专利名称：：重组creg蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。
背景技术：
：蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的重要方式，生物体内大约50%的蛋白质都是糖基化蛋白，包括酶、载体蛋白、激素、毒素、各种凝集素和结构蛋白。糖基化蛋白中的蛋白质是其生理功能的主要承担者，而糖链则通过识别和调控作用直接影响蛋白质的整体构象，进而影响由构象决定的蛋白质的生物学功能。由于多糖分子自身存在的高可变性，使得由不同宿主细胞、不同培养条件以及不同纯化工艺所制备的重组糖蛋白的糖基形式存在显著差异。这种糖基化形式的变异对糖蛋白正常的理化性质和生物学功能都存在严重的影响，从而制约了重组糖蛋白工程的发展。人CREG(humancellularrepressorofElA-stimulatedgene,hCREG)基因是1998年哈佛医学院Gill克隆的一个细胞分化调控基因(VealE，MolCellBiol,1998;18(9):5032-5041)。本室前期研究证实，hCREG蛋白表达能明显抑制体外培养的人胸廓内动脉平滑肌细胞-HITASY的增殖并促进其分化(HanYa-Ling，ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology,2005;21(5):570-574;HanYa—Ling,ProgBiochemBiophys，2004;31(12):1099—1105;HanYa-Ling，ProgBiochemBiophys，2005;32(6):517-522)。同时，经外膜包裹导入的pLNCX2-hCREG逆转录病毒有效抑制了球嚢拉伤后小鼠颈动脉狭窄的发生(HanYa-Ling，ChineseJournalofPathophysiology(alreadyaccepted,tobepublished))。Veal等的研究发现hCREG为分泌型糖蛋白，其蛋白结构中含有三个N-连接的糖链，可与细胞膜胰岛素样生长因子受体2(IGF2R)的6-磷酸甘露糖(M6P)配基结合，通过自分泌和旁分泌发挥其生物学功能(VealE，Oncogene,2000;19(17):2120-2128)。上述研究提示，hCREG糖蛋白可能是诱导VSMCs分化的重要调控因子，在临床经皮腔内冠状动脉介入治疗术后再狭窄的防治研究中具有潜在意义。作为分泌型糖蛋白，hCREG蛋白合成过程中进行正确的糖基化修饰是其具有正常结构和功能的保证。据文献报道，CREG诱导的细胞生长抑制依赖于M6P/IGF2R，M6P/IGF2R优先与糖基化的CREG结合，只有极少量与非糖基化的CREG结合(AlessandraDiBacco，Oncogene,2003;22(35):5436-5445)。为准确表达重组hCREG糖蛋白的结构和功能，本研究构建了pcDNA3.lmyc-His/hCREG真核表达载体及糖基化位点突变的pcDNA3.lmyc-His/hCREG真核表达栽体，并选择了外源性蛋白的人胚胎肾工程细胞系293F进行重组hCREG/myc-His融合蛋白及糖基化位点突变的融合蛋白的表达。两种蛋白可用于比较CREG的糖基化形式对其功能的影响。糖基化的CREG蛋白能够最大限度地发挥其生物学功能；同时，具有生物学功能的去糖基CREG蛋白也可应用原核表达载体制备，满足大量生产的要求，从而克服糖基化的CREG蛋白必须应用真核表达载体制备及产量较低的不足。
发明内容本发明的一个方面，涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，在本发明中，所述CREG基因是指人CREG基因，其序列如SEQIDN0:1所示(参见GenBank登录号NM003851),糖基化位点突变的CREG指第160、193、216位点氨基酸序列由N突变为A，此序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。真核表达载体为pc腿3.1myc-His(美国Invitrogen公司)。本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组CREG蛋白及糖基化位点突变的CREG蛋白，两种蛋白抑制VSMCs增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物的用途。重组的hCREG蛋白氨基酸序列如下MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAAPFEQKLISEEDLNMHTGHHH服叫(SEQIDNO:1)糖基化位点突变的重组hCREG蛋白氨基酸序列如下MAGLSRGSARALLAALLASTLLALLVSPARGRGGRDHGDWDEASRLPPLPPREDAAPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH&(SEQIDNO:2)双化线大号字体标记为突变的糖基化位点。本发明的SEQIDNO:1所对应的核苷酸序列如下ATGGCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTCGACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGACTGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCCGCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGTGCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGCGGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATCCATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGA5TCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGAATGAAACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGCCTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGAATATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTACTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATAATGTCACAGTTCAGTGCGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGCATACCGGTCATCATCACCATCACCAT(SEQIDNO:3)本发明的SEQIDNO:2所对应的核苷酸序列如下ATGGCCGGGCTATCCCGCGGGTCCGCGCGCGCACTGCTCGCCGCCCTGCTGGCGTCGACGCTGTTGGCGCTGCTCGTGTCGCCCGCGCGGGGTCGCGGCGGCCGGGACCACGGGGACTGGGACGAGGCCTCCCGGCTGCCGCCGCTACCACCCCGCGAGGACGCGGCGCGCGTGGCCCGCTTCGTGACGCACGTCTCCGACTGGGGCGCTCTGGCCACCATCTCCACGCTGGAGGCGGTGCGCGGCCGGCCCTTCGCCGACGTCCTCTCGCTCAGCGACGGGCCCCCGGGCGCGGGCAGCGGCGTGCCCTATTTCTACCTGAGCCCGCTGCAGCTCTCCGTGAGCAACCTGCAGGAGAATCCATATGCTACACTGACCATGACTTTGGCACAGACCAACTTCTGCAAGAAACATGGATTTGATCCACAAAGTCCCCTTTGTGTTCACATAATGCTGTCAGGAACTGTGACCAAGGTGGCAGAAACAGAAATGGATATTGCAAAGCATTCGTTATTCATTCGACACCCTGAGATGAAAACCTGGCCTTCCAGCCATAATTGGTTCTTTGCTAAGTTGGCGATAACCAATATCTGGGTCCTGGACTACTTTGGTGGACCAAAAATCGTGACACCAGAAGAATATTATGCAGTCACAGTTCAGTGCGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCTTCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATATGCATACCGGTCATCATCACCATCACCAT(SEQIDNO:4)本发明的具体实施方案如下1、用RT-PCR技术扩增终止密码突变的hCREG开放读码框(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)并构建pcDM3.1myc-His/hCREG真核表达栽体。2、Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司)转染人293F细胞林并筛选稳定表达细胞克隆，Westernblotting方法鉴定hCREG/rayc-His融合蛋白(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)的表达，糖苷酶法及Westernblotting行hCREG/myc-His融合蛋白的糖基化分析。3、根据6xHis亲和层析原理，应用Ni-NTA柱(美国Invitrogen公司)纯化重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白，纯化后蛋白过HiTrap去盐柱(GEHealthcareBio-SciencesAB)脱盐。4、用流式细胞周期分析及假尿嘧啶(BrdU)掺入实验证实，重组hCREG/myc-His融合蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG/rayc-His融合蛋白与对照组相比均可抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖，但重组hCREG/myc-His融合蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG/myc-His融合蛋白。具体实施例方式下列实施例是对本发明的进一步解释和说明。实施例1.pcDNA3.1myc-His/hCREG(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)真核表达载体的构建及鉴定根据GenBank(NM003851)登录的hCREGcDNA序列中的开放阅读框，设计并合成终止密码突变的hCREGRT-PCR引物。上游引物为5，-aaggatccatggccgggctatcccgc-3，基础Tm=66匸，盐(50raM)调节Tm=74°C;下游引物为5，-gcgaattcGcactgaactgtgacattataatattcttctgg-3，基础Tm=64°C，盐(50mM)调节Tm=74°C;其中大写字母代表C/G突变的终止密码。从人体外培养的VSMCs中提取mRM并反转录成cDNA(TakaRa公司的cDNA第一链合成试剂盒。扩增条件是25。C,5分钟；42'C，50分钟，95'C，10分钟)，通过下列反应体系和反应条件扩增出人CREGcDNA编码序列共667个碱基。7具体条件dH2036.5pidNTP4jal緩冲液5pi引物(l)1.5pi引物(2)1pi模板1WDM聚合酶(TakaRa/>司)0.25;il94°C15秒58°C30秒72°C40秒45循环扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后，将其克隆至pMD18-T载体(TakaRa公司，No:D101A)。用亚克隆技术通过BamHI和EcoRI两个酶切位点将pMD18-T/hCREG载体中hCREGcDNA亚克隆至pcDNA3.1myc-His载体(美国Invitrogen/>司，No:V800-20)，获得带有myc和His标签的真核表达载体pcDM3.1myc-His/hCREG，送TakaRa公司测序鉴定，证实序列与GenBank(NM003851)及上海生工生物工程技术服务有限公司合成的糖基化位点突变的hCREG序列完全一致。2.稳定转染细胞克隆的篩选及鉴定应用Lipofectamine2000试剂将pcDNA3.1myc-His/hCREG栽体转染至人293F细胞中。转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺至6孔板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。转染前每孔细胞换为2mL不含血清不含抗生素的DMEM培养基。用250)il无血清培养基(服EM培养基)稀释4DM(即hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达栽体)，250piDMEM培养基稀释8piLipofectamine2000试剂，5分钟内同稀释的DNA混合，室温保温20分钟。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。37°C，5%C02培养6小时后，弃掉每孔中的培养基，重新加8入2mL含10。/。新生牛血清及抗生素的DMEM培养基。37。C，5。/。的C02中培养24小时后l:IO传代，次日加入G418(1000|lig/mL)筛选稳定转染的细胞克隆。将稳定转染的293F细胞及未转染的对照细胞分别在10cm培养皿中培养至80。/。90。/。融合，加蛋白裂解液IOOjnl(含蛋白酶抑制剂2Ml)提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE后，分别以l:3500Anti-myc、1:2500Anti-His(美国Invitrogen公司)及l:5000Anti-hCREG单克隆抗体(美国Santacruz公司)作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体(中杉公司)作为二抗行Westernblotting检测，用ECL试剂盒(Amersham公司)发光显影。稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的293F细胞裂解产物，用hCREG抗体、myc抗体及His抗体分别可检测到大小约为30KD及25KD的融合蛋白表达条带。3.hCREG/myc-His融合蛋白(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)的糖基化鉴定将稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的人293F细胞及未转染的对照细胞分别取20nl样品，加入lx糖蛋白变性緩沖液2ju1IO(TC煮沸IO分钟后，加入10xG7緩沖液2jal及10%NP-402m1，再加入2ju1肽N-糖苷酶F(PNGaseF)(美国Bio-labs公司)，37。C温育l小时。取正常样品及PNGaseF处理后的样品经SDS-PAGE后，分别以l:3500Anti-myc、1:2500Anti-His及l:5000节Anti-hCREG单克隆抗体作为一抗，以辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体作为二抗行WesternBlotting检测，用ECL试剂盒发光显影。经PNGaseF处理后，对照组hCREG蛋白及hCREG融合蛋白分子量降低大约IOKD左右，电泳条带下移，证明两种条件下分泌的hCREG蛋白均为糖基化蛋白。Anti-myc及Anti-His的Westernblotting结果显示对照组细胞中无His及myc蛋白表达，而转染组细胞中可见30KD的蛋白条带，经PNGaseF处理后，分子量降低，条带下移，证实了转染组细胞中表达的重组hCREG/myc-His蛋白为一种糖基化蛋白。糖基化位点突变的hCREG蛋白经PNGaseF处理前后Anti-hCREG、Anti-myc及Anti-His的WesternblotUng条带分子量无变化，均为25KD左右。4.重组hCREG(包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG)蛋白的纯化及浓缩、脱盐将稳定转染hCREG及糖基化位点突变的hCREG真核表达载体的人293F细胞接种于直径为10cm培养亚上(含10%胎牛血清的DMEM培养基中)扩增培养，分别收集200皿的钿胞，PBS洗两次后用细胞刮刮除细胞，每10个皿的细胞收集到1个锥形管中，1500rpm离心10分钟，弃上清。纯化所需试剂配制及操作过程如下①裂解緩冲液50mMTris(pH7.5)100mM咪喳400mMNaCl5tnM(3-巯基乙醇5%甘油1%TritonX-100蛋白抑制剂(noEDTA)贮存浓度0.5M3M4M剂量10mL3.3mL10ml360iu1(14.3M)5ml1100|i1(去离子水补至100mL)每个锥形管中加入l2mL裂解緩沖液，反复吹打混匀，水上放置30分钟后，分装1.5mLEppendorf管，13000rpm离心30分钟，取8mL上清加入O.5mL用去离子水清洗并与裂解緩冲液预结合过的Ni-NTA树脂中，4°C旋转过夜。使树脂通过重力沉降，仔细吸抽上清，4X:保存用于SDS-PAGE。贮存浓度剂量0.5M10mL3M5mL4M10mL360(i1(14.3M)5mL1mL②洗液I50mMTris(pH8.0)150mM咪哇400mMNaCl5mM(3-巯基乙醇5%甘油1%TritonX—100(去离子水补至100mL)③洗液II贮存浓度50mMTris(pH8.0)0.5M200mM咪峻3M1MNaCl4M5mMP-巯基乙醇5%甘油1%TritonX-100(去离子水补至100mU洗液III贮存浓度50mMTris(pH8.0)0.5M200mM咪哇3M400mMNaCl4M5mM卩-巯基乙醇5%甘油(去离子水补至100mL)加入8mL洗液I，反复混勻10-15分钟，使树脂通过重力沉降，仔细吸抽上清，4'C保存作SDS-PAGE用。加入洗液II和洗液III，各洗涤1次，方法同上。贮存浓度0.5M3M4M剂量10mL6.6mL25mL360ml(14.3m)5mL1mL剂量10mL6.6mL10mL360|jL(14.3M)5mL白洗脱緩冲液50mMTris(pH8.0)250mM咪哇200mMNaCl5mMP-巯基乙醇5%甘油(去离子水补至100mL)加入5mL洗脱緩沖液，垂直固定纯化柱，去除底端的帽，洗脱蛋收集洗脱液，重复3次。分别将收集的两种蛋白洗脱液各15mL用剂量10mL8.3mL5mL360iaL(14.3M)5mLCentriprep柱子(法国Millipore/^司)超滤浓缩至600y1。经过HiTrap去盐柱(GEHealthcareBio—SciencesAB)脱盐。重组的hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白分别经BCA法测定并与蛋白标准曲线比较，浓度分别为l.2mg/mL和L6mg/mL。考染后经image-J软件分析，纯度分别为92%和90%。5.重组hCREG蛋白((包括hCREG及糖基化位点突变的hCREG))抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖本室研究发现，有血清条件下培养的人动脉平滑肌细胞CREG表达量低，去血清后CREG的mRNA表达上调(HanYa-Ling，ProgBiochemBiophys，2003;30(6):868-873)。故本实验将重组CREG蛋白添加至有血清培养的人动脉平滑肌细胞中，以研究其对细胞增殖的影响。将人动脉平滑肌细胞分别在3个直径为10cm培养皿中培养至60%~70%融合，无血清培养72小时后进行细胞周期同步化，其后更换为含IO。/。新生牛血清的DMEM,分别设为对照组、添加2yg/mLhCREG蛋白组及添加2yg/mL糖基化位点突变的重组hCREG蛋白，继续培养48小时。0.25%胰蛋白酶消化并收获细胞，75%水乙醇固定2小时，碘化乙碇染色l小时，流式细胞仪分析细胞周期。结果提示重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白与对照组相比均可显著抑制体外培养的人动脉平滑肌细胞增殖，G0/G1期细胞比率(共计数2万个细胞)显著增加(表l)。证实重组hCREG蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。表l添加重组hCREG蛋白后人VSMCs的细胞周期分布(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注数据是各细胞周期占总计数细胞的比率于6孔板中每孔分别接种1x104个人VSMCs，分别设为对照组、添加2yg/mLhCREG蛋白组及添加2Mg/mL糖基化位点突变的hCREG蛋白组，每组细胞平行做两个复孔。37°C，5。/。的C02中培养48小时后换液，加入IOmg/mLBrdU，继续培养2小时后，常规固定、通透，浓盐酸变性5min，封闭后加Anti-BrdU抗体(1:100)4'C过夜，二抗(1:100)室温2小时，加入DAB，待显色明显时PBS终止反应，并以苏木素复染细胞核。显微镜下观察细胞核着色情况。每孔计数10个视野，计算着色细胞比例。阳性结果判断细胞核内着染棕黄色颗粒者为BrdU阳性细胞。表2添加不同重组hCREG蛋白的BrdU阳性细胞率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注数据是各组BrdU阳性细胞的比率结果提示添加重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的重组hCREG蛋白与对照组相比均可显著抑制体外培养的人VSMCs增殖，BrdU阳性细胞的比率降低(表2)。其中重组hCREG蛋白的抑制作用强于糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。组间比较均有统计学差异(代O.05)。6.实验的统计学处理方法本研究实验数椐均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSSll.O软件包处理。尸<0.05为有统计学差异。权利要求1、一种携带人SeqIDNo3所示核苷酸序列的真核表达载体及一种携带SeqIDNo4所示核苷酸序列的真核表达载体。2、由权利要求1所述真核表达载体制备的SeqIDNo:1所示的重组hCREG蛋白和SeqIDNo:2所示的糖基化位点突变的重组hCREG蛋白。3、含有权利要求3的重组蛋白的药物组合物。4、SeqIDNo:1所示的重组hCREG蛋白和SeqIDNo:2所示的糖基化位点突变的重组hCREG蛋白在制备用于对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物中的用途。全文摘要本发明涉及一种携带人E1A激活基因阻遏子(hCREG)基因的真核表达载体及一种携带糖基化位点突变的hCREG基因的真核表达载体，本发明还涉及所述真核表达载体用于制备重组hCREG蛋白及糖基化位点突变的hCREG蛋白，两种蛋白抑制血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)增殖的作用及用于制备对PCI术后再狭窄具有抑制作用的药物及其用途。文档编号A61P9/00GK101519663SQ200810007540公开日2009年9月2日申请日期2008年2月27日优先权日2008年2月27日发明者孙鸣宇,健康,张效林,波栾,闫承慧,韩雅玲申请人:中国人民解放军沈阳军区总医院