸116共价连接至EPO蛋白的PEG分子。在另一实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含一PEG化EPO，其具有通过赖氨酸116共价连接至EPO蛋白的PEG分子；和以下缀合物中的一种或多种或全部缀合物，其在EPO蛋白氨基末端有所述一个或两个共价连接中的至少一个，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接；缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸52有所述一个或两个共^介连"f妄中的至少一个；和缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸154有所述一个或两个共价连接中的至少一个。在其它实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含一PEG化EPO,其具有通过蛋白氨基末端共价连接至EPO蛋白的PEG分子，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接。在另一实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含一PEG化EPO，其具有通过蛋白氨基末端共价连接至EPO蛋白的PEG分子，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接；和以下缀合物中的一种或多种或全部缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中的至少一个；缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸52有所述一个或两个共价连接中的至少一个；和/或缀合物，其在EPO蛋白的赖氨酸154有所述一个或两个共价连接中的至少一个。在某些其它实施方案中，本发明包括上述多元EPO缀合物中的任一种，进一步包含在本文所述或本领域已知的适于该连接的任何位点有所述一个PEG分子或两个PEG分子共价连接的缀合物。在某些实施方案中，本发明的多元蛋白缀合物包含至少一个缀合物群体，其中，所述至少一个群体包含共价连接至少一个PEG分子的蛋白。在其它实施方案中，所述至少一个蛋白缀合物群体是第一群体和第二群体，其中，所述第一群体连接一个PEG分子，第二群体连接两个或更多个PEG分子。在某些实施方案中，所述共价连接包括在蛋白质氨基末端的非醛连接。在具体实施方案中，所述至少一个蛋白缀合物群体是至少一个EPO缀合物群体，即第一群体和第二群体，其中，所述的第一群体是共价连接一个PEG分子的EPO-PEG,第二EPO-PEG群体是连接二个PEG分子的EPO蛋白。在某些实施方案中，第一群体与第二群体之比可以是以下范围小于1比约100、约10比90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于1,其中，小于1包括用本领域已知的标准方法检测不到的数量。本发明进一步包括多元蛋白缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接至少一个PEG分子的EPO蛋白，其中，对受试者施用所述多元缀合物，导致在注射后约24、36或48小时，其所述多元缀合物的血清浓度或所述多元缀合物的一个或多个组分的血清浓度比施用等量(例如按蛋白质浓度或活性单位、例如EPO单位计)的对照制剂所得到的所述浓度高至少约10%-700%。在一个有关本发明的多元EPO缀合物的具体实施方案中，对照制剂可以是例如重组人EPO(rhuEPO)、天然EPO或市售EPO制剂，如ARANESP(达贝泊汀a,darbopoietinalfa)。在一个具体实施方案中，将本发明的多元EPO缀合物施用(例如皮下、静脉)至Sprague-Dawley大鼠，导致在施用后约16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68或72小时，与对照EPO制剂的施用结果相比，其血清浓度提高了至少5%至700%。本发明包括本文所述和/或本领域已知的适用于向受试者递送治疗用蛋白(例如治疗用PEG化蛋白)的任何施用方法；这些方法包括但不仅限于肌内、胃肠外、肺部、鼻腔和经口方法。本发明的多元EPO缀合物还包括各种添加物质，特别包括本文所述和/或本领域已知的适用于向受试者施用的任何合适的药学可接受载体。在另一具体实施方案中，本发明包括多元蛋白缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，对受试者施用多元缀合物，导致在施用后约5、7、10、12、14、16、18或21天，其血细胞比容与施用等量(例如EPO单位)的对照EPO制剂[例如重组人EPO(rhuEPO)、天然EPO或市售EPO制剂，如ARANESP(达贝泊汀a，darbopoietinalfa)]所得血细胞比容相比，增加了至少5°/。-250%。在一个具体实施方案中，将本发明的多元EPO缀合物施用(例如皮下)至Sprague-Dawley大鼠，导致在施用后约5、7、10、12、14、16、18或21天，其血细胞比容与施用等量(例如EPO单位)的对照EPO制剂[例如重组人EPO(rhuEPO)、天然EPO或市售EPO制剂，如ARANESP(达贝泊汀ct，darbopoietinalfa)]所得血细胞比容相比，增加了至少5°/。-250%。本发明进一步包括药物制剂，其包含本文所述的多元蛋白缀合物，和/或包含所述多元缀合物的一个或更多个组分(例如共价连接一个PEG分子的EPO缀合物群体和/或共价连接二个PEG分子的EPO缀合物群体和/或共价连接一个或两个PEG分子的EPO缀合物群体，其中，所述的一个PEG分子或两个PEG分子共价连接中的至少一种位于蛋白质氨基末端，位于所述氨基末端的共价连接不是通过醛键连接)，和无蛋白[如无血清、无白蛋白、无人血清白蛋白("无hsa")]的药学上可接受的载体。在某些实施方案中，包含无蛋白药学上可接受载体的本发明药物制剂可贮存较长时间周期，用本文描述和/或本领域已知的方法检测，其促红细胞生成素没有实质的和/或可检测的降解。在某些实施方案中，本发明的药物制剂在这种无蛋白制剂中，在约-20。C或4。C储存至少15个月后检测，是稳定的(即不表现可检测的降解和/或不表现出实质的降解)。在其它实施方案中，本发明的药物制剂在这种无蛋白制剂中，在约25°。或约37。C储存至少10个月后检测，是稳定的(即不表现可检测的降解和/或不表现出实质的降解)。本发明药物制剂的稳定性可用本领域已知和/或本文描述的任何方法进行评估。在某些实施方案中，通过用bicinchoninicacid("BCA")蛋白测定法测定而监测蛋白浓度随时间的改变，评估本发明药物制剂的稳定性。在其它实施方案中，通过SDSPAGE分析测定蛋白质随时间的降解(即EPO缀合物降解)的示值，评估本发明药物制剂的稳定性。在其它实施方案中，通过监测所述制剂随时间推移的活性，评估本发明药物制剂的稳定性，其中，所述活性用本领域已知的用于测定所述制剂(例如EPO制剂)活性的任一体外或体内方法来测定。在按照该实施方案的具体实施例中，本发明的包含多元EPO缀合物的药物制剂的活性，通过所述药物制剂体外诱导干细胞分化为类红细胞的能力来评估。本发明的另一个方面涉及用包括下述步骤的方法制备的蛋白缀合物在反应緩沖液中让蛋白与活化水溶性聚合物反应，以使蛋白与活化水溶性聚合物共价连接，并去除基本上所有未连接的水溶性聚合物，获得所述的EPO缀合物。在本发明该方面的优选实施方案中，活化水溶性聚合物是SC-PEG。在另一实施方案中，活化水溶性聚合物是NHS-PEG。在优选实施方案中，反应緩冲液不包含醛-PEG，和/或活化水溶性聚合物不是醛-PEG。在某些实施方案中，反应緩冲液的pH为约6.5至约8.5。在其它实施方案中，反应緩冲液的pH为约6.5至约7.5、约6.6至约7.3或约6.7至约7.1。在优选实施方案中，反应緩冲液的pH为中性，约7.0。在某些实施方案中，反应緩冲液可进一步包含5。/。-80Q/。DMSO(v/v),最好包含10%-40%DMSO(v/v)。相对于本领域已知的标准方法，本发明的方法可以允许在反应緩冲液中使用较低量(即较低浓度)的PEG,同时改善或保持与所述众所周知方法相似的PEG化效率(即根据PEG化产品相对非PEG化产品的量评估的)。相对于本领域已知的其它方法[例如用醛PEG的蛋白质PEG化(参见例如美国专利号6,077,939和5,985,265,它们中的每一个都以其全部在此引作参考)]，本发明的方法还可以允许反应在较高pH进行。相对于本领域已知方法的这些改进就成本、生产效率和/或工艺的简便性而言可以提供生产优势。在再一实施方案中，反应緩冲液包含的蛋白质与活化水溶性聚合物的摩尔比为约1至约3到约1至约60。在其它实施方案中，反应緩冲液所包含的蛋白质与活化水溶性聚合物的摩尔比为约1至约4、约1至约5、约1至约6、约1至约7、约1至约8、约1至约9、约1至约10、约1至约15、约1至约20、约1至约25、约1至约30、约1至约35、约1至约40、约1至约45、约1至约50、约1至约55、约1至约60。在某些实施方案中，反应緩冲液包含的蛋白质与活化水溶性聚合物的摩尔比为约1至约7。在又一实施方案中，基本透析、层析法)常规完成。本发明的另一个方面涉及用药学有效量的上述制剂或缀合物治疗需要治疗的患者。在一个实施方案中，本发明包括应用治疗有效浓度的、包含本发明的多元EPO缀合物或所述多元缀合物的一个或多个组分的组合物(特别是药物组合物)，以提高有需要受试者的红细胞产量。在某些实施方案中，给所述受试者施用本发明的药物组合物，以治疗或控制所述受试者与红细胞产生异常或缺陷相关的疾病或紊乱，或减轻这些疾病或紊乱的症状。在某些实施方案中，待治疗的受试者从未被诊断出与红细胞产生异常或缺陷相关的疾病或紊乱，但4皮确定有发展为所述疾病或紊乱的倾向。在其它实施方案中，待治疗的受试者从未被诊断出与红细胞产生异常或缺陷相关的疾病或紊乱，但按照本领域的标准被评估为从所述治疗中获益。在某些实施方案中，患者接受施用至少约一周一次。在其它实施方案中，患者接受施用至少约每两周一次、至少约每三周一次或至少约每月一次。通过下面的详细说明(其中只显示和描述了本发明的优选实施方案)，本发明的其他优势对本领域的技术人员将是显而易见的。应该认识到，在不偏离本发明的情况下，本发明能有其它的和不同的实施方案，本发明的一些细节能够在各方面有常规的改进。本发明无需这些具体细节中的某些或全部细节也可以实施。因此，附图和说明可视为在性质上为的说明性的，而不是限制性的。4.附图简述图1。主要的完全加工型人促红细胞生成素("hEPO")的氨基酸序列(SEQIDN0:1)图2。带末端Arg残基的促红细胞生成素的氨基酸序列(SEQIDNO:2)图3A-B。图3A:泳道1是分子量标准。泳道2是在制剂緩沖液中贮存5个月后的样品。泳道3是在-20。C下以水冻状态贮存5个月的样品对照，泳道4是未修饰型EPO。图3B:从左边开始，泳道1:生产后立即采样的样品。泳道2:天然EPO,泳道3:分子量标准。图4A-B。A:天然EPO的示范性胰蛋白酶降解。B:依据实施例1制备的EPO缀合物的示范性胰蛋白酶降解。图5:对于高温下贮存不同时间周期的EPEG缀合物的SDS-PAGE分析。泳道1:以kD计的分子量标准(200、116.3、97.4、66.3、55.4、36.5、31、21.5和14.4)。泳道2:-20。C，15个月；泳道3:4°C,16个月；泳道4:25°C,10.5个月；泳道5:37°C，10.5个月。图6:标准[EPREX⑧(epoetinalfa)]和EPO缀合物('EPEG，)于MethCultTM-4230(无细胞因子)对祖红细胞增殖的活性的比较。图7:EPO、EPEG和ARANESP(达贝泊汀a，darbopoietinalfa)静脉注射时在雄性Sprague-Dawley体内的药代动力学轮廓图。图8。本发明EPO缀合物体内活性之比较。将3种PEG-EPO样品在随时间推移的血细胞比容水平与天然EPO的所述水平比较，剂量为5iig/大鼠。Y501P:用支链NHS-PEG(20,000KD)修饰的EPO，具有IPEG-EPO。Y502P:用支链NHS-PEG(20,000KD)修饰的EPO,具有2PEG-EPO。Y5012:用支链NHS-PEG(20,000KD)修饰的EPO，有等量的1PEG-EP0和2PEG-EPO。图9。比较3种不同EPEG(L33、Y5012和X6012)和天然EPO诱导大鼠血细胞比容增加的活性的时程曲线10:在经推注EPEG或rhu-EPO(每一动物2.5路或5昭)或溶媒(PBS)后雄性Sprague-Dawley大鼠血细胞比容增加的时程曲线。图11:在经一次或两次(分别为"未注射"或"注射")推注EPEG、rhu-EPO(每一动物2.5吗或5(ig)或溶媒(PBS)后雄性Sprague-Dawley大鼠血细胞比容增加的时程曲线。EPEG或对照的第二次施用是在第一次施用后14天进行。5.详述本发明的一个目标是提供多肽缀合物物(例如EPO缀合物)，其在临床上优于野生型或天然形式的非缀合多肽。此外，该缀合多肽的附加好处是可以施用较少量蛋白质(相对于野生型或天然肽)，包括施用频率减少，来实现需要的治疗效果。因为每剂的蛋白质量大大减少，这又导致原材料成本和副作用发生率降低。在某些实施方案中，本发明涉及缀合至水溶性聚合物的促红细胞生成素。在优选实施方案中，本发明涉及缀合至聚乙二醇(PEG)的多肽。最优选它涉及缀合至聚乙二醇(PEG)的促红细胞生成素(EPEG)。在一个实施方案中，与天然EPO(即无PEG附着的EPO;常规糖基化促红细胞生成素)相比，本发明EPO缀合物(即EPEG)在体内其循环半衰期和血浆停留时间增加、清除率降低且并临床活性提高。本发明的缀合物与EPO有相同的应用。特别是，本发明的缀合物可用于以与使用EPO治疗相同或类似受试者的同样方式，通过刺激骨髓中祖红细胞的分裂和分化来增加有需要的受试者的红细胞产生。此外，本发明人意想不到地发现，本发明缀合物在存储期间在其制剂中不需要人血清白蛋白(HSA)以保持稳定性。因此，相对于现有的基于EPO的疗法，本发明制剂在更长时间的稳定性、更低的成本以及生产、运输、储存和质量控制简化方面具有优势。当在蛋白质与另一个分子共价连接方面使用时，本文所用的术语"N末端"、"氨基末端"或类似术语指的是通过蛋白的氨基末端a氛基的共价连接。本文所用的术语"野生型"或"天然"是指蛋白质或肽的工作或功能形式，优选为其在体内被发现的天然功能形成。这些术语还指蛋白质未经人工修饰或改变的形式。于是，该术语可涉及重组蛋白。因此，该术语可以指相对于动物中核酸和/或该蛋白的氨基酸序列原始来源的动物中所产生的蛋白而言糖基化模式改变(包括缺乏糖基化)的蛋白质。本文所用的多肽的"天然功能"是指其在用水溶性聚合物共价修饰前的功能。天然功能包括例如酶活性、受体结合(例如抗体)、配体结合、和免疫原性。优选促红细胞生成素的天然功能是指其在体内促使骨髓细胞增加产生网织红细胞和红细胞的生物活性。本文所用的术语"促红细胞生成素"或者"EPO"指的是这样的糖蛋白，其具有SEQIDNO:1(图l)或SEQIDNO:2(图2)所示氨基酸序列、或与上述序列基本同源的氨基酸氨基酸序列，其生物学特性与刺激红细胞产生和/或刺激骨髓中定向祖红细胞分裂和分化相关。本文所用的这些术语包括经过有意修饰(例如定点突变)或偶然经突变而修饰的这种蛋白；使得它们相对天然EPO而言有氨基酸残基添加、缺失或取代。这些术语包括天然和重组产生的人促红细胞生成素。EPO是指天然存在的蛋白或重组蛋白两者，优选是人蛋白，得自任何常规的来源，如组织、蛋白质合成、天然或重组细胞的细胞培养物。与EPO基本同源的多肽是功能等同物，其包括具有与SEQIDNO:l(图l)或SEQIDNO:2(图2)的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的多肽。涉及氨基酸序列的"基本相同"在本文中被定义为与另一个氨基酸序列具有至少约70%、优选至少约80%、更优选至少约90%同源性的序列，所述同源性用FASTA搜索方法、参照Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci,USA85，2444-2448(1988)来测定。优选的是，用本文描述的方法和/或本领域已知的标准方法进行评估，与天然或野生型EPO相比，EPO同源物表现同等或更高的活性。也包括任何有EPO活性的蛋白质，如突变蛋白或修饰型蛋白。重组EPO的制备可利用重组DNA技术或内源性基因活化，通过在CHO、BHK、COS、HeLa或PER.C6细胞系或动物或人源的其它适当细胞系中表达来进行。通过内源性基因活化来表达蛋白质(包括EPO)在本领域众所周知，而且公开于例如美国专利5,733,761、5,641,670、5,733,746、5,994,122、5,733,761、5,641,670、5,981,214和5,272,071以及国际专利申请i兌明书WO卯/11354(每一文献的内容在此引作参考)。其制备和治疗应用详细地描述于例如下述文献美国专利5,547,933和5,621,080;EP-B0148605;Huang，S.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)2708-2712;EP-B0205564、EP-B0209539和EP-B0411678;以及Lai，P.H.等，J.Biol.Chem.261(1986)3116-3121，Sasaki,H.等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076。治疗用促红细胞生成素可以通过重组手段生产[EP-B0148605、EP-B0209539和Egrie，J.C.，Strickland,T.W.,Lane,J.等(1986)Immunobiol.72:213-224],上面提及的每一温文献的内容都在此引作参考。用于制备促红细胞生成素糖蛋白制品的优选EPO物质是人EPO物质。更优选该EPO物质是具有SEQIDNO:l(图l)或SEQIDNO:2(图2)所示絲酸序列、最优选具有SEQIDNO:l(图l)所示氨基酸序列的人EPO物质。用无血清培养基表达和制备促红细胞生成素的方法已有描述，例如1996年11月14日公开的Burg的WO96/35718和于1002年6月12日公开的Koch的欧洲专利说明书第513738号(每一文献的内容以其全部在此引作参考)。除了上面提及的出版物外，已知可以进行含EPO基因的重组CHO细胞的无蛋白发酵。这些方法例如描述于EP-A051373§、EP-A0267678,以及以常见形式描述于Kawamoto,T.等，AnalyticalBiochem.130(1983)445-453、EP-A0248656、Kowar,J等，MethodsinEnzymology421(1986)277-292、Bavister,B.，Expcology271(1981)45-51、EP國A0481791、EP-A0307247、EP-A0343635、WO96/35718和WO88/00967(每一文献的内容以其全部在此引作参考)。在EP-A0267678(以其全部在此引作参考)中，描述了在S-琼脂糖凝胶上进行离子交换色i普、在C8柱上进行制备性反相HPLC以及进行凝胶过滤色谱，用于在透析后纯化在无蛋白培养物中产生的EPO。在这方面，凝胶过滤色谱步骤可以-陂S-Sepharosefastflow上的离子交换色语取代。其还建议在离子交换层析之前，用BlueTrisacryl柱进4亍染谇牛层析。用于纯化重组EPO的方法的描述还见于Nobuo,I.等，J.Biochem.107(19卯)352-359(以其全部在此引作参考)。在该方法中，在纯化步骤前，用含吐温20、苯曱基磺酰氟、乙基马来酰亚胺、胃蛋白酶抑制剂A、硫酸铜和草氨酸的溶液处理EPO。本文所用的术语"缀合物"在涉及蛋白质或肽时是指与一个或多个通过共价键连接的其它化学基团相互反应而发挥作用的蛋白质或多肽或它们的群体。优选蛋白质是促红细胞生成素或其同源物，所述化学基团是水溶性聚合物。最优选蛋白质是促红细胞生成素或其同源物，水溶性聚合物是PEG。本发明缀合物有至少一个或两个连接到每一EPO蛋白的PEG分子。更为优选，本发明缀合物按本文7>开的方法制备。优选按本文公开的方法制备的本发明PEG化蛋白，通常被称为"蛋白缀合物"。在蛋白为促红细胞生成素("EPO")的具体实施例中，本发明分子被称为"EPO缀合物"、"EPEG缀合物"和/或类似术语，这些术语可被互换使用。本发明这些术语"蛋白缀合物"还涉及到本发明缀合蛋白的混合物，即本发明的多元蛋白(如EPO)缀合物(aplurialityofproteinconjugates)。例如，EPEG缀合物和/或EPO纟晨合物可以指基本同源的EPO蛋白群体，其中的每一EPO蛋白连接一个PEG分子("IPEG-EPO"，一PEG化EPO)或二个PEG分子("2PEG-EPO"，二PEG化EPO),和/或前述的组合。大多数多肽具有许多潜在PEG连接位点。因此，虽然lPEG-蛋白缀合物的同源群体有一个PEG分子与每一蛋白分子连接，但这种连接不一定位于群体中每一蛋白的同一位置上。相似地，虽然2PEG-蛋白缀合物的同源群体有二个PEG分子与每一蛋白分子连接，但这种连接不一定位于群体中每一蛋白的相同位置上。在具体实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接一个或两个PEG分子的一个EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含所述一个或两个共价连接中的至少一个是通过赖氨酸116与PEG分子连接的EPO缀合物。在其它实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接一个或两个PEG分子的一个EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含所述一个或两个共价连接中至少一个是通过EPO蛋白氨基末端与PEG分子连接的EPO缀合物，其中位于所述氨基末端的该共价连接不是通过醛键连接。在另外的实施方案中，本发明包括多元EPO缀合物，所述缀合物中的每一个都包含共价连接了一个或两个PEG分子的EPO蛋白，其中，所述多元缀合物包含所述一个或两个共价连接中的至少一个是通过赖氨酸52或赖氨酸154与PEG分子连接的EPO缀合物。在其它实施方案中，本发明包括上述多元EPO缀合物和通过本领域已知的适于连接的任何位点与所述一个或两个PEG分子共价连接的缀合物中的任一种。在某些实施方案中，包含1PEG-蛋白和2PEG-蛋白的多元蛋白缀合物(例如EPEG缀合物的异质混合物)是指二个上述群体的混合物，其中，每一群体可以是或可以不是均质的。在具体实施方案中，混合物中1PEG-蛋白缀合物和2PEG-蛋白缀合物之比为小于1比约100、约10比约90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于1，其中，小于约1包括用本领域已知的标准方法检测不到的数量。本发明包括的"水溶性聚合物"包括但不仅限于聚乙二醇及其衍生物，包括PEG、甲氧基化PEG("mPEG")、PEG同聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物，其中，所述均聚物和共聚物是未取代的或在一端被烷基取代。在优选的实施方案中，聚合物是mPEG,最优选单曱氧基化PEG。水溶性聚合物可以是有广泛分子量的直链、支链或星形。PEG的大小可从IOkD到约100kD。在具体的实施方案中，PEG的大小是约10kD至约40kD。为了使聚乙二醇(PEG)和类似的聚烯化氧与分子(特别是蛋白质)共价连接，聚合物的羟基端基必须首先被转化为反应性官能团。在本文，这一过程被称为"活化"，产物被称为"活化PEG",例如曱氧基化PEG("mPEG")可以用本领域众所周知的方法活化以用于随后与氨基共价连接，即mPEG可以经修饰以含有适合随后通过含可用氨基残基(如赖氨酰残基)的氨基酸残基连接到蛋白质上的不同反应基。这类活化mPEG聚合物包括mPEG-琥珀酸琥珀酰亚胺酯、mPEG-碳酸琥珀酰亚胺酯、mPEG-亚氨酸酯和mPEG-氰尿酰氯。例如曱氧基聚乙二醇琥珀酸琥珀酰亚胺酯("SS-PEG")可由mPEG-琥珀酸酯通过在二环己基碳二亚胺存在时与羟基琥珀酰亚胺反应而生成[参见例如Abuchowski等(1984)，CancerBiochem.Biophys.7:175-186(以其全部在此引作参考)]。PEG可以用本领域已知的和/或本文描述的任一方法活化。在某些实施方案中，N-羟基-琥珀酰亚胺基-PEG被用作活化PEG。在优选实施方案中，聚乙二醇)-碳酸琥珀酰亚胺酯("SC-PEG")被用作活化PEG(参见例如美国专利5,122,614,以其全部在此引作参考)。在一个优选实施方案中，将"SC-PEG"共价连接到蛋白质的反应导致N-羟基琥珀酰亚胺基释放以及PEG链通过蛋白质的氨基通过氨基曱酸酯键连接到多肽(参见例如美国专利5,122,614)。然而，与先前本领域已知的方法不同，如本文i正明，使用本发明的方法，缀合反应可受控制，使得可以优先选择PEG化位点(例如在氨基末端a-氨基和赖氨酰残基s-氨基间的优先选择)。在某些实施方案中，本发明包括活化PEG的方法，其中，通过光气处理聚合物(PEG)原位生成PEG氯曱酸酯。所产生的氯曱酸酯然后再与N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)反应，随后与三乙胺(TEA)反应，产生所需的活化PEG衍生物。然后，活化聚合物制备物可以从低分子量反应物中纯化出，并评价是否存在理论量的活性基团。虽然可以依据本文描述的本发明方法将任何蛋白PEG化，但本发明尤其包括治疗性多肽的PEG化。在某些实施方案中，依据本发明方法使用的治疗性多肽可以是例如蛋白酶、垂体激素蛋白酶抑制剂、生成素、集落刺激因子、激素、凝血因子、抗凝血因子、神经营养因子、类风湿因子、CD蛋白、骨诱导因子、白细胞介素、生长因子、干扰素、细胞因子、生长调节素、趋化因子、免疫球蛋白、促性腺激素、白细胞介素、趋化因子(chemotactin)、干扰素、脂质结合蛋白致敏原或前述的组合。这些治疗蛋白的非限制性具体例子包括a2A-干扰素、a2B-干扰素、|3-干扰素、^干扰素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、胰岛素、人生长激素(hGH)、转化生长因子(TGF)、促红细胞生成素(EPO)、睫状神经转化因子(CNTF)、血小板生成素(TPO)、脑源性神经因子(BDNF)、IL-1、insulintr叩in、IL-2、胶质细胞源性神经因子(GDNF)、IL-1RA、组织纤溶酶原激活物(tPA)、超氧化物歧化酶(SOD)、尿激酶、过氧化氲酶、链激酶、成纤维细胞生长因子(FGF)、血红蛋白、神经生长因子、腺苷脱酰胺酶(NGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、牛生长激素(BGH)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、降钙素、血小板衍生生长因子(PDGF)、杀菌/通透性增强蛋白(BPI)、L-天冬酰胺酶、精氨酸酶、尿酸氧化酶、Y-干扰素、苯丙氨酸氨裂解酶、卵泡剌激素、胰岛素原、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子(NGF)、肿瘤坏死因子、降钩素、曱状旁腺激素(PTH，包括人PTH)、骨形态发生蛋白、造血生长因子、促黄体激素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-l(GLP-l)、YY肽(PYY)、因子VIIIC、因子IX、组织因子和vonWillebrand因子、蛋白C、心钠素、肺表面活性剂、铃蟾肽、凝血酶、脑啡肽酶、米勒管抑制剂、松弛素A链、松弛素B链、+>弛素原、脱氧核糖核酸酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、蛋白A或D、骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT画5或NT-6)、CD-3、CD-4、CD-8、CD-19、M画CSF、GM-CSF、G-CSF、上述任何物质的生物活性片段或上述的组合。在优选实施方案中，所述蛋白或多肽是天然EPO。优选的缀合物通过天然蛋白或多肽与活化水溶性聚合物反应来制备。优选水溶性聚合物是PEG。更优选水溶性聚合物是mPEG。优选mPEG的分子量为约10kD至约100kD;更优选约10kD至约50kD;甚至更优选约10kD至约25kD;最优选约12kD。在某些实施方案中，活化PEG是N-羟基-琥珀酰亚胺-PEG("NHS-PEG")。在优选实施方案中，活化PEG是碳酸琥珀酰亚胺酯("SC-PEG，，)。优选活化PEG与天然EPO在反应緩沖液中反应。利用多种类活化PEG生产变异型EPEG(例如EPO缀合物)制剂。在大鼠体内的血细胞比容诱导模型中，经测试的全部制剂，除用40kD支链-PEG制备的制剂外，皆显示出比天然EPO更高的活性。该结果与下列因素无关所使用的是SC-PEG还是NHS-PEG、PEG的分子量是12kD还是20kD、PEG的形状是直链还是支链。本文所用的"反应緩冲液"是无胺组分的标准緩冲液，例如磷酸緩冲盐水(PBS)。优选反应緩冲液的盐(如钠)浓度为约0.1mM至约100mM，最优选为约1mM至约50mM,甚至更优选为约10mM到20mM。在某些实施方案中，将多肽在搅拌状态下与干燥活化水溶性聚合物混合。优选反应緩冲液的pH是约6.5至约8.5,或约6.6至约7.5。在优选实施方案中，反应緩冲液的pH是中性，约7.0。在某些实施方案中，反应緩冲液中蛋白质(如EPO)与活化水溶性聚合物的摩尔比是约1比约3至约1比约60。在其它实施方案中，反应緩沖液包含的蛋白质(如EPO)与活化水溶性聚合物的摩尔比是约1比约6，至约1比约60。在优选实施方案中，反应緩冲液包含的促红细胞生成素蛋白与活化水溶性聚合物的摩尔比是约1比约7。优选的反应条件是pH约7.0的中性反应緩冲液，包含的水溶性聚合物与多肽的摩尔比是约7比约1。在某些其它实施方案中，反应緩冲液可以进一步包含有机溶剂。在这类实施方案中，优选的有机溶剂是二曱基亚砜("DMSO")。反应混合物中存在的DMSO的浓度可以为5-80%,优选为10-40°/。(v/v)。DMSO被广泛用作常用溶剂，但不用来影响PEG化反应，特别是优先影响所述反应的所得PEG化位点。本文所述的反应条件似乎特异性地驱动活化PEG共价结合到特定的赖氨酸位点。此外，现在已经发现，在反应緩冲液中添加DMSO改变了PEG化位点。尤其是，如本文所述在反应緩冲液中添加DMSO,驱动反应朝向优先在蛋白质M端(即氨基末端a-氨基)PEG化。因此，本发明的方法允许对目标蛋白的特定氨基作选择性修饰，特别是对蛋白质氨基末端进行修饰。对这些蛋白质的这种选择性修饰是有益的，因为普遍认为在水溶性聚合物(如PEG)通过氨基与蛋白质连接造成活性损失。据认为，通常与PEG化相关的活性损失是由于现有技术的随机的靶向赖氨酸的反应所致。随机的对赖氨酸残基的修饰可能由于实质上改变了所述蛋白质的三级结构或形态而无意中改变了蛋白质功能。虽然不希望以任何方式限于任何理论，但本文公开的反应条件似乎使得能在蛋白质的选定残基或氨基末端对其进行选择性修饰，而这种修饰被普遍认为不会对蛋白质的活性产生影响。在一个具体的实施例中，本发明的方法被用来将1-2个PEG分子特异性地连接到那些EPO赖氨酸残基上，其中相对天然EPO,所述残基与PEG的连接不会造成生物活性的损失，而是产生相对于天然EPO有意想不到的更高临床疗效的EPO缀合物。利用醛活化的PEG进行蛋白质的氨基末端特异性PEG化在以前已有报告。然而，这种反应仅在低pH下为特异性的，在pH值为7或更高时失去特异性(参见例如美国专利6，077，939和5，985，265,每篇文献以其全部在此引作参考)。因此，本发明的方法可能对pH敏感性蛋白质的PEG化和/或缀合特别有用。在优选反应中，活化水溶性聚合物将以摩尔过量存在，因此，需要从新形成的蛋白缀合物中去除未反应的过量活化水溶性聚合物。本文所用的"去除基本上所有未连接的水溶性聚合物"是指用一般已知方法进行这种分离，例如通过透析。一般来说，大约80%的未连接的水溶性聚合物被去除，优选约90%被去除，更优选约95%被去除，最优选约99%被去除。本发明提供蛋白缀合物，特别是EPO缀合物，所述缀合物包含连接了至少一个水溶性聚合物的促红细胞生成素糖蛋白，并在体内具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和血细胞产生的生物活性。在优选实施方案中，EPO糖蛋白是人促红细胞生成素和/或其类似物，这些类似物具有人促红细胞生成素序列[如SEQIDNO:l(图1);SEQIDNO:2(见图2)]、或与上述序列基本相同的氨基酸序列。EPO或EPEG缀合物的具体活性可以用本文描述的方法或本领域已知的标准测定法来测定。本发明的纯化EPO缀合物的生物活性使得将本发明的制剂(例如本发明多元EPO缀合物或其一个或多个组分，和药学上可接受的载体)施用人患者时，相对未经注射或对照组的受试者，导致骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞的产生。依据本发明方法获得和纯化的EPO缀合物或其片段的生物活性，可以用下面方法测试，例如依据Annable等，Bull.WW.Hlth.Org.(1972)47:99-112和Pharm.EuropaSpec.IssueErythropoietinBRPBio1997(2)。本文所用的"在注入Sprague-Dawley大鼠约36小时后，能够达到血清水平高于天然促红细胞生成素至少约25%、30%、35%、40°/。、45%或50%"是指这样一个事实在采用Sprague-Dawley大鼠的体内试验中，本发明的EPEG缀合物从受试者体内清除的速度大大低于天然EPO或市售糖基化EPO,从而导致其PK轮廓图高于和宽于对照化合物的PK轮廓图。本发明EPEG缀合物的血清水平可以由技术人员用本领域常规方法很容易测定，所述方法例如包括但不限于放射性标记和免疫测定法。优选用下文实施例4中描述的方法测定血清水平。实施例4表明，天然EPO在注射后不久达到其最大血药浓度(即达到放射性标记的EPO缀合物的最高血液传播活性)，然后在13小时内消除。目前可用的糖基化EPO治疗药ARANESP(达贝泊汀a，darbopoietinalfa)(Amgen,ThousandOaks，CA)，在;^主射后12-18小时有血液传播放射性峰值，比天然EPO表现出更长的半衰期。但是，ARANESP(达贝泊汀ct)在血液中的浓度未能达到实质高于天然EPO。与此相反，本发明EPEG缀合物血液传播活力的浓度，在最初约12个小时与EPO和ARANESP(达贝泊汀a)相似；但是，在约12个小时后，血清中EPEG缀合物活性的浓度继续增加；在注射后36小时达到了最高水平，与或者EPO或者ARANESP(达贝泊汀a)相比高出约50%。EPEG从体内清除的速度比ARANESP(达贝泊汀a)慢约26。/。至约38%。其结果是，EPEG缀合物提供了比对照EPO或者ARANESP(达贝泊汀a)增加的总药物接触(用曲线下的面积来表示)。事实上，EPEG的曲线下面积(AUC)比ARANESP(达贝泊汀a)的大25%左右至45%左右；其AUC是天然EPO的4倍(见实施例4)。其结果是，与天然EPO或其他糖基化促红细胞生成素制剂[例如ARANESP(达贝泊汀a))相比，EPEG可以更低的频率施用，同时仍可达到更高水平的生物活性。本文提供的工作实施例进一步表明，本发明缀合物可以与未修饰多肽相同方式使用。具体来说，本文公开的EPEG缀合物可以与天然EPO相同方式使用。然而，相对本领域先前已知的PEG化多肽，本发明缀合物有至少二个意外的优越性能。具体来说，本发明EPEG缀合物与对照制剂相比，有出乎意料的高效力，而且在无蛋白制剂中(即存储在无蛋白的药学上可接受的载体中)可以更长时间储存。本文公开的实验结果表明，与对照制剂相比，本发明缀合物在体内循环半衰期和血浆停留时间延长、清除率降低且临床活性增力口。虽然不希望以任何方式受约束或限制在任何特定的理论，但在理论上，相对于对照制剂，本发明EPEG制剂的体内活性增强可能是由于血浆半衰期延长所致。在受体结合方面，已知天然EPO及其受体由细胞加工和内化。一旦所有EPO受体被结合和内化，EPO信号则被最大化，使得细胞对仍存在于机体中的任何过量天然EPO都不敏感。本文的工作实施例证明，过量的天然EPO被机体迅速排出。认为本发明多元EPO缀合物或其一个或多个组分生物活性的增强，可能随生物利用度增加和与受体周转时间比较半衰期延长(即循环时间增加)而变。一旦EPO-受体被内化，则新受体需要一段时间才能就位。本发明多元EPO缀合物或其一个或多个组分的循环寿命可足够长，以在被清除前结合到多代受体。相对天然EPO或目前可用的糖基化EPO制剂而言，本发明EPO缀合物因而可增强体内活性，例如增强红细胞诱导。由于这些改进的性能，相对于未修饰型EPO或现有的基于EPO的制剂，本发明缀合物可以分别降低的剂量和/或减少的时间表来施用，例如以每周一次代替每周3次。本发明EPO缀合物还可施用给有需要的受试者，每天至少一次、每两天至少一次或每3天至少一次。可是，优选本发明EPO缀合物制剂每周至少一次施用给有需要病人。更优选本发明EPO缀合物制剂每两周至少一次施用给有需要病人。最优选地，本发明EPO缀合物制剂每月至少一次或每6周至2个月至少一次施用给有需要病人。预期施用频率降低会改善患者的顺应性，从而改善治疗效果，也改善患者的生活质量。业已发现，相对于传统糖基化EPO，具有本发明缀合物分子量和连接结构的缀合物，有改善的效力、稳定性、循环AUC、循环半衰期以及产品成本轮廓图。5.1预防和治疗方法
技术领域：
：本发明的蛋白缀合物可象天然蛋白一样使用。例如EPEG制剂可象EPO—样使用，例如用于治疗由于肾脏疾病、癌症并发症、化疗或艾滋病治疗引起的贫血。依据本发明该方面的其他具体的潜在应用包括增加红细胞有益于患者的所有疾病(如贫血)。缀合物的准确量容易受例如下列因素影响所治疗病症的确治疗有效量是指在体内促使骨髓细胞增加生产网织红细胞和红细胞的生物活性所必需的缀合物的量。缀合物的准确量受例如下列因素影响所治疗病症的确切类型、所治疗患者的情况、以及组合物中的其它成分。可以有效通过各种方式施用于以特征为红细胞产生低或有缺陷的血液病人类患者的浓度，来配制含有所述缀合物的药物组合物。缀合物的平均治疗有效量可能会变化，特别地，应该依据合格医生的建议和处方。例如可以施用每公斤体重O.Ol-lO]iig,优选每公斤体重0.1-3吗，如每周施用一次。或者，本发明的药物组合物可含有不同量的EPEG,例如约10吗/ml至约1000(ig/ml，优选约50|ig/ml至400|ig/ml。然而，技术人员将认识到，含有本发明缀合物的药物组合物可以有效通过各种方式施用于特征为红细胞产生低或有秋旧血液病患者的浓度来配制。缀合物的平均治疗有效量可能会变化，特别是应该依据合格医生的建议和处方。'々-的5.1.1药物组合物依据本发明制备的本发明组合物(如多元蛋白或红细胞生成素糖蛋白缀合物，或其一个或多个组分)可以通过或利用本领域已知的方法与额外的药学上可接受的载体或溶媒混合，使其适合于注射。用于配制本发明制品的药学上可接受的载体有盐水、人血清白蛋白、人血浆蛋白等。本发明还涉及含有如上所述缀合物和药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。这些药学上可接受的载体可能是水性或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和緩冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、复方氯化钠葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸复方氯化钠或固定油。静脉内溶媒包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于复方氯化钠葡萄糖的补充物)等等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。依据本发明制备的蛋白缀合物可以利用本领域已知的方法用药学上可接受的载体或溶媒配制成适合注射的药物组合物。参见例如WO97/09996、WO97/40850、WO98/58660和WO99/07401(它们中的每一文献都以其全部在此引作参考)。本发明的化合物可以被配制到例如含有张度剂(tonicityagent)(如132mM氯化钠)的pH为7的10mM磷酸钠/钾緩沖液中。任选地，该药物组合物可以含有防腐剂。优选地，药物组合物包含如上所述EPO缀合物、在用于保持溶液pH值范围为约5.5至约7.0的药学上可接受的緩沖液中的多电荷无机阴离子、和任选的一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。例如，本发明的组合物可以包括每毫升约IO吗至约1000|ig的促红细胞生成素缀合物、10-200mmol/L的辟u酸盐、约10至约50mmol/L的磷酸盐(pH6.0至6.5)、可选的多至约1mM的氯化钩以及可选的约1-5%的多元醇。已证明，本发明的EPEG缀合物在无蛋白溶液中，在低温(例如-2CTC，4'CM诸存至少15个月后，或在较高温下(例如25°C,37'C)储存至少IO个月后，能够抵抗降解或EPEG活性的丧失，并预期能在更长时间内保持这种稳定性。在这种无蛋白制剂中，本发明的EPEG缀合物在正常条件下(如室温)运输和存储时能足够稳定。相比之下，市售的EPO，如EPREX⑧(epoetinalfa),需要0.2°/。人血清白蛋白(HSA)的保护，且在降低温度的条件下运输和存储。含人生物性或血清衍生成分如白蛋白的药物制剂受到更严格的生产要求且要遵守规章；结果，这些都与大大提高成本相关。但是，可以将本发明蛋白缀合物(例如EPO缀合物)配制在无蛋白的盐緩沖液中而不丧失活性药物成分。因此，在无蛋白的药学上可接受载体中递送药物(例如EPEG)的能力具有重要的经济优势。因此，在最优选实施方案中，药物组合物由EPEG缀合物和无蛋白的药学上可接受载体构成。任选地，无蛋白的药学上可接受载体可包括非蛋白赋形剂，以进一步加强EPEG缀合物的药理性能。这些包括但不限于糖(如甘露醇)、氨基酸(如组氨酸)或低水平的常规表面活性剂(如吐温-80)等。本发明通过参考以下的实施例将得到更好的理解，这些实施例说明本文所述的发明，但不限制本文所述的发明。6.实施例6.1实施例1:利用SC-PEG-12K进行EPO的PEG化在搅拌下，将多肽溶液与干燥的PEG试剂混合，达到PEG/PEO的最终摩尔比为7:1。采用截留分子量为25,000KD的膜，通过透析分离反应产物，包括DMSO和未反应的PEG分子。无"i仑反应緩冲液的组成如何，即无论有或无DMSO,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定，终产物都是比例大致相等的一PEG化EPO和二PEG化EPO的混合物(参见例如图3B)。以这种方式制备的产物^皮命名为EPEG。6.2实施例2:PEG化位点依据实施例1的程序，将SC-PEG(12KD)用于PEG化EPO,所产生的EPEG制剂或EPO(对照)按本领域标准用胰蛋白酶消化用经TPCK处理的胰蛋白酶(Sigma，MO),按底物重量的4%,在100mM磷酸钠(pH8.4)中，于37。C消化100皮摩尔的蛋白质18小时。将消化物用C18反相柱(ApoUoC-18,5u粒子，4.6X100腿)分析。用50分钟从100%的0.125%TFA(三氟乙酸)至75%乙腈/0.1250/0TFA的线性梯度洗脱片段，。洗脱出的片段用230nm紫外波长分析。EPO和PEG-EPO的实例色谱分别显示于图3A和3B。在EPO色镨图中存在但在PEG-EPO洗脱曲线中减少或缺乏的峰值，表明了PEG修饰，并表征了其PEG化位点。用ABIProcise系统(ABI，CA)依据标准程序，通过蛋白测序来分析含有PEG的流分。通过将测得的序列与EPO氨基酸序列进行匹配来确定PEG化位点。结果列于表1。表1:依据实施例1制备的多个PEG-EPO批料的PEG化位点，在反应混合物中有和没有DMSOPEG-EPO批号PEG化位点(占总修饰位点的百分比)DMSO的存在情况N末端赖氨酸-52赖氨酸-116赖氨酸-1545d29-ty2036.436.47.2无5012V413623无501P-C165430无x6012226855无L331486无7517A928有682918713有6213V8119有6214Ty797.5103.5有意想不到的是，发现反应緩沖液中存在DMSO会使PEG化反应变为优先且主要使蛋白质N端(即a-氨基)PEG化。特別是，DMSO的存在使在赖氨酸116发生PEG化的反应发生转移。以前的报导已经证明，只能用醛活化的PEG和酸性pH条件才在蛋白质N末端进行PEG化(参见例如美国专利号6,077,939和5,985,265，它们中的每一专利都以其全部在此引作参考)。通过N末端测序确证了向反应緩沖液中添加DMSO能够进行优先PEG化。用标准方法对依据实施例1制备的(存在DMSO)未经消化的EPO或其对应EPEG进行了N末端测序。经过比较，在EPEG样品中，有超过50%预期量的N末端丙氨酸不能被4企测到，从而证实了上述结果。用蛋白酶(如葡萄球菌蛋白酶V8、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)进行蛋白水解保护分析，也取得了类似结果。初步数据还表明，本发明的PEG化方法也可使其他蛋白选择性PEG化，包括在蛋白N末端选择性PEG化。例如，当使用SC-PEG和DMSO，将蛋白质粒细胞集落刺激因子(G-CSF)按照实施例1方法PEG化，并随后在SP柱上纯化时，PEG-GCSF与本发明的N末端修饰物质在同一时间被洗脱，即在相同的流分中；在无DMSO时，洗脱时间发生变化。结果表明，本发明的方法可能能够使蛋白质选择性地PEG化，特别是，对a-氨基的靶向PEG化。6.3实施例3:PEG-EPO的制剂和稳定性使用含有DMSO的反应緩沖液，依据实施例1的方法制备EPEG。用0.2pm的膜过滤该产物以减少生物负荷，然后，用PBS(磷酸緩冲盐水，pH6.9)稀释至终浓度为50吗/ml,浓度用下文描述的BCA蛋白检测法测定。该产物经过滤除菌到1ml小瓶中以便储存。最终制品用LAL试验(鲎变形细胞裂解液热原试验，Cambrex，MD)检验，内毒素水平低于每mlO.IEU。将这些小瓶储存在37°C、25°C、4。C或-2(TC，用于后续的稳定性和/或活性检验。定期用PAGE检验样品的物理完整性，用BCA蛋白检测法检验其蛋白含量，并通过对干细胞生长和血细胞比容产量的刺激来检验其EPO活性。(见实施例3的活性测定)。利用SDS-PAGE,没有证据显示在-2(TC或4。C储存15个月后EPEG有降解或损失(分别参见例如图5的泳道2和泳道3)。令人意想不到的是，SDS-PAGE还显示，虽然没有载体蛋白如HSA(人血清白蛋白)作为赋形剂存在以保护药物，但在25。C或37。C储存至少10个月后，没有可检测到的物理完整性的损失(分别参见图5的泳道4和5)。作为比较，市售EPO即EPREX(epoetinalfa)则需要0.2%HAS作为保护。因此，有可能将本发明蛋白缀合物配制到无蛋白的盐緩冲液中而不丧失活性药物成分(EPEG)。还用BCA蛋白含量检测法评估了样品的稳定性。也用BCA蛋白含量检测法评估了样品的稳定性。选择储存在37°C、25°C、4。C或-20。C的代表性样品用于BCA蛋白片企测法(PierceChemicalCo,MN)以定量总蛋白浓度。50ul样品或对照在175ul工作试剂液中于37。C温育2小时，测定在650nm的吸光度。进行了4参数回归以测定蛋白质浓度。用BSA(牛血清白蛋白)制作标准曲线，相关系数为0.999。在储存12周后，该4企测法测定储存在37。C的样品蛋白浓度为50.5pg/ml，储存在25。C的样品蛋白浓度为51.3|ig/ml。在储存47周后，该检测法测定储存在-2(TC的样品蛋白浓度为51.4昭/ml，储存在4。C的样品蛋白浓度为49.5pg/ml。在实验开始时，用BCA法测定的样品浓度大约为50pg/ml。因此，蛋白未随时间推移而损失。请注意，在BCA4企测法中，EPREX(epoetinalfa)不能被用作标准，因为它含有0.2%HSA。在用加速研究评估样本诱导干细胞分化的效力(如实施例4中描述)时，发现了样本稳定性的进一步证据。该活性被评估为3单位/ml产品，以占相同剂量EPREX(epoetinalfa)诱导的集落形成的百分比来表示。在37。C储存12周后样品具有对照活性的76.3%,在25。C储存17周后样品具有对照活性的76.5%，在4。C储存54周后样品具有对照活性的85.3%，在-20。C储存47周后样品具有对照活性的77.9%。样品在时间0时具有对照活性的76.5%;这表明，在无蛋白载体制剂中储存期间，几乎100%的原始活性得以保留。6.4实施例4:用基于曱基纤维素的体外集落实验评估PEG-EPO对祖红细胞增殖的功能性效应采用不含DMSO的反应緩沖液，依据实施例1方法制备EPEG。以刺激千细胞分化为类红细胞的能力来评估EPEG的效力。正常人骨髓被用作干细胞源。在Ficoll分离(PoieticsInc.的试剂盒)后，获得轻密度细胞。将细胞重悬浮在10mlIscove培养基(含2。/oFBS)中，用台盼蓝4企查存活率。在用BCA蛋白测定法如第6.2节所述测定蛋白质浓度后，将EPEG测试样品(50pg/ml)和对照样品转换成单位/ml以便用于对比，设定标准品为125,000单位/mgEPO。对于集落形成细胞(CFC)检测法，制备300单位/ml的储存液，并用含2%FBS的Iscove培养基制备系列稀释液。作为对照，也制备类似的EPREX(epoetinalfa)储存液(20000国际单位/ml,批号58B097),用于铺板。加入标准EPO[EPREX(epoetinalfa)]和EPEG至终浓度为3、1、0.3、0.1和0.03单位/ml。造血细胞集落实验从每培养物20,000个骨髓细胞起始。所有培养物都设置为一式三份，并培养14天。第14天，计量集落数。基于形态，按本领域常规，将集落分为以下类别CFU-E、BFU-E和CFU-GM。CFU-E是源自更成熟祖细胞的类红细胞集落，含有少于200个成红细胞。BFU-E是源自原始细胞的类红细胞集落，含有多于200个成红细胞。CFU-GM是源自集落形成细胞的集落，能够产生有40个或更多个粒细胞和/或巨噬细胞的集落。定量总类红细胞(CFU-E+BFU-E)和总CFC(总类红细胞+CFU-GM)。〗又用培养基的;^测法不能产生可^r测到的类红细胞集落。这证实了所观察到的集落是由测试样品产生的。结果显示，在祖细胞4企测法中，对于对照EPREX(epoetinalfa)和测试EPEG两者，在没有添加细胞因子时，对祖红细胞生长的影响存在剂量依赖。在3单位/ml的饱和浓度时，EPEGA、B和C诱导生长是对照EPREX(epoetinalfa)的78-82°/。。如图6所示，在亚饱和浓度(1和3单位/ml)时，水平更低。图中显示的是3次读数的平均数。平均变异系数为3单位/ml时是11%，1单位/ml时是25%，0.3单位/ml时是30%，0.1单位/ml时是50%。置信水平的p值为P<0.01。在无蛋白培养基中储存5个月后，EPEG样品保持了全部活性。对检测结果进行了统计分析。进行了标准t检验，以便对以相同浓度的EPO和PEG-EPO测试的培养物间产生的集落数差异进行评估。p值小于0.01被认为是显著的。所观测到的数据表明，结果是在显著水平之内。用在含DMSO反应緩冲液中制备的EPEG获得了类似的结果。6.5实施例5:EPEG(PEG-EPO)的药代动力学研究依据实施例1的方法，使用无DMSO的反应緩沖液(即用SC-PEG-12K在赖氨酸位点修饰天然EPO)，制备了两个不同批次的EPEG(EPO-PEG201和EPO-PEG202)，产生的样品蛋白浓度如第6.3节所述用BCA测定法测定。这些EPEG化合物:被用于与下列物质比较药代动力学特征天然的、未经修饰的、天然功能的EPO和FDA核准的超糖基化EPO[ARANESP(达贝泊汀a),来自Amgen，Inc.,ThousandOaks，CA]。用ARANESP(达贝泊汀a)作为基准，因为它是被FDA核准的产品，且由于蛋白的超糖基化而有较长的半衰期。为了检测血液中的蛋白质，用本领域已知的氯胺T法，用1251于酪氨酸位点标记四个样品[天然EPO、EPO-PEG201、EPO-PEG202和ARANESP(达贝泊汀a)]。每一分子有约1-2个1251连接。每一样品(80吗)均被标记，使用脱盐柱将其从残余的未结合1251中分离。检测蛋白质的活性，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和反相柱验证。评估PEG化样品中的的以下亚群缀合了一个PEG分子的EPO亚群(IPEG-EPO)、或缀合了二个PEG分子的EPO亚群(2PEG-EPO)。IPEG-EPO与2PEG-EPO之比率，在EPO-PEG201中为54:46;在EPO-PEG202中为45:55。为了分析四个批次放射标记蛋白的药代动力学特征(profile),将蛋白溶液以4Ci/kg体重的剂量皮下注射到雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠一皮分为5个亚组，每亚组4只动物，以避免每只动物超过3次血液采样。在注射后不同时间点(O、0.5、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72、96和120小时)采集血液样品。用闪烁计数器测定放射标记蛋白在血液样本中的量，对所产生的数据进行统计分析。结果显示在图7中。EPO-PEG201和EPO-PEG202有相似的药代动力学特征。令人意想不到的是，本发明人发现，这两者都有比ARANESP(达贝泊汀a)或天然EPO更高和更广的PK特征。表2列出了用一室模型和剂量累积法分析PK参数的结果。表2:四个ARANESP(epoetinalfa)和EPO-PEG的药代动力学特征<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>天然EPO在注射后立即达到高水平，并在13小时内净皮清除。ARANESP(达贝泊汀a)-目前被批准的长效形式EPO，在12-18小时出现峰值，并相比EPO表现出更长半衰期，但在血液中不能达到显著更高的浓度。依据本文公开的方法制备的EPEG的血液水平，在最初的12小时与EPO和ARANESP(达贝泊汀a)两者都相似；在其后，活性浓度持续增加，并在36小时达到最大水平，比EPO或者ARANESP(达贝泊汀a)高出50%左右。EPEG从体内清除的速度比ARANESP(达贝泊汀a)慢约26°/。至约38%。这导致了比对照EPO或者ARANESP(达贝泊汀a)更优越的总接触(用曲线下的面积来表示)。事实上，EPEG的曲线下面积(AUG),比ARANESP(达贝泊汀a)大约25%至约45%;是天然EPO的4倍。6.6实施例6:各种形式PEG-EPO的制备依据实施例1，使用无DMSO的反应緩冲液和使用不同种类的活化PEG,制备了多批EPEG。调整在PEG化反应中所使用的活化PEG量，使终产物含有大致等量的IPEG-EPO和2PEG-EPO。用DEAD柱层析纯化IPEG-EPO和2PEG-EPO。用含75mM氯化钠、5mM磷酸钠的缓冲液(pH6.75)平衡-柱。反应后，用同一緩冲液透析样品，然后上柱纯化。少量的高度修饰的PEG-EPO不能结合到柱上，被洗脱在洗柱液中。用梯度至含97.5mM氯化钠、5mM磷酸钠的緩沖液(pH6.75)洗脱样品。用含150mM氯化钠的磷酸钠緩冲液(pH6.75)洗脱天然EPQ。用聚丙烯酰胺凝胶电泳评估洗脱出的流分。将流分分为3组1PEG-EP0、2-PEG-PEG和这两者的等量混合物。产生了五种代表性样品Y501P,用的支链NHS-PEG(20kD)修饰的EPO，具有IPEG-EPO;Y502P,用支链NHS-PEG(20kD)修饰的EPO,具有2PEG-EPO;Y5012,用支链NHS-PEG(20kD)修饰的EPO,具有等量IPEG-EPO和2PEG-EPO;L33，用直链SC-PEG(12kD)修饰的EPO，具有等量IPEG-EPO和2PEG-EPO;和X6012，用支链NHS-PEG(40kD)修饰的EPO,具有等量IPEG-EPO和2PEG-EPO。如第6.3节所述测定最终样品的蛋白浓度。6.7实施例7:PEG-EPO变体的药效学研究将按实施例6概述生产的EPEG样品施用给大鼠以比较和评价其活性Y501P(IPEG-EPO)、Y502P(2PEG-EPO)和Y5012(IPEG-EPO和2PEG-EPO的混合物)。将Sprague-Dawley大鼠(无特定病原体，5周龄，雄性)关养在有空调的动物设施的顶部有过滤器的笼内。水的提供是随意的。大鼠抵达后在研究前先适应一周。注射前，用PBS稀释EPEG样品。大鼠(每只约250克)分别被皮下注射含5吗总蛋白的1ml緩冲液(PBS)或1mlPBS(对照)，监测其25天的血细胞比容。从尾静脉抽取血到用肝素处理的毛细管(Marienfld，德国)中，测定血细胞比容。密封后将毛细管用血细胞比容离心机(HanilScienceIndustrial,韩国)全速离心10分钟。通过用标准的方法计算压积细胞的百分比(图8)来确定血细胞比容水平。意想不到的是，2PEG-EP0的活性与1PEG-EPO类似。6.8实施例8:各种形式PEG-EPO的血细胞比容诱导按实施例6的描述生产的EPEG变体，进一步在实施例7概述的血细胞比容诱导的小鼠模型中测试。选定用于该检测法的EPEG制剂各包含大致等量的1PEG-EPO和2PEG-EPO:L33、Y5012和X6012(见实施例5)。将其在增加血细胞比容方面的体内活性与PBS和天然EPO的活性作比较。如上文所述，每一动物接受大约5吗活性试剂，即总蛋白。如图9中显示，L33和Y5012有相似的效应，其中Y5012活性略高。更高分子量的PEG不会进一步提高这种活性。所有测试的EPEG制剂，除了用40k支链PEG(X6012)修饰的PEG-EPO,显示出比天然EPO更高的活性。所观测到的活性增加(相对于天然EPO)与使用SC-PEG还是使用NHS-PEG无关，与使用12kD还是使用20kDPEG无关，也与使用直链PEG还是使用支链PEG无关。6.9实施例9:PEG-EPO比天然EPO有更高效力依据实施例6制备L33EPEG(即直链SC-PEG-12K作为活化PEG)，如第6.3节所述测定其蛋白浓度。依据实施例7和8的大鼠模型评估了该EPEG制剂体内活性。在0、2、5、7、10和14天，评估其血细胞比容水平。用作对照的天然EPO是重组人EPO(rhu-EPO)，在杆状病毒表达系统中生产(如本领域已知，rhu-EPO具有与原始人EPO相同的氨基^列，但糖基化模式不同)。将EPEG或rhu-EPO以2.5pg/动物或5(ig/动物(每只约250克)的剂量一次注射施用于大鼠。14天周期内的血细胞比容显示在图10中。以2.5jig/大鼠施用EPEG蛋白，表现出与5吗剂量对照(rhu-EPO)相同的效果，表明本发明EPEG具有两倍于对照的效力。在5吗剂量，EPEG诱导了约80%的血细胞比容水平，几乎是未4务饰型(即非PEG化)EPO诱导量的两倍。请注意，5吗剂量rhu-EPO发挥的血细胞比容诱导水平与2.5昭剂量的水平相似。该结果表明，对照EPO在所测试剂量下已经达到了血细胞比容诱导量的平台。这些结果并不出乎意料，因为先前的出版物业已宣称，EPO制剂在高于2.5吗测试剂量时的不能展示剂量反应效应。与此相反，本发明的EPEG制剂在更高剂量下表现出剂量反应效应，导致血细胞比容诱导量大大高于对照化合物所能达到的量。因此，按照本领域目前的理解，本发明EPEG制剂扩展了药物的药学特性和效力两个方面。6.10实施例10:两次注射证明EPEG的长效作用依据实施例7和8的大鼠模型，分析了连续施用EPEG制剂的体内活性效应，其中该EPEG制剂是依据实施例1使用含DMSO的反应緩沖液制备的。将雄性Sprague-Dawley大鼠分组，或者接受一个剂量(第0天)或者接受一系列剂量(第0天，第14天)的EPEG制剂(在图11中分别为"未注射"或"注射")。监测21天的血细胞比容(图11)。相对一次5吗注射液的意想不到的血细胞比容水平(图9和图10)，使用连续注射给药方案，EPEG制剂的活性即血细胞比容诱导量变得更加明显(图10;EPEG5,注射)。使用连续施用给药方案(每剂5吗)，血细胞比容水平接近意想不到的水平-90%,证明相对于对照化合物而言活性得到改善。本公开内容仅描述了本发明的优选实施方案，以及其多功能性的少数实例。人们会理解，本发明能够以各种其他组合和在其它环境中使用，并能在本文表达的发明理念范畴内有变更或修改。因此，举例来说，本领域技术人员将认识到或仅仅使用常规试验就能够确定等同于本文所述具体物质和程序的众多等同方案。这些等同方案被认为属于本发明的范畴。权利要求1.多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白，其中，所述多元缀合物包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。2.多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白，其中，所述多元缀合物包含至少一个在蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物，其中位于所述氨基末端的共价连接不是通过醛键连接。3.权利要求2的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物进一步包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共^f介连接中至少一个的缀合物。4.多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白质，其中，所述多元缀合物在注射入Sprague-Dawley大鼠后约36小时，能够使其血清浓度达到比对照促红细胞生成素高出至少50%。5.多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白，其中，所述多元缀合物在施用给Sprague-Dawley大鼠后约7天，相对于施用对照促红细胞生成素的效果而言，其诱导血细胞比容至少增加20%。6.权利要求4或5的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。7.权利要求4或5的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物包含至少一个在促红细胞生成素蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物，其中位于所述氨基末端的共价连接不是通过醛键连接。8.权利要求7的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物进一步包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。9.权利要求2的多元促红细胞生成素缀合物，其中，位于所述氨基末端的所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。10.权利要求7的多元促红细胞生成素缀合物，其中，位于所述氨基末端的所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。11.权利要求1、2、4或5中任一项的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物包含共价连接了一个聚乙二醇分子的第一促红细胞生成素蛋白群体，和共价连接了二个聚乙二醇分子的第二促红细胞生成素蛋白群体。12.权利要求11的多元促红细胞生成素缀合物，其中，第一群体与第二群体之比为小于约1比约100、约10比约90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于约1。13.权利要求1、2、4或5中任一项的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在-20。C或4。C存储至少ll个月后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。14.权利要求1、2、4或5中任一项的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述多元缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在25'C或37。C存储至少12周后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。15.权利要求13或14的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述促红细胞生成素活性体外鉴定是对干细胞分化为红系细胞的诱导。16.多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白，其中，所述多元缀合物包含在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物、在赖氨酸52有所述一个或两个共1^介连接中至少一个的缀合物、在赖氨酸154有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物、和在所述蛋白的氨基末端所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物，其中位于所述氨基末端的共价连接不是通过醛键连接。17.权利要求2、3、7和16中任一项的多元促红细胞生成素缀合物，其中，所述共价连接中的大多数位于蛋白的氨基末端，位于氨基末端的共价连接不是通过醛键连接。18.药物制剂，其包含a.治疗有效量的多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白；b.和无蛋白药物有效载体。19.权利要求18的药物制剂，其中，所述多元缀合物包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。20.权利要求18的药物制剂，其中，所述多元缀合物包含至少一个在蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物，其中位于所述氨基末端的共价连接不是通过自连接。21.权利要求20的药物制剂，其中，所述多元缀合物包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。22.权利要求20的药物制剂，其中，位于所述氨基末端的所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。23.权利要求18的药物制剂，其中，所述多元缀合物包含共价连接了一个聚乙二醇分子的第一促红细胞生成素蛋白群体，和共价连接了二个聚乙二醇分子的第二促红细胞生成素蛋白群体。24.权利要求23的药物制剂，其中，第一群体与第二群体之比为小于约1比约100、约10比约90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于约1。25.权利要求18的药物制剂，其中，所述制剂在无蛋白载体的药物制剂中在-20。C或4"C存储至少11个月后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。26.权利要求18的药物制剂，其中，所述制剂在无蛋白载体的药物制剂中在25。C或37。C存储至少12周后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。27.权利要求25或26的药物制剂，其中，所述促红细胞生成素活性体外测定是对干细胞分化为红系细胞的诱导。28.组合物，其包含在蛋白的氨基末端a-氨基共价连接了PEG分子的蛋白，其中，所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。29.用包括下述步骤的方法制备的蛋白缀合物a.让所述蛋白在反应緩冲液中与活化水溶性聚合物反应，使所述蛋白的缀合物与所述活化水溶性聚合物共价连4姿;'和b.去除未连接的水溶性聚合物，以得到所述缀合物。30.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述蛋白是促红细胞生成素(EPO)。31.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述活化水溶性聚合物是SC-PEG。32.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液不包含醛誦PEG。33.权利要求29或31的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液包含1Q-40°/。DMSO。34.权利要求33的蛋白缀合物，其中，所述共价连接位于蛋白的氨基末端。35.权利要求34的蛋白缀合物，其中，所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。36.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述共价连接位于赖氨酸116。37.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述活化水溶性聚合物是NHS-PEG。38.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液的pH值为约6.5至约8.5。39.权利要求38的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液的pH值为约7.0。40.权利要求33的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液的pH值为约7.0。41.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述反应緩冲液包含的促红细胞生成素蛋白与活化水溶性聚合物的摩尔比为约1比约5至约1比约60。42.权利要求41的蛋白缀合物，其中，所述反应緩沖液包含的蛋白与活化水溶性聚合物的摩尔比为约1比约7。43.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述缀合物包含至少一个蛋白缀合物群体，其中，每一蛋白都与至少一个聚乙二醇分子共价连接。44.权利要求43的蛋白缀合物，其中，所述至少一个蛋白缀合物群体是第一群体和第二群体，其中，第一蛋白缀合物群体与一个聚乙二醇分子共价连接，第二蛋白缀合物群体与二个聚乙二醇分子共价连接。45.权利要求44的蛋白缀合物，其中，第一群体与第二群体之比为小于约1比约100、约10比90、约20比约80、约30比约70、约40比约60、约50比约50、约60比约40、约70比约30、约80比约20、约90比约10、或约100比小于约1。46.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在-2(TC或4°。存储至少11个月后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。47.权利要求29的蛋白缀合物，其中，所述缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在25'C或37。C存储至少12周后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。48.权利要求46或47的蛋白缀合物，其中，所述促红细胞生成素活性体外测定是对干细胞分化为红系细胞的诱导。49.增加有需要患者的红细胞产生的方法，所述方法包括给所述患者施用a.治疗有效量的多元促红细胞生成素缀合物，所述缀合物中的每一个都包含与一个或两个聚乙二醇分子共价连接的促红细胞生成素蛋白，其中，所述多元缀合物包含至少一个在蛋白的氨基末端有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物，其中位于所述氨基末端的共价连接不是通过醛键连接，b.药理学上可接受的载体。50.权利要求49的方法，其中，位于所述氨基末端的所述共价连接是通过氨基曱酸酯键连接。51.权利要求49或50的方法，其中，所述多元缀合物包含至少一个在赖氨酸116有所述一个或两个共价连接中至少一个的缀合物。52.权利要求49的方法，其中，所述多元缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在-20。C或4。C存储至少11个月后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。53.权利要求49的方法，其中，所述多元缀合物在无蛋白载体的药物制剂中在25。C或37。C存储至少12周后，经SDS-PAGE分析、BCA蛋白测定或促红细胞生成素活性体外测定确定，保持稳定性。54.权利要求52或53的方法，其中，所述促红细胞生成素活性体外测定是对千细胞分化为红系细胞的诱导。全文摘要本发明涉及新的蛋白缀合物、特别是新的PEG化蛋白、及其制备方法和用途。本发明的一个方面涉及与目前的促红细胞生成素制剂相比临床疗效更高且储存和运输期间稳定性更高的PEG化促红细胞生成素。文档编号A61K38/00GK101534847SQ200780037291公开日2009年9月16日申请日期2007年7月16日优先权日2006年8月4日发明者A·阿布乔夫斯基,L·S·李申请人:普罗龙药品公司