专利名称：：增强免疫应答的组合物和方法增强免疫应答的组合物和方法相关申请的交叉参考本申请要求于2006年9月18日提交的美国临时专利申请No.60/825,983的优先权，该临时专利的全部内容在此通过全部引用并入本文。美国联邦政府资助研究声明本发明是在美国政府批准的美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)项目R21AI063137的资助下完成。美国政府可对本发明享有某些权利。引言流感病毒感染，尤其是禽流感病毒H5N1感染，对健康及经济日益造成威胁。证据明确地显示全世界越来越多地区，H5N1病毒继续在易感染的禽类及猪之间传播。许多科学家相信，如果不加控制，目前的H5N1禽流感病毒将突变成能够在人与人之间传播而导致全世界范围的大流行。由于病死率(mortalityrate)为50%以上，这样的爆发是灾难性的。由于受累地区对禽畜采取消灭措施，不论禽流感病毒H5N1导致人类疾病的能力如何，该病毒已经对经济造成巨大影响。因此，需要开发疫苗来保护人类、禽类、猪及其他家畜免受H5N1禽流感病毒的感染。能够抵抗H5N1以及其他流感病毒感染的流感疫苗将是最好的。发明简述本发明公开了ATCC保藏号为PTA-7871、PTA-7872或PTA-787313的肠炎沙门菌13Ae"tenY/tfo13A)菌株。本发明还公开了包含减毒沙门菌菌株和药学上可接受的载体的组合物。在另一方面，本发明提供通过对接受者使用疫苗载体而使接受者的免疫应答增强的方法。编码能够与CD40结合的CD154多肽的多核苷酸，该多肽包含50个以下的氨基酸，并包含SEQIDNO:26的140-149位氨基酸或其同源物。对接受者使用有效量的疫苗载体以增强接受者对疫苗的免疫应答。在另一方面，本发明提供增强接受者抗甲型流感病毒的免疫应答的方法，该方法通过对接受者使用有效量的包含编码甲型流感病毒M2e蛋白多肽的多核苷酸的细菌以增强接受者抗甲型流感病毒的免疫应答。在另一方面，本发明提供降低接受者甲型流感病毒感染相关发病率的方法，该方法通过对接受者使用有效量的包含编码甲型流感病毒M2e蛋白多肽的多核苷酸的细菌以降低与随后甲型流感病毒感染相关发病率。在另一方面，本发明提供在细菌中产生定点突变的方法。制备第一多核苷酸，该第一多核苷酸包含逆向选择标记(counter-selectionmarker)和抗生素抗性标记，其两翼是与细菌染色体上突变位点两翼序列同源的多核苷酸序列。然后将该第一多核苷酸引入细菌，经同源重组及抗生素选择之后分离出中间体。制备第二多核苷酸，该第二多核苷酸包含突变位点，其两翼是与突变位点两翼的序列同源的多核苷酸。然后将第二多核苷酸引入中间体，并通过逆向选择法筛选出缺乏逆向选择标记的突变体，将其分离，即为定点突变体。在另一方面，本发明提供开发细菌疫苗载体的方法。选择能够定植于接受者体内的细菌。使该细菌减毒，并将包含编码能够与CD40结合的CD154多肽的序列的多核苷酸引入该细菌中。图1示意在肠炎沙门菌(&/wo"e//aeten'&fo)中进行定点突变的方案。图2示意用于将M2e和M2e-CD154插入至/"mfi多核苷酸的环区9中的重叠延伸PCR法的设计方案。图3为柱形图，表明对于给予指定治疗而在指定时间点产生的血清抗体的相对数量。图4为线形图，表明在给予指定治疗后血清抗体随时间变化的数图5为线形图，表明在孵化日以SEHM疫苗接种，在孵化后第21曰加强免疫接种，在孵化后第32日以低致病性甲型流感(InfluenzaA)病毒攻击感染之后鸡的发病率。图6为柱形图，表明在孵化日以SEHM疫苗接种、在孵化后第21日加强免疫接种，在孵化后第32日以低致病性甲型流感病毒攻击感染，攻击感染之后第2日及第4日，病毒的排出(shedding)情况。图7为柱形图，表明在孵化日以SEHM疫苗接种、在孵化后第21曰加强免疫接种，在孵化后第32日以高致病性甲型流感病毒攻击感染之后鸡的发病率。图8为柱形图，表明在孵化日以SEHM疫苗接种、在孵化后第21日加强免疫接种，在孵化后第32日以高致病性甲型流感病毒攻击感染，攻击感染之后第2日及第4日，病毒的排出情况。发明详述重组DNA技术能使对许多细菌及病毒物种的操作相对容易。一些细菌及病毒有轻微的致病性或无致病性，却能够产生强烈的免疫应答。这些细菌及病毒是激发对异源抗原或外源抗原的免疫应答的理想疫苗载体。细菌或病毒疫苗载体能够模拟自然感染并产生强烈的和持久的免疫性。生产和接种疫苗载体通常相对廉价。此外，这样的载体经常能携带不止一个抗原，而且可以提供针对多种感染性因素的保护。在一方面，本发明涉及沙门菌载体在疫苗接种和产生抗沙门菌及其他病原菌的免疫应答中的作用。沙门菌菌株因其产生能够表达异源多肽的细菌的能力而是适当的疫苗载体。此外，可以使细菌发生基因突变或使其毒性减弱，以产生对被感染或免疫接种的接受者有低致病性或没有致病性，同时保持免疫原性的细菌。文献中记载了沙门菌能够在宿主的胃肠道存活并能引起粘膜免疫应答。使用沙门菌载体的口服疫苗产生强烈的粘膜免疫应答，而且对动物和人类使用相对容易。与其毒性更强的对应菌株(counterpart)比较，许多目前沙门菌疫苗菌株在产生强大的保护性免疫应答方面不那么有效。可以用作有效的粘膜接种(例如口服疫苗接种)疫苗的沙门菌菌株可提供易于对接受者进行抗一种或多种病原(如H5N1流感病毒)的疫苗接种的载体。本发明描述了可用作疫苗载体的肠炎沙门菌菌株，以及使用这个菌株制成的各种重组疫苗载体。特别是，本发明提供携带甲型流感病毒的M2e表位的疫苗载体。此外，本发明公开了开发疫苗载体的方法，和通过接种包含编码能够与CD40结合的CD154多肽或其同源物的多核苷酸的疫苗载体增强接受者的免疫应答的方法。该疫苗载体可以用于增强抗甲型流感的免疫应答或用于降低甲型流感病毒感染相关疾病的发病率。最后，本发明提供用Red重组系统连同重叠延伸PCR反应在细菌中产生定点突变以产生不含外源DNA的突变体的方法。选择沙门菌的野生型菌株(isolate),肠炎沙门菌13A(SE13A)，(于2006年9月13日保藏于美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏号为PTA-7871)是因为该病毒具有在鸡体内粘膜定植或粘膜下易位的不寻常的能力，该能力使相关抗原或表位在商业化鸡体内强烈地呈递。重要地，该野生型沙门菌菌株可使商业化鸡所患疾病临床检测不到或缺乏疾病表现，这提示该野生型沙门菌对脊椎动物的致病潜能低。有机体在感染部位复制的能力提示该有机体在接受者(如鸡)体内的定植能力。最理想地，候选疫苗也能侵入并传播到感染部位之外的组织。如实施例4中所示，SE13A能够在口腔感染之后在盲肠扁桃体(cecaltonsil)中复制，而且在感染后数周能从盲肠扁桃体中分离出来。此外，SE13A能够侵入其他组织，并且直到感染后一个月还可以从肝脏及脾脏中发现该病毒。SE13A菌株可通过灭活使细菌在实验室或生产条件之外持续复制所必需的基因而进一步减毒。能作为疫苗载体使用的减毒沙门菌菌株如下所述。将SE13A用于产生减毒沙门菌菌株以开发疫苗和产生增强的免疫应答。如实施例中所证实，SE13A对家禽具有侵入性、无致病性，而且不造成可检测疾病的发病。与非侵入性细菌载体相比，SE13A的这些特性诱导产生增强的免疫应答。通过基因突变来限制细菌传播能力而使SE13A减毒，可以提高该疫苗的安全性。如表4的实施例中所证实，aro4或突变的SE13A菌株保留产生免疫应答的能力，但在宿主中的复制受到限制。因此，减毒作用提高了疫苗载体的安全性而未使其免疫原性下降。突变可以在多种其他沙门菌基因中进行，这些基因包括但不限于qya、c/^、os(i、<%fr、/7/7aP、//zoQ、ow/i、夕卜月莫蛋白、da附、/z^4或其他应激相关基因、"ra、和g編。如实施例中所示，发现禾n/2/M突变可使SE13A减毒。Jro基因是涉及莽草酸酯(shikimate)生物合成途径或芳香酶途径的酶，而ara突变体是缺乏芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的营养缺陷型。是编码降解异常蛋白的胞质蛋白酶的应激反应基因。///M突变体也是减毒的并表现出对过氧化氢敏感性增加。实施例中描述的ara^f和突变是缺失突变，但突变能以多种方式进行。适合地，突变为不能以单一步骤修复的非逆向突变(non-revertingmutation)。适合的突变包括缺失、反转、插入及置换。疫苗载体可以包括一种以上突变，例如疫苗载体可以包含aro」及/z^4突变。制造这种突变的方法在本领域中广为人知。SE13A或减毒重组SE13A衍生菌可以作为疫苗载体使用。可将编码来自任何数目的致病有机体的多肽表位的多核苷酸插入细菌中，并由该细菌表达产生抗原多肽。可将多核苷酸插入细菌的染色体组或编码在质粒上或染色体外其他DNA上。适合地，可将编码表位的多核苷酸插入细菌的表达多核苷酸中。适合地，细菌的该多核苷酸编码跨膜蛋白，而将编码表位的多核苷酸插入至细菌该多核苷酸序列中，以使表位在细菌表面表达。例如，可将阅读框(fmme)的形式的编码表位的多核苷酸插入至细菌的编码跨膜蛋白外环区(externalloopregion)的多核苷酸区中，以使细菌多核苷酸序列保留阅读框。参看实施例l。此外，可将编码表位的多核苷酸插入分泌多肽中。本领域的技术人员将理解，编码表位的多核苷酸可以插入细菌的多核苷酸中，以使表位在以细菌疫苗载体治疗的接受者的免疫细胞上表达及呈递。在实施例中，将甲型流感病毒M2e表位插入SE13A的/amS基因的环区9(loop9)中，而该表位的表面表达由抗体介导的沉淀反应确定。可包括单一拷贝或一个以上拷贝的编码表位的多核苷酸。在实施例中，描述了在/am^基因的环区9中含有插入的多个拷贝的M2e表位的细菌疫苗载体。此外，多个表位拷贝可以在一个以上位置插入细菌疫苗载体中。也可将编码与接受者蛋白同源的并能够刺激免疫系统对外源表位产生应答的多肽的多核苷酸插入疫苗载体中。如以下详细描述的那样，疫苗载体可以包括CD154多肽，该CD154多肽能够在接受者体内与CD40结合并刺激接受者对疫苗载体及其相关外源表位产生应答。如以上有关表位的描述，可将这些多核苷酸插入疫苗载体的染色体组中或保持在染色体组外。本领域的技术人员将理解，能将这些多肽以多种多核苷酸的形式在疫苗载体的不同部分插入并表达或分泌。编码能够增强对外源表位的免疫应答的CD154多肽的多核苷酸也可以编码外源表位。可将编码CD154多肽的多核苷酸与编码表位的多核苷酸连接起来，所以在疫苗载体中，CD154多肽和外源表位存在于同一多核苷酸上。在实施例中，编码能够与CD40结合的CD154多肽的多核苷酸也编码甲型流感M2e表位。参看所附序列表中SEQIDNO:8和9。在实施例中，将编码M2e表位的多核苷酸和编码CD154多肽的多核苷酸都插入/amS基因的环区9中。本领域技术人员将理解，也可以使用编码其他跨膜蛋白的和编码/"mfi基因的其他环区的细菌多核苷酸。SE13A细菌可以包括编码流感M2蛋白的多核苷酸。甲型流感病毒M2蛋白的外功能区(称为M2e)从病毒表面突出。M2蛋白的M2e部分包含大约24个氨基酸。在给定物种内，M2e多肽在一种菌株和另一种菌株之间变化很小。事实上，自1918年流感流行以来，从受感染的人体内仅分离出少数几个M2e自然发生突变的菌株。此外，从禽类和猪宿主体内分离出来的流感病毒含有不同但仍是保守的M2e序列。有关从人类、禽类和猪宿主体内分离的M2e多肽序列的综述，可参阅Liu等人(MicrobesandInfection7:171-177(2005))禾BReid等人的文章(JournalofVirology76:10717-10723(2002))。上述论文的全部内容在此通过引用并入本发明。也请参看所附序列表中的序列SEQIDNO:1-4。适合地，可将编码整个M2e多肽的多核苷酸插入疫苗载体，或仅使用一部分。在实施例中，将8氨基酸多肽(氨基酸序列为EVETPIRKSEQIDNO:5的LM2，或其氨基酸序列为EVETPTRN,SEQIDNO:20的变异体M2eA)引入SE13A，并且证明将其接种到鸡体内之后能够产生抗体应答。适合地，插入疫苗载体的M2e多肽部分具有免疫原性。免疫原性片段是能够激发细胞或体液免疫应答的肽或多肽。适合地，M2e的免疫原性片段可以是全长M2e多肽，或适合地可以是全长序列的20个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、或8个或更多个氨基酸。其他适合包含在甲型流感疫苗载体中的表位包括但不限于，编码甲型流感病毒的血细胞凝集素或核蛋白的多肽的多核苷酸。例如，疫苗载体中可以包含编码SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的多核苷酸。本领域的技术人员将理解，这些序列中的任何序列可以与任何其他表位结合使用，而且也可以与编码免疫刺激肽(immunestimulatorypeptide)(如CD154多肽)的多肽同时使用。如以上所讨论，可在疫苗载体中包括编码与能够增强对表位的免疫应答的接受者蛋白同源多肽的多核苷酸。在实施例中，证明包括编码能够与CD40结合的CD154多肽的多核苷酸的SE13A菌株能够增强对M2e表位的免疫应答，如测定的疫苗接种后抗体产生增加。适合地，CD154多肽长度是50个氨基酸以下，更适合地是40个以下、是30个以下或是20个以下氨基酸的长度。多肽可介于10至15个氨基酸之间、10至20个氨基酸之间或10至25个氨基酸长度之间。CD154序列和CD40结合区在各种物种间并不高度保守。鸡和人的CD154序列分别见于SEQIDNO:25及SEQIDNO:26。已经确定了许多物种的CD154的CD40结合区，包括人、鸡、鸭、小鼠和牛，分别见于SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29。虽然不同物种之间的CD40结合区序列有可变性，但以下实施例提示，人CD154多肽能够增强鸡的免疫应答。因此，可以使用物种特异性CD154多肽或异源CD154多肽来实施本发明。在实施例中，制备几种SE13A重组细菌。在每种SE13A菌株中，M2e多肽和CD154多肽被编码在同一多核苷酸上，而且它们彼此并与其插入的沙门菌多核苷酸在阅读框内。在替代性具体实施方式中，CD154多肽和M2e多肽可被不同的多核苷酸编码。SE13A的M2e包含缺失和插入lamB的环区9的LM2-M2e表位(SEQIDNO:5)。SE13A的ara^M2e-CD154与SE13A的M2e相同，{旦其包含#垂入/"wS的环区9中的CD154肽(SEQIDNO:6)和M2e表位(参看SEQIDNO:8)。这个菌株以保藏号PTA-7872保藏在ATCC。SE13A的似n4M2E包含缺失和插入/aw万的环区9中的M2e-LM2表位。SE13A的似r」M2E-CD154含有插入/awS的环区9中的CD154肽和M2e表位(SEQIDNO:8)，以菌株PTA-7873保藏在ATCC。名为SE13AHM的菌株包含插入/amB的环区9中的SEQIDNO:9。这个菌株包含M2e的两个名为M2e-LM2(SEQIDNO:5)和M2eA(SEQIDNO:20)的表位的多个拷贝和CD154多肽(SEQIDNO:6)。在实施例中，证明上述重组沙门菌菌株可产生抗流感病毒的M2e表位的高的推定性的保护性抗体滴度。此外，表明免疫剌激分子的表达可使抗体滴度进一步增加，这证明了确定这个想法和这些特定细菌疫苗载体的功能性。本发明还提供包括减毒沙门菌菌株可药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体是任何适合体内接种的载体。药学上可接受的载体可包括水、缓冲溶液、葡萄糖溶液或细菌培养液。组合物的附加成份可以适合地包括赋形剂，如稳定剂、防腐剂、稀释剂、乳化剂和滑润剂。药学上可接受的载体或稀释剂的例子包括稳定剂，如碳水化合物(例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷)、蛋白质(如白蛋白或酪蛋白)、含蛋白质剂(如牛血清或脱脂乳)和缓冲物质(例如磷酸缓冲的盐溶液)。特别是在组合物中添加这样的稳定剂时，该组合物适合冷冻干燥或喷雾干燥。本发明还提供通过使用包含能够与CD40结合并激活CD40的CD154多肽的疫苗载体而增强接受者免疫应答的方法。对接受者使用有效量的包括编码能够与CD40结合的CD154多肽的多核苷酸的疫苗载体以增强接受者对疫苗的免疫应答。适合地，疫苗载体包含编码包括人类CD154多肽(SEQIDNO:26)的140-149氨基酸的多肽或其同源物的多核苷酸。在此鉴定出几种适合的多肽。适合地，多核苷酸编码与接受者同一物种的CD154多肽。适合地，将编码SEQIDNO:6的多肽的多核苷酸用于人类接受者，将编码SEQIDNO:7的多肽的多核苷酸用于鸡，将编码SEQIDNO:27的多肽的多核苷酸用于鸭，将编码SEQIDNO:28的多肽的多核苷酸用于小鼠，和将编码SEQIDNO:29的多肽的多核苷酸用于牛。在实施例中，可在鸡疫苗载体中使用人类CD154多肽(SEQIDNO:6)，而且证实可增强对外源抗原的免疫应答。因此，CD154多肽和接受者的其他异源组合可用于本发明的方法。CD154多肽可以用于增强接受者对任何外源抗原或存在于疫苗载体中的抗原性多肽的免疫应答。本领域的技术人员将理解，CD154多肽可用于增强对存在于疫苗载体中的一种以上抗原性多肽的免疫应答。CD154多肽至少部分通过与其受体CD40结合刺激免疫应答。在实施例中，使用了在接受者免疫细胞上表达的并且能够与CD40受体结合的与CD154同源的多肽。配基-受体结合复合物刺激巨噬细胞(和巨噬细胞谱系细胞，如树突状细胞)以增强吞噬作用和抗原呈递，并同时促进已知能够激活其他局部免疫细胞(如B淋巴细胞)的细胞因子的分泌。因此，CD154肽相关分子是免疫应答及扩大的抗体产生的优选耙标。本方法可用的潜在疫苗载体包括但不限于沙门菌属(肠炎沙门菌，&/附0"￡〃"g"ter/"Vfo)、志贺菌属((S72/gg〃a)、大肠杆菌属(&c/2er/c/7/aco//)、耶尔森菌属(Kr'"/")、博德特氏菌属(BoWefe〃a)、乳球菌属(丄actococcRS)、链球菌属(&，tococcus)、弧菌属(霍舌L弧菌，附Woc/zo/erae)、李斯特菌属(工&ter/")、月泉病毒("(ie"ov/ras)、痕病毒(porw>7)、瘤疫病毒(/z^7asv/n^)、甲病毒(a/z/zav/n^)及月泉相关此外，本发明公开了增强抗甲型流感的免疫应答的方法和降低与随后感染甲型流感病毒的相关疾病的发病率的方法。简言之，该方法包括对接受者使用有效量的包含编码甲型流感M2e多肽的甲型流感M2e多核苷酸序列的细菌。M2e多肽包括SEQIDNO:1-5和20。可以以本领域的技术人员熟悉的多种方式将M2e多肽插入细菌，包括但不限于在此描述的无痕定点突变系统(scarlesssite-directedmutationsystem)。也可以改造细菌使其表达M2e多肽和以上讨论过的能够增强免疫应答的多核苷酸(如SEQIDNO:8和SEQIDNO:9序列中的多核苷酸)。特别是，能够结合CD40的CD154的多肽可以由细菌表达，以增强接受者对M2e多肽的免疫应答。接种用量将根据接受者的年龄、体重和种属、接种模式及途径、以及期望对其产生免疫应答的病原体类别而不同。组合物可以任何足以激发免疫应答的细菌的剂量接种。预计103至101()个细菌、104至109个细菌、或105至107个细菌的剂量范围是适合的。组合物可以只接种一次，或可以接种两次或多次以增强免疫应答。例如，组合物可以接种两次或多次，每次隔一周、两周或三周或更多周。在接种之前细菌可适合地存活，但在一些具体实施方式中，在接种之前将细菌杀死。在一些具体实施方式中，细菌可能够在接受者体内复制，而在其他具体实施方式中，细菌不能够在接受者体内复制。病毒。对于对动物或人类的接种而言，组合物可以以多种手段接种，这些手段包括但不限于鼻内接种、粘膜接种、通过喷雾、皮内接种、肠胃外接种、皮下接种、口服接种、通过气雾或肌内接种。点眼接种或添加到饮水或食物中也是适合的。对于鸡而言，可以将组合物接种到卵中。本发明的一些实施例提供增强接受者免疫应答的方法。接受者包括但不限于脊椎动物，适合的有哺乳动物、适合的有人类或禽类，适合的禽类如鸡。也可以使用其他动物感染模型。增强免疫应答包括但不限于诱导接受者的免疫系统介导的治疗性或预防性效应。特别地，增强免疫应答可包括促进抗体的产生(如图3及图4中所证实的那样)、促进抗体重链的类别转换、促进抗体呈递细胞的成熟、刺激辅助性T细胞的作用增强、刺激溶细胞性T细胞或诱导T及B细胞记忆作用增强。可预计将来自相同或不同病原体的几个表位或抗原在单一疫苗载体中组合接种，以产生对多个抗原的增强的免疫应答。重组疫苗载体可以编码来自多种病原微生物、病毒的抗原或肿瘤相关抗原。接种能够表达多种抗原的疫苗载体具有同时诱导对两种或多种疾病的免疫性的优点。例如，活的减毒细菌(如肠炎沙门菌13A)是激发抗多种抗原的免疫应答的适合疫苗载体。使用本领域中广为人知的方法，能将编码抗原的异源多核苷酸插入细菌基因组中的任何非必需位点，此外或使其在质粒上携带。一个适合插入多核苷酸的位点是在跨膜蛋白的膜外部分内或将该多核苷酸与使异源核苷酸进入分泌途径的序列偶联。一个适合插入多核苷酸的跨膜蛋白的例子是/flm^基因。在实施例中，M2e和CD154多核苷酸插入/awS序列的环区9中。异源多核苷酸包括但不限于编码选自疫苗载体之外的病原微生物或病毒的抗原的多核苷酸。这样的多核苷酸可来自病原性病毒，如流感病毒(例如M2e、红细胞凝集素、或祌经氨酸酶)、疱疹病毒(例如编码疱疹病毒的结构蛋白的基因)、逆转录病毒(例如gpl60包膜蛋白)、腺病毒、副粘液病毒、冠状病毒等等。异源多核苷酸也能获自病原性细菌，例如编码细菌蛋白(如毒素)和外膜蛋白的基因。此外，来自寄生虫(如艾美球虫属(Eimeria))的异源多核苷酸是用于载体疫苗的有吸引力的候选物。疫苗载体中也可包含编码涉及激发免疫系统的多肽的多核苷酸，如活的减毒沙门菌属疫苗。多核苷酸可以编码已知其刺激效应的免疫系统分子，如编码白细胞介素、肿瘤坏死因子或干扰素，或是另一涉及免疫调节的多核苷酸。疫苗载体也可包括编码已知可刺激免疫应答的肽的多核苷酸，如包括在此描述的CD154多肽的多核苷酸。本发明提供在肠杆菌属(Enterobactemciae)家族成员的细菌中产生定点突变的方法。示例的方法使用重叠延伸PCR、Red重组酶系统以及中间插入I-SceI内切核酸酶识别位点作为逆向选择标记。此外，sacB也可用作逆向选择标记。整体策略在图1中显示。使用重叠延伸PCR来产生带有与SE13A基因组同源的长两翼的线性DNA。使用Red重组酶系统来介导引入的线性、PCR产生的DNA与细菌基因组之间的重组。在两步突变过程中，首先通过同源重组将I-Scel位点/Kmr盒插入染色体组中的/謹B基因内。然后，以期望插入序列(LM2-M2e、CD154或组合序列)置换该突变。为了实现置换，同时加入携带期望插入序列的PCR产物与编码用于在第一及第二突变体之间进行逆向选择的I-Scel内切核酸酶的质粒。产生定点突变的程序可以用于肠杆菌(Enterobacteraciae)家族的任何成员。肠杆菌家族包括但不限于沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、埃希杆菌属(Escherichia)及耶尔森菌属(Yersinia)的成员。定点突变包括但不限于定位于细菌的染色体组中的特定位置的插入、缺失、替代和置换突变。目前的系统的优点是，其产生"无痕"突变或产生不包含任何外来序列的突变。因此，在此描述的定点突变可以用于产生单一基因缺失或甚至产生单一氨基酸或核苷酸缺失的自体细菌。在实施例中，多核苷酸通过重叠延伸PCR产生，但本领域的技术人员将理解也有其他产生线性多核苷酸的方法可供使用。线性第一及第二多核苷酸必须包含一些与位于突变位点两翼的序列同源的序列，以使Red介导的重组反应得以发生。突变位点任一侧的同源序列的长度可是300个以下碱基对。适合地，同源序列是200个以下碱基对。可通过本领域的技术人员熟知的任何方法将多核苷酸引入细菌中。在实施例中，通过电穿孔法将线性多核苷酸引入细菌中。本发明还提供开发细菌疫苗载体的方法。首先，选择能够定植于接受者体内的细菌。接着，使细菌减毒以产生减毒细菌。减毒可以通过本领域的技术人员熟知的多种方法进行。最后，将编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列引入减毒细菌中以产生疫苗载体。CD154多肽长度可以是50个以下氨基酸，而且包含CD154的SEQIDNO:26的第140-149位氨基酸或其同源物。细菌疫苗载体还可引入编码抗原性多肽的第二多核苷酸序列。在一个具体实施方式中，CD154多肽和抗原性多肽在同一多核苷酸序列中编码。以下实施例只是示例性解释本发明，而不是限制本发明或所附权利要求的范围。实施例实施例l-M2e和M2e/CD154插入片段的构建菌株和培养条件除非另有说明，否则首先将所有质粒保留在TOP10Eco/Z细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。使用肠炎沙门菌13A(>Sa/mo"e〃awtertofe13A)来引入突变。肠炎沙门菌菌株13A为野毒株(fieldisolate),可以得自USDA/APHIS/NVSL，并以保藏号PTA-7871保藏于ATCC。携带质粒pKD46的细菌在30。C温度条件下培养。其他细菌在37°C温度条件下培养。质粒消除在37°C温度条件下进行。将Luria-Bertani(LB)培养基用于细胞的常规培养，而将SOC培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用于电穿孔之后表型的表达。在适当时，将以下抗生素添加到培养基中氨苄西林(Amp)100pg/ml、卡那霉素(Km)50ng/ml和氯霉素(Cm)25pg/ml。质粒以前描述过质粒pKD46、pKD13和pBC-I-Scel(DatsenkoandWanner,PNAS2000,97:6640-6645andKangetal.,JBacteriol2004，186:4921-4930。在此将其通过全部引用并入本发明)。质粒pKD46编码Red重组酶，后者介导引入的线性DNA与染色体组DNA之间的同源重组。这个质粒还包含氨苄西林抗性基因而且对温度敏感，所以其需要30°C的温度在细胞中维持生长。质粒pKD13用作重叠延伸PCR反应中Km抗性(Km1")基因的扩增模板。质粒pBC-I-Scel(其在37。C的温度条件下在细胞中维持生长)产生I-Scel酶，而I-Scel酶剪切以下18个碱基对的稀有识别序列5'-TAGGGATAACAGGGTAAT-3'(SEQIDNO:30)。质粒pBC-I-Scel还包含氯霉素抗性(Cmf)基因。PCR用于PCR的所有引物在表1中列出。典型地，PCR的反应条件如下在总体积50pL中使用大约0.1吗的纯化基因组DNA、质粒或PCR产生的DNA(Qiagen,Valencia,CA，USA)、1X克隆的尸>聚合酶缓冲液、5Ui>聚合酶(StratageneLaJolla,CA,USA)、ImMdNTP(GEHealthcareBio-SciencesCorp.,Piscataway,NJ)禾n每个弓l物1.2pM。使用DNA工程热循环仪(Bio-Rad，Hercules,CA,USA)在以下扩增条件27下进行扩增94°C，2分钟；94。C持续30秒、58。C持续60秒、72。C持续90秒(对于lkb大小的片段)，共进行30个循环；和72。C持续10分钟以进行最后的延伸。每个PCR产物经过凝胶纯化(Qiagen，Valencia,CA,USA)，并以25pL的EB缓冲液洗脱用于制备重叠延伸PCR反应所用的模板，或者以50pL的EB缓冲液洗脱，乙醇沉淀，并在5pL的ddH20中重悬，以将其通过电穿孔进入肠炎沙门菌中(S.e她r"/tfc)。表l引物序列(见下页)在表1中，斜体部分的核苷酸与/aw5基因环区9插入位点的任一侧的核苷酸互补，该插入位点对应于以鼠伤寒沙门菌(S.(^/nVwMr/wm)为注释参照基因组的1257位核苷酸。粗体字的核苷酸代表Km-f引物中的I-Scel识别位点。所有其他插入序列以下划线表示。电穿孔第一步是将pKD46转化肠炎沙门菌(5*.e"fen力Vfe)，以使可用Red重组酶来介导后续突变的重组。使用质粒提取试剂盒(QiagenValencia,CA，USA)从五.co/ZBW25113(DatsenkoandWanner,PNAS2000,97:6640-6645)中提取质粒pKD46。然后，将0.5pL的pKD46DNA转化进入准备进行电穿孔的肠炎沙门菌13A(Xw/er衍tfo13A)(DatsenkoandWanner,PNAS2000,97:6640-6645)。简而言之，将细胞接种至10-15mL的2XYT肉汤培养基(broth)中，并在37°C培养过夜。然后将IOO)liL过夜培养物重新接种至10mL新鲜的2XYT肉汤培养基中，并在37。C培养3-4小时。将转化pKD46质粒的细胞于50。C加热25分钟，以有助于灭活宿主限制(hostrestriction)。将细胞以ddH20冲洗五次，然后将其以60pL的10%甘油重悬。接着，将细胞以2400-2450kV的电脉冲处理l-6ms，于30。C在SOC中孵育2-3小时，然后将其铺于含适当抗生素的LB平皿上。转化了pKD46的肠炎沙门菌于30°C维持培养。当用这些转化菌再进行电穿孔反应时，除了冲洗前一小时加入15%阿拉伯醣诱导Red重组酶，并且细胞不经过50°C加热步骤之<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>外，所有步骤相同。环区9上游-I-Scel/Km、环区9下游的构建通过组合使用Red重组酶系统(Datsenko和Wanner,PNAS2000,97:6640-6645-其全部内容在此通过引用并入本发明)和重叠延伸PCR(Horton等人，BioTechniques1990,8:528-535-其全部内容在此通过引用并入本发明)，将I-Scel酶识别位点和Kmr基因一起引入/omS基因的环区9。插入位点对应于使用以鼠伤寒沙门菌LT2(yp//mwr/MmLT2,S.(y//z/附wn'ww)作为注释参考基因组的/aw5基因的核苷酸1257。首先，分别扩增紧邻环区9插入位点两翼的上游和下游区(分别为环区9上游(loop9-up)和环区9下游(loop9-dn))。环区9上游所使用的引物为lam-up-f和lam-up-r，环区9下游所使用的引物为lam-dn-f和lam-dn-r。然后，使用引物Km-f和Km-r扩增pKD13质粒的Kmf基因。在这里，将I-SceI酶位点合成性地添加到Km-f引物的5'端，其前面是loop-up-r引物互补区。同样地，将loop-dn-f引物互补区添加到Km-r引物的5'端。该互补区使得所有3种PCR产物在一个PCR反应中作为模板时退火。图2a代表该设计方案。将由loop9up-I-Scel/Kmr-loop9-dn序列(PCR-A)组成的PCR片段通过电穿孔方法转化已含有pKD46质粒并经阿拉伯糖诱导的肠炎沙门菌(S.wtenY^fo)细胞，然后将转化细胞铺于带有Km的LB平皿上。为了验证突变以正确的序列方向发生，以引物对Kan4F/lam3f禾nKan4R/lam3r进行菌落PCR反应，其中Kan4F和Kan4R是Kmr基因特异性引物，而lam3f和lam3r是位于/awB环区9区段外侧的引物。将这些PCR片段经过凝胶纯化(Qiagen,Valencia,CA,USA)并且进行DNA测序。环区9上游-LM2或CD154s或组合序列-环区9下游的构建最终的重叠PCR片段PCR-B包含加入的LM2(或CD154s或环区9上游和下游区两翼的组合序列)(图2b)。组合序列由LM2或与禽类物种相关的替代性M2e表位(M2eA)和CD154连同如甘氨酸(Gly)或丝氨酸(Ser)残基的间隔顺序组成。插入序列如下LM2(SEQIDNO:37)、M2eA(SEQIDNO:38)、1号组合序列(Gly)rCD154s-(Gly)3-LM2-(Gly)3(SEQIDNO:39)和2号组合序列(Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154-(Ser)4-LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4(SEQIDNO:40)。为了减少构建下一片段的步骤的数量，将LM2或CD154序列合成性地添加到lam-dn-f引物的5，端，其前面是loop-up-r引物的互补区。以前使用的环区9上游的PCR产物可与新构建的PCR产物一起使用以进行最后的PCR反应，其中在新构建的PCR产物中在环区9下游的5'端引入了LM2或CD154s。然而，对于其他的插入序列(称为组合序列)，由于插入序列的长度较长，需以添加的与loop-up-r引物相连的插入序列特异性核苷酸进行另外的PCR步骤以扩增环区9上游。基于co/Z和鼠伤寒沙门菌(&/wowe〃a(Kp/2/ww/Mw)蛋白质使用最频繁的密码子的汇编数据，选择Gly(GGT)和丝氨酸(TCC)以及所有其他氨基酸的编码序列。引物设计的进一步细节参看表l。以LM2或CD154s或组合序列对I-Scel/Kmr进行基因组置换以大约40:1的摩尔比，将PCR-B产物连同质粒pBC-I-Scel—起通过电穿孔转化进入肠炎沙门菌(wfer/^fc)细胞(Kanget.al,JournalofBacteriology2004,186:4921-4930-其全部内容在此通过引用并入本发明)。由于PCR-B置换了编码Kn/的PCR-A序列，所以PCR-B重组突变克隆能在Cm平皿上生长而不能在Km平皿上生长，根据这一点选择每个PCR-B重组突变克隆。对所选克隆的修饰区进行PCR扩增，并用位于环区9下游和上游扩增区之外的引物lam3f和lam3r确定DNA序列。I-Scel位点/Kmf插入突变第一突变步骤包含设计PCR片段，PCR-A，其作为I-Scel位点/Kmf盒的载体插入/awS位点。PCR-A由毗邻KnV基因的I-Scel酶识别位点组成，其每侧带有与环区9插入位点的上游和下游区(分别为环区9上游和环区9下游)同源的大约200-300bp的侧翼DNA。将片段引入表达Red重组酶的肠炎沙门菌细胞，并选择Kmr克隆。在通过菌落PCR法筛选一些克隆之后，将带有期望的插入片段I-Scel位点/Kmr序列的阳性克隆测序，并将鉴定后的突变克隆命名为SE164。以LM2或CD154s或组合序列对I-Scel/Km""进行基因组置换第二突变步骤需要构建PCR片段，称为PCR-B(如图2B所示)，PCR-B由两翼是/aw^同源片段的最终插入序列(LM2或CD154或组合序列)组成。PCR-B的扩增子没有选择标记，并且必须在置换了以前SE164中的I-Scel位点/Kmr突变之后经逆向选择。质粒pBC-I-Scel编码Cmf基因和I-Scel酶，该酶在SE164的I-Scel位点剪切基因组。因此，将pBC-I-Scel连同PCR-B通过电穿孔转化进入SE164。在PCR-B置换PCR-A的重组之后，根据阳性克隆能在Cm上而不能Km上生长而选择阳性克隆。对突变体进行DNA测序确定成功进行PCR-B重组之后，将带有插入序列LM2、CD154s、(Gly)3-CD154s-(Gly)3-LM2-(Gly)3和(Ser)4-M2eA-(Ser)4-M2eA-(Ser)4-CD154-(Ser)4隱LM2-(Ser)4-LM2-(Ser)4的菌株分别命名为SE172、SE173、SE180和SE189。对于每个LM2和CD154s的插入，使用十个随机克隆以lam3f和lam3r引物进行PCR反应，然后使用对于每个插入序列是独特的限制性酶切位点的酶进行消化，而检测是100%消化的的克隆是期望突变序列的阳性克隆。测序结果证明，LM2或CD154或组合序列恰是插入环区9区段内而无外来核苷酸的加入。实施例2M2e或M2e/CD154突变体/插入体的减毒通过使ara^基因和/或基因发生缺失突变，实现SE13A的减毒。基因是细菌分支酸通路中的关键基因，它的突变导致严重的代谢缺陷而影响七种不同的的生化通路。基因的突变使细胞耐受低温和高温、低pH和氧化剂和致DNA损伤剂的能力降低，并能降低细菌的毒性(virulence)。为了在SE13A中实现缺失突变，以Km抗性基因序列置换肠炎沙门菌的细菌基因组中的靶基因序列。该置换过程使用如上所述的重叠延伸PCR并将PCR产物通过电穿孔进入细胞来完成。通过使Km抗性基因的两翼含有200-300个碱基对的目的基因同源序列，使Km抗性基因定位于基因组的包含目的基因"ra」或/^vO的区段。一旦获得Km抗性突变体，通过DNA测序确定aro」或缺失突变。所得和&"-沙门菌属菌株于2006年9月13日保藏于美国模式培养物集存库(ATCC)(保藏号分别为PTA-7872和PTA-7873)。就减毒菌株的清除时间还进行了体内试验。两种减毒菌株的清除时间比野生型13A菌株的清除时间快，但两种减毒菌株都能够在口腔感染之后在肝、脾和盲肠扁桃体定植。此外，还分离了既缺乏aro^也缺乏似rj的减毒菌株。实施例3-确定M2e和CD154在细胞表面表达以简单的抗体/抗原沉淀反应确定细胞表面表达M2e和CD154插入片段。简而言之，将抗氨基酸序列M2E-LM2(EVETPIRN;SEQIDNO:5)和CD154(WAEKGYYTMSC;SEQIDNO:6)的多克隆抗体与与载体蛋白(KLH)结合。然后将所得抗体与SE13A野生型(无插入片段)或与带有M2e-LM2、CD154或带有M2e-LM2和CD154组合的插入片段的SE13A在室温条件下在玻璃平皿上孵育30秒。细胞表面表达由出现沉淀物而确定。结果如表2所示。阳性沉淀反应以(+)符号提示，而阴性沉淀则以(-)符号提示。结果证明，SE13A野生型不与M2e和CD154肽抗体发生反应，而表达M2e、CD154或M2e和CD154的菌株与适当的抗体发生反应。因此，M2e和CD154肽在细菌的表面表达。表2-沉淀反应<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例4-疫苗接种研究从本地商业性产卵所获得孵化日(第0日)鸡，并将其随机地分配到处理组中(11=55/处理组)。为每个处理组的可能55只鸡中的十五只鸡加标签并编号。如表3中所示，通过强饲法(gavage)以不同SE13A处理组的0.25ml的104、105或107(数据未显示)cfo/ml使这些鸡口服感染。表3-每个处理组攻击感染剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>将每个处理组的鸡在新鲜的松树砂上的分隔开的地面围栏内圈养，并随意供应饮水和词料。在孵化后的第7日、第14日、第21日和第28日，从十五只加标签的鸡中的每只鸡采集大约1ml的血，并将血清去除供后续确定抗体滴度用。在同一天，对每个处理组的十只鸡施无痛致死术，并在无菌条件下取出它们的肝、脾和盲肠扁桃体，以确定细菌定植(盲肠扁桃体)和细菌侵入(肝和脾)。使每个肝、脾和盲肠扁桃体试样于37°C在四硫代硫酸盐肉汤培养基中预增菌过夜。次日，将每种肉汤培养基的满接种环量的培养物在补充新生霉素(Novabicin)和萘啶酮酸(NaladixicAcid)的XLD琼脂平皿上划线，并于37。C孵育过夜。次日上午，查看平皿以确定存在或不存在沙门菌菌落。细菌定植和侵入数据根据不同处理组列于表4中。表4中所示的每个比率代表于培养的10只鸡接受攻击感染后第7日、第14日、第21日和第28日，从其体内再次分离出沙门菌属阳性菌株的鸡的数目。表4-细菌定植和侵入<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>将自每组处理组的鸡体内再次分离出的阳性沙门菌属细菌使用表1中公开的每个插入片段特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)分析以验证M2e-和或CD154插入。使用这个技术以确保原来施加于鸡的菌株等同于再次分离出的菌株。在每个处理组中，PCR证实再次分离的菌株与感染鸡的菌株相同。结果提示，试验的不同沙门菌属菌株的组织定植是可接受的。实施例5M2e抗体的产生将采集自每个处理组中加标签鸡的血清用于抗原俘获ELISA以计算M2e抗体水平。简而言之，以与BSA结合的5jig/ml的M2e-LM2表位(EVETPIRN:SEQIDNO:5)包被96孔平皿的每个孔。于4°C过夜使抗原得以粘附。以PBS+0.05。/。的Tween20冲洗平皿，然后以以前采集自上述6个处理组的每组鸡的血清孵育2小时。以磷酸缓冲的盐溶液(PBS)+0.05°/。丁661120冲洗平皿，然后与过氧化酶结合山羊抗鸡IgY第二抗体(I:IO，OOO稀释度，得自JacksonImmunoResearchLaboratories(WestGrove，PA))再孵育1小时。在随后的冲洗后，使用过氧化酶底物试剂盒(得自FisherScientific)使平皿显色，并在分光光度计上在450nm和405nm读取吸光度。每个平皿还含有阳性对照和阴性对照，其中上述M2e多克隆抗体和未处理鸡血清分别置换处理组的血清。使用阳性对照、阴性对照和实验试样获得的吸光度以计算试样对阳性对照比率(S/P比率)，其计算公式如下S/P比率计算试样均倌-阴性对照均值阳性对照均值-阴性对照均值每组计算出来的S/P比率如图3和4所示。如图中所示，每个表达M2e-CD154的组其M2e-特异性抗体水平产生的ELISA信号与其相应的只表达M2e的组相比平均高出30%以上。数据证明，SE13A-M2e和SE13A-M2e-CD154都能激发对M2e强烈的抗体应答。该应答通过添加CD154肽明显放大。此外，使用wo4或/2^4营养缺陷型SE13A菌株产生类似的应答。这些菌株可以在不影响产生强烈免疫应答的情况下用作具有较高安全性的供临床使用的疫苗载体。实施例6-病毒中和反应使用H9N2流感病毒(CharlesRiverLaboratories,Franklin,CT)，将抗上述重组SE载体产生的抗血清(每次实验加强免疫之后2周采集)使用标准程序(CharlesRiverLaboratories)进行病毒中和试验。参看表5。中和指数提示，接种后的鸡的抗血清对中和禽流感病毒有效，并且因此可保护胚胎免受病毒感染(在两项研究中，VN滴度介于6.3至8.8之间)。使用抗合成M2e肽产生的高免疫血清作为阳性对照。表5-病毒中和反应<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例7-攻击感染研究病毒用于这些研究的流感病毒是A/火鸡/弗吉尼亚/158512/2002(TV/02)H7N2LP禽流感病毒(LPAIH7N2)和A/白鹭/香港/757.2/2002(Eg/02)H5N1HP禽流感病毒(HPAIH5N1)。如以前所述(Suarezet等人，JournalofVirologyAug;72(8):6678-88.)，在9-11日龄的含胚SPF(无特定病原体)鸡卵中培养和滴定病毒。鸡和圈养对于进行LP和HPAI攻击感染研究的鸡，将其转移到USDA认证的生物安全级别是第3级的农业设施中的包含HEPA过滤器的负压不锈钢Horsfall单元内。随意提供饲料和饮水。血清学和病毒分离如以前所述(Suarez等人,1998)，在实验I(Expt.I)中于第0日，在实验II(Expt.II)中于第0日和第14日采集血清，所采集的血清与BPL灭活的同源H5N1抗原进行红细胞凝集抑制试验。滴度^3(log2)以上的视为阳性。如以前所述(Tumpey等人，AvianDiseases,2004Jan-Mar;48(l):167-76)，于攻击感染后第2日和第4日，自第9-11日龄的含胚SPF鸡卵的口腔和泄殖腔中以拭子(swab)分离病毒。简而言之，在攻击感染后第O、2、4日从每只鸡采集拭子，将其放入2ml含有抗生素(1000单位/ml的青霉素G、200pg/ml的硫酸庆大霉素和4jig/ml的两性霉素B;SigmaChemicalCompany,St.Louis,MO)的脑-心浸液肉汤培养基中以分离病毒。免疫印迹实验如以前所述(Kapczynski禾口Tumpey,AvianDiseases,2003Jul-Sep;47(3):578-87)，将完整病毒(H5N1和H7N2)的纯化AIV蛋白在SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺凝胶)中分离并转膜。简而言之，将以前以ASEM2e-HM(1:1000)免疫的鸡的抗-M2e血清与含有AIV抗原的膜室温孵育1小时。将膜以磷酸缓冲的盐溶液(PBS)-Tween20(0.05%)冲洗三次之后，将膜与1:2000稀释度的辣根过氧化酶标记的山羊抗鸡IgG第二抗体(SouthernBiotechAssociates,Inc,Birmingham,AL)反应1小时。在如上述冲洗之后，根据制造商的建议，使膜与ECL免疫印迹检领!j试齐U(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)反应，并使其在HyperfilmECL(AmershamBiosciences)胶片上曝光。根据制造商的建议，使用KodakGBX显影剂(EastmanKodakCompany)使胶片显影。保护研究最初实验的设计是为了评价接种ASEM2e-HM沙门菌属疫苗对以LPAITV/02(每只鸡106EID5。，EID指胚胎感染剂量)进行攻击感染的鸡的保护作用以确定发病率下降和病毒排出(shedding),其中ASEM2e-HM沙门菌属疫苗是含有SEQIDNO:9插入序列的多拷贝M2e-CD154疫苗。随后，使用亚致死剂量(每只鸡0.1CLD5。(CLD38指鸡致死剂量))和致死剂量(每只鸡100CLD5Q)的HPAIEg/02进行攻击感染，研究疫苗在发病率、病死率和病毒排出方面的保护作用。以LPAIH7N2攻漆镇染将十只一组的1日龄SPF鸡分成3组。第1和第2组的鸡接受100^L磷酸缓冲的盐溶液(PBS,pH7.4)的模拟疫苗接种。第3组接受ASEM2e-HM疫苗接种。三周之后(第21日)，三组SPF鸡接受相同的第二次疫苗接种(加强免疫)，该次接种使用盐溶液(第1和第2组)或重组沙门菌属载体疫苗(第3组)。在加强免疫三周之后(第42日)，使第2和第3组中的每只鸡鼻内(IN)攻击感染106胚胎感染剂量50(EID5Q)的TV/02(LPAIH7N2)。未攻击感染的鸡以100jil的磷酸缓冲的盐溶液(PBS)通过鼻内途径模拟攻击感染。在攻击感染之后，每日监测鸡的疾病症状直到感染后(PI)14日。LPAIH7N2攻击感染之后的发病率结果如图5所示，其结果证明，接种表达M2E和CD154的SE13A疫苗之后，发病率明显降低。为了确定病毒排出的发生，PI第2日和第4日采集口腔和泄殖腔拭子。于PI第2日和第4日以LPAIH7N2攻击感染之后病毒的排出数量如图6所示，并且该结果证明接种SE13A-HM疫苗也能降低AI在鸡体内的复制能力。以HPAIH5N1攻击Jf^将十只一组的1日龄SPF鸡分成5组。如实验I所述，第1、第2和第3组鸡接受100pL磷酸缓冲的盐溶液(PBS,pH7.4)模拟疫苗接种。第4、第5组鸡接受ASEM2e-HM疫苗接种。在第42日，第1组鸡通过鼻内途径接受100pL磷酸缓冲的盐溶液(PBS)模拟攻击感染。第2和第3组鸡中的每只鸡分别接受0.1和100CLD5。Eg/02(HPAIH5N1)攻击感染。第4和第5组的鸡中的每只鸡分别接受0.1和100CLD5。Eg/02(HPAIH5N1)的攻击感染。在攻击感染之后，每日监测鸡的发病率和死亡率至PI第14日。以过量的戊巴比妥钠对表现出严重的临床症状的鸡施无痛致死术。以HPAIH5N1攻击感染之后的发病率结果如图7所示，发病率结果证明，接种表达M2E和CD154的SE13A疫苗之后，发病率明显降低。为了确定病毒排出的发生，在PI第2日和第4日采集口腔和泄殖腔拭子。在以HPAIH5N1攻击感染之后于PI第2日和第4日病毒排出的数量如图8所示，病毒排出的数量证明，以SE13A-M2e疫苗接种也降低AI在鸡体内复制的能力。权利要求1、一种ATCC保藏号为PTA-7871的肠炎沙门菌13A菌株。2、根据权利要求1所述的沙门菌属菌株，其中菌株是减毒菌株并是能够定植于接受者体内的菌株。3、根据权利要求1或2所述的沙门菌属菌株，其中菌株包含芳构化通路突变。4、根据权利要求3所述的沙门菌属菌株，其中突变发生在内。5、根据权利要求l-4任意项所述的沙门菌属菌株，其中菌株包含应激反应通路突变。6、根据权利要求5所述的沙门菌属菌株，其中突变发生在似M内。7、根据权利要求l-6任意项所述的沙门菌属菌株，其进一步包含编码流感M2e多肽的流感M2e多核苷酸序列。8、根据权利要求7所述的沙门菌属菌株，其中流感M2e多肽选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:1的免疫原性片段、SEQIDNO:2的免疫原性片段、SEQIDNO:3的免疫原性片段或SEQIDNO:4的免疫原性片段或其组合。9、根据权利要求7所述的沙门菌属菌株，其中流感M2e多肽是SEQIDNO:5或SEQIDNO:20。10、根据权利要求7-9任意项所述的沙门菌属菌株，其中流感M2e多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的沙门菌属多核苷酸序列中。11、根据权利要求10所述的沙门菌属菌株，其中跨膜蛋白是/"m仏12、根据权利要求7-11任意项所述的沙门菌属菌株，其中菌株包含流感M2e多核苷酸序列的一个以上拷贝。13、根据权利要求1-12任意项所述的沙门菌属菌株，其进一歩包含编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列。14、根据权利要求13所述的沙门菌属菌株，其中CD154多肽选自SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。15、根据权利要求13或14所述的沙门菌属菌株，其中CD154多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的沙门菌属多核苷酸序列中。16、根据权利要求15所述的沙门菌属菌株，其中跨膜蛋白是。17、根据权利要求13-16任意项所述的沙门菌属菌株，其中CD154多核苷酸序列以阅读框连接至编码抗原性多肽的多核苷酸序列上。18、根据权利要求17所述的沙门菌属菌株，其中抗原性多肽是流感M2e多肽。19、一种如权利要求4所述的ATCC保藏号为PTA-7872的沙门菌属菌株o20、一种如权利要求6所述的ATCC保藏号为PTA-7873的沙门菌属菌株。21、根据权利要求l-20任意项所述的沙门菌属菌株，其进一步包含编码甲型流感红细胞凝集素多肽的甲型流感红细胞凝集素多核苷酸序列。22、根据权利要求21所述的沙门菌属菌株，其中甲型流感红细胞凝集素多肽包含SEQIDNO:21或SEQIDNO:22。23、根据权利要求l-22任意项所述的沙门菌属菌株，其进一步包含编码甲型流感核蛋白多肽的甲型流感核蛋白多核苷酸序列。24、根据权利要求23所述的沙门菌属菌株，其中甲型流感核蛋白多肽包含SEQIDNO:23或SEQIDNO:24。25、一种包含如权利要求l-24任意项所述的沙门菌属菌株和药学上可接受的载体的组合物。26、一种包含为接受者接种对增强该接受者对疫苗的免疫应答有效量的疫苗载体的增强接受者免疫应答的方法，其中疫苗载体包含编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列，其中CD154多肽有约50个以下氨基酸并包含SEQIDNO:26第140-149位氨基酸或其同源物。27、根据权利要求26所述的方法，其中CD154多肽有25个以下氨基酸。28、根据权利要求26所述的方法，其中CD154多肽至少有10个氨基酸长。29、根据权利要求26所述的方法，其中CD154多肽有10至20个氨基酸长。30、根据权利要求26所述的方法，其中CD154多肽是SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。31、根据权利要求26-30任意项所述的方法，其中CD154多肽在疫苗载体的表面表达。32、根据权利要求26-31任意项所述的方法，其中CD154多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的序列中。33、根据权利要求26-32任意项所述的方法，其中疫苗载体是细菌。34、根据权利要求33所述的方法，其中细菌是沙门菌属。35、根据权利要求34所述的方法，其中沙门菌属是肠炎沙门菌。36、根据权利要求34所述的方法，其中沙门菌属是ATCC保藏号为PTA-7871的肠炎沙门菌13A。37、根据权利要求34-36任意项所述的方法，其中CD154多核苷酸序列插入编码/arn^的膜外部分的序列中。38、根据权利要求26-37任意项所述的方法，其中接受者是禽类物种成员。39、根据权利要求38所述的方法，其中禽类物种是鸡。40、根据权利要求26-37任意项所述的方法，其中接受者是哺乳动物。41、根据权利要求40所述的方法，其中哺乳动物是人。42、根据权利要求40所述的方法，其中哺乳动物是猪。43、一种增强接受者抗甲型流感的免疫应答的方法，包含接受者使用包含编码甲型流感M2e多肽的甲型流感M2e多核苷酸序列的，有效量的细菌以增强接受者抗甲型流感的免疫应答。44、根据权利要求43所述的方法，其中甲型流感M2e多肽选自SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:l的免疫原性片段、SEQIDNO:2的免疫原性片段、SEQIDNO:3的免疫原性片段或SEQIDNO:4的免疫原性片段或其组合。45、根据权利要求43-45任意项所述的方法，其中甲型流感M2e多肽包含SEQIDNO:5或SEQIDNO:20。46、根据权利要求43-45任意项所述的方法，其中甲型流感M2e多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的细菌多核苷酸序列中。47、根据权利要求43-46任意项所述的方法，其中细菌包含一个以上拷贝的甲型流感M2e多核苷酸序列。48、根据权利要求43-47任意项所述的方法，其中细菌是属于肠杆菌科家族成员。49、根据权利要求48所述的方法，其中细菌是沙门菌属。50、根据权利要求48所述的方法，其中细菌是肠炎沙门菌13A。51、根据权利要求48所述的方法，其中细菌是如权利要求l-5任意项所述的沙门菌属菌株的减毒菌株。52、根据权利要求48-51任意项所述的方法，其中甲型流感M2e多核苷酸序列插入/fl^S中。53、根据权利要求48所述的方法，其中细菌是大肠杆菌。54、根据权利要求43-47任意项所述的方法，其中细菌是乳酸杆菌属。55、根据权利要求43-54任意项所述的方法，其中细菌进一步包含编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列，该CD154多肽有50个以下氨基酸并包含SEQIDNO:26的第140-149位氨基酸或其同源物。56、根据权利要求55所述的方法，其中CD154多肽包含SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。57、根据权利要求55或56所述的方法，其中CD154多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的细菌多核苷酸序列中。58、根据权利要求43-57任意项所述的方法，其中细菌通过选自口服、鼻内、肠胃外或卵内的方法使用。59、根据权利要求43-58任意项所述的方法，其中增强的免疫应答包含增强的抗体应答。60、根据权利要求43-58任意项所述的方法，其中增强的免疫应答包含增强的T细胞应答。61、根据权利要求43-60任意项所述的方法，其中接受者是禽类物种成员。62、根据权利要求61所述的方法，其中禽类物种是鸡。63、根据权利要求43-60任意项所述的方法，其中接受者是哺乳动物。64、根据权利要求63所述的方法，其中接受者是人。65、根据权利要求43-64任意项所述的方法，其中对接受者使用约104至约109个细菌。66、根据权利要求43-64任意项所述的方法，其中对接受者使用约105至约107个细菌。67、根据权利要求43-66任意项所述的方法，其中在对接受者使用之前，杀死细菌。68、根据权利要求43-66任意项所述的方法，其中细菌不能在接受者体内复制。69、一种降低接受者与甲型流感病毒感染相关的发病率的方法，包括接受者使用包含编码甲型流感M2e多肽的甲型流感M2e多核苷酸序列的，有效量的细菌以降低与甲型流感病毒感染相关的发病率。70、根据权利要求69所述的方法，其中甲型流感M2e多肽选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:1的免疫原性片段、SEQIDNO:2的免疫原性片段、SEQIDNO:3的免疫原性片段或SEQIDNO:4的免疫原性片段或其组合。71、根据权利要求69-70任意项所述的方法，其中甲型流感M2e多肽是SEQIDNO:5或SEQIDNO:20。72、根据权利要求69-71任意项所述的方法，其中甲型流感M2e多核苷酸插入编码跨膜蛋白的膜外部分的细菌多核苷酸序列中。73、根据权利要求69-72任意项所述的方法，其中细菌包含一个以上拷贝的甲型流感M2e多核苷酸序列。74、根据权利要求69-73任意项所述的方法，其中细菌是肠杆菌科家族成员。75、根据权利要求74所述的方法，其中细菌是肠炎沙门菌13A。76、根据权利要求74所述的方法，其中细菌是如权利要求l-5任意项所述的沙门菌属菌株的减毒菌株。77、根据权利要求74所述的方法，其中细菌是大肠杆菌。78、根据权利要求69-73任意项所述的方法，其所述细菌是乳酸杆菌属。79、根据权利要求69-78任意项所述的方法，其中细菌进一步包含编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列，该CD154多肽有50个以下氨基酸并包含SEQIDNO:26的第140-149位氨基酸或其同源物。80、根据权利要求79所述的方法，其中CD154多肽是SEQIDNO:6或SEQIDNO:7、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。81、根据权利要求79或80所述的方法，其中CD154多核苷酸序列插入编码跨膜蛋白的膜外部分的细菌多核苷酸序列中。82、根据权利要求69-81任意项所述的方法，其中细菌通过选自口服、鼻内、肠胃外及卵内的方法使用。83、根据权利要求69-82任意项所述的方法，其中接受者是禽类物种成员。84、根据权利要求83所述的方法，其中禽类物种是鸡。85、根据权利要求69-82任意项所述的方法，其中接受者是哺乳动物。86、根据权利要求85所述的方法，其中接受者是人。87、根据权利要求69-86任意项所述的方法，其中对接受者使用约104至约109个细菌。88、根据权利要求69-87任意项所述的方法，其中在接受者使用之前，杀死细菌。89、一种在肠杆菌科家族的细菌成员中产生定点突变的方法，该方法包含a)产生其两翼是与细菌染色体组中的突变位点两翼序列同源的多核苷酸的，包含逆向选择标记和第一抗生素抗性标记的第一多核苷酸；b)通过Red重组酶介导的同源重组，将第一多核苷酸引入细菌的染色体组中以产生中间体；c)通过第一抗生素抗性标记选择中间体，并将其分离；d)产生包含其两翼是与突变位点两翼的序列同源的多核苷酸的突变的第二多核苷酸；e)通过Red重组酶介导的同源重组，将第二多核苷酸引入中间体以产生点特异性突变体；和f)逆向选择缺失逆向选择标记的点特异性突变体并将其分离。90、根据权利要求89所述的方法，其中第一多核苷酸通过重叠延伸聚合酶链式反应产生。91、根据权利要求89或90所述的方法，其中第二多核苷酸通过重叠延伸聚合酶链式反应产生。92、根据权利要求89-91任意项所述的方法，其中细菌选自沙门菌属、埃希杆菌属、志贺菌属或耶尔森菌属。93、根据权利要求92所述的方法，其中细菌是沙门菌属。94、根据权利要求93所述的方法，其中细菌是肠炎沙门菌。95、根据权利要求92所述的方法，其中细菌是大肠杆菌。96、根据权利要求89-95任意项所述的方法，其中步骤a)中与突变位点两翼序列同源的多核苷酸，在突变位点的每一侧包含300个以下的碱基对。97、根据权利要求89-95任意项所述的方法，其中步骤a)中与突变位点两翼序列同源的多核苷酸在突变位点的每一侧包含200个以下的碱基对。98、根据权利要求89-97任意项所述的方法，其中逆向选择标记包含I-SceI识别序列。99、根据权利要求98所述的方法，其中步骤f)中的逆向选择包含引入编码I-Scel内切核酸酶的质粒和选择缺失I-Scel识别序列。100、根据权利要求89-99任意项所述的方法，其中逆向选择标记包含認S。101、根据权利要求100所述的方法，其中步骤f)中的逆向选择包含选择缺失蔗糖敏感性。102、一种开发细菌疫苗载体的方法，该方法包含a)选择能够定植于接受者体内的细菌；b)将细菌减毒以产生减毒细菌；和c)将编码能够结合CD40的CD154多肽的CD154多核苷酸序列引入减毒细菌以产生疫苗载体，该CD154多肽有50个以下氨基酸长度，并包含CD154的SEQIDNO:26的第140-149位氨基酸或其同源物。103、根据权利要求102所述的方法，其进一步包含将编码抗原性多肽的第二多核苷酸序列引入疫苗载体的染色体组中。104、根据权利要求102或103所述的方法，其中细菌疫苗载体是沙门菌属。105、根据权利要求104所述的方法，其中沙门菌属菌株是肠炎沙门菌13A。106、根据权利要求103所述的方法，其中CD154多核苷酸序列或其互补序列或第二多核苷酸序列或其互补序列在同一多核苷酸分子上。全文摘要本发明提供肠炎沙门菌13A菌株及包括该菌株的组合物。本发明还提供增强抗甲型流感的免疫应答的多种方法及降低与甲型流感病毒感染相关的发病率的方法。本发明也公开通过表达能够结合CD40的CD154的多肽以增强对疫苗载体的免疫应答的方法。本发明公开了开发细菌疫苗载体的方法。本发明还公开了在细菌中产生无痕定点突变的方法。文档编号A61K39/00GK101522210SQ200780037288公开日2009年9月2日申请日期2007年9月18日优先权日2006年9月18日发明者B·哈吉斯,K·柯里,L·伯格门,M·科克斯,S·雷透,W·鲍杰,Y·M·柯旺申请人:阿肯色大学评议会