专利名称：日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因的克隆和表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因的克隆和 表达及其应用。
背景技术：
血吸虫病(schistosomiasis)是由血吸虫(schistosome)感染引起的一禾中 分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。据世界卫生组织统计，目前全球仍有 74个国家和地区流行血吸虫病，有6. 5亿人受到威胁，约1. 93亿人感染血吸虫 病(Chisulo L等，Acestor N, Masina S， Walker J， et al, Establishing two-dimensional gels for the analysis of Leishmania proteomes. Proteomics: 2002， 2(7):877-879.)。血吸虫的能量主要是通过糖酵解过程获得的。磷酸甘油 酸变位酶(phosphoglycerate mutas PGAM)是糖酵解过程中的一个重要酶，主要 催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。该酶在血吸虫能量代谢过程中与碳水 化合物转运、新陈代谢调节和生长发育等有关(Acestor N， Masina S, Walker J， et al， Establishing two-dimensional gels for the analysis of Leishmania proteomes. Proteomics, 2002, 2(7) :877-879.)。磷酸甘油酸变位酶的多样性 和编码这种酶基因序列的多变性使之成为研究生物多样性和分子进化的重要对 象(Ashton P. D. ， Curwen R. S. ， Wilson R. A. ， Linking proteome and genome: how to identify parasite proteins. Trends Parasitol， 2001， 17(4):198-202. ; Barrett J, Jefferies J.R., Brophy P. M.， Parasite proteomics. Parasitol Today, 2000， 16 (9) : 400-403.)。但至今，对编码 该酶的基因表达调控研究仍很少，尤其是在日本血吸虫方面，更待进一步的探索。
6血吸虫病是一个严重的世界性的公共卫生问题。血吸虫病防治已持续数十年，全 面控制血吸虫病传播的前景仍不容乐观，血吸虫病疫苗的研究与发展己被置于防 治研究的重要地位，Cheng G. F., Lin J. J. ， Feng X. G., et al, Proteomics analysis of differentially expressed proteins between the male and female worm of Schistosoma japonicum after pairing. Proteomics, 2005， 5:511-52L) (CleggJ. A., Smithers S. R. ， Terry R. J. ， Acquisition of human antigens by Schistosoma mansoni during cultivation in vitro. Nature, 1971, 232(5313) :653-654.)。血吸虫童虫是血吸虫在终宿主体内发育的早期阶段也是 虫体发育最关键的阶段，虫体小，较成虫脆弱，对宿主的免疫应答特别敏感，容 易受到免疫攻击；尤其是肺期、肝期童虫是其个体发育、性别分化的关键性阶段， 也是宿主免疫系统攻击的重要靶标，(Cohen A.M., Rumpel K, Coombs G. H., et al, Characterisation of global protein expression by two- dimensional electrophoresis and mass spectrometry: proteomics of Toxoplasma gondii. Int J Parasitol, 2002， 32(1) :39-51.)。 一些血吸虫童虫具有的差异表达蛋 白可能与童虫的生长、发育、性别分化等息息相关，加强这些差异表达蛋白的研 究，可为研究高效的抗感染的分子疫苗提供基础。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于对磷酸甘油酸变位酶进一步的研究，尤其是曰 本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因。
本发明提供了日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因SjPGAM (日本血吸虫磷酸 甘油酸变位酶)。具有SEQID1的序列。该基因的完整编码框含753bp，编码250 个氨基酸，理论分子量28.26kD，理论等电点7.01。同源性分析结果表明，该基 因的氨基酸序列具有典型PGAM (磷酸甘油酸变位酶)家族特征，推测为血吸虫 的PGAM基因，命名为SjPGAM (日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶)(GenBank登陆号EU37463D。
本发明的另一目的是提供了日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因SjPGAM的克 隆和表达。
本发明人利用PCR技术首次克隆到编码日本血吸虫PGAM蛋白的含0RF(开放 阅读框架)的cDNA序列，分析了该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表 达情况，应用大肠杆菌系统进行了表达，并对表达产物进行了抗原性测定。
本发明日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因的克隆和表达包括下列步骤 1材料与方法 1. 1材料
1.1.1主要试剂和酶Trizol、GeneRacer111 Kit购自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶Hind III、 Xho I 、荧光定量 PCR检测试剂盒和随机引物购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；联苯二胺 (DAB)、 DEPC购自上海生工生物工程公司；硝酸纤维素膜购自上海维编科贸有 限公司；逆转录酶购自Stratagen公司；RNA酶抑制剂购自Promega公司;SYBR Green I (绿色荧光染料I )购自BI0-RAD公司。荧光定量PCR的标准品购自复 旦悦达生物技术有限公司；羊抗兔IgG-HRP (辣根过氧(化)物酶标记的免疫球 蛋白)购自华美生物工程公司；日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清由本所提供。 1.1.2菌种、质粒及实验动物pET28a(+)(表达质粒)菌液/大肠杆菌DH5 a 、 BL21由本所保存(该菌种是公开的，能市售得到)。新西兰白兔(雄性，2. 5kg-3kg) 购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农科院上 海兽医研究所钉螺室提供。 1.2方法
1.2.1虫体的收集新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000、 8000、 5000、 2000条血吸虫尾蚴，在7d、 14d、 19d、 27d、 32d和42d后剖杀，以肝门静脉灌 注法收集虫体，液氮冻存备用。1.2.2总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19d童虫200mg，按TRIzol 试剂盒说明书进行总RNA的提取。
1.2.3引物设计和含ORF cDNA片断的扩增首先在双向电泳结合肽质量指纹 图谱分析基础上获得的一个在童虫期呈现高表达的PGAM蛋白的一段序列，以此 肽序列为询问序列，在日本血吸虫EST库中搜索到1个日本血吸虫的相应EST 片段(GenBank登录号AAL30898.2)。根据该EST序列，设计特异引物，应用PCR 技术进行 cDNA 片断的扩增。上游引物 SjPGAMs : 5' -GCGAAGCTTCAGATTGTATGGCTCCCTAC-3'，引入酶切位点Hind III(加下划线)； 下游引物S jPGAMr: 5' -AGACTCGAGTCTTCTTTCCTTGATTCGC-3'，引入酶切位点Xho I(加下划线)，由上海英骏生物技术有限公司合成。取反转录得到的cDNA 为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为94'C预变性5min，然后94°C、 30s， 56°C、 30s， 72°C、 45s，共30个循环，循环结束后72。C延伸lOmin。 PCR产物用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，酶切纯化后与用同样酶酶切的pET28a(+)载 体连接，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，选单个菌落扩大培养，提取质粒进 行酶切鉴定，阳性质粒命名为pET28a(+)-SjPGAM并送英骏生物技术有限公司测 序。
1. 2. 4生物信息学分析将测序得到的cDNA在NCBI (全美生物技术信息中心) 上进行同源性比对(http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST);利用NCBI上的ORF finder软件找出新基因的读码框，再利用瑞士生物信息学研究所
(http:〃tw. expasy.org/)提供的ProtParam软件对氨基酸残基数目、组成、 蛋白质相对分子质量(Mr)、理论等电点等参数进行在线分析。 1.2.5荧光实时定量PCR :试验中选择血吸虫持家基因a-微管蛋白
(a-tubulin)为内参。分别提取7d、 14d、 19d、 27d、 32d虫体及42d雄虫、 雌虫总RNA，去除基因组DNA后利用随机引物合成cDNA第一链。SjPGAM荧光定 量PCR引物SjPGAM FP:5' -ATGGCTCCCTACAAAATTGTATTCA-3, SjPGAM RP:5' -ATCGAGTTTGTGCTAAAACAAAGTTT -3'，扩增SjPGAM基因片段长度为220bp; a-tubulin荧光定量PCR引物SI: 5' -CTGATTTTCCATTCGTTTG -3' ， S2: 5' -GTTGTCTACCATGAAGGCA-3'，片段扩增长度213bp。引物由上海英骏生物技 术有限公司合成。采用荧光染料法进行实时定量PCR，反应体系包括5XR-PCR Buffer 5W， 25mM Mg2+2. 5W， IO幽引物1. OW， 25XSYBR Green I LOW, 10—3X Calibration l，l， 5U/rt Ex Taq HS 0. 25W， ddH20 14. 7W，模板cDNA l.OMl，共25W。反应参数95°C 90s， (95°C 5s， 58°C 30s) 40个循环，其中 58°C 30s结束时间为荧光信号检测点。每个反应均做3孔重复。采用BIO-RAD 公司iCycler IQ version 3. 0软件进行计算分析，以a-tubulin为内参标化 反应结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量。
1.2.6重组表达质粒的构建根据SjPGAM基因的cDNA序列设计引物，在其扩 增序列的5'端和3'端分别引入Hind III和XhoI酶切位点，通过PCR扩增得到 含完整ORF的SjPGAM基因序列，将该序列定向克隆于原核表达载体pET28 (+)(表 达质粒)的多克隆位点区，构建重组质粒pET28a(+)-SjPGAM (重组质粒)，并转 化表达宿主菌BL21 (DH5 a )。
1.2.7在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pET28a(+)-SjPGAM/BL21(DH5 a )(表 达质粒)接种于LB (LB培养基)培养基(培养基组成成分胰蛋白胨，酵母粉， 氯化钠)，37'C振荡培养，0D6。。时加入终浓度为ImMIPTG (异丙基硫代半乳糖苷) 诱导表达。在IPTG诱导后0h、 0. 5h、 lh、 2h、 4h、 6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE 分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间。
1.2.8 Western blotting (蛋白质印迹)检测将高表达时相菌体蛋白SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用经 pET28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗， 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (免疫球蛋白)为二抗，DAB (二氨基联苯胺) 作为底物进行显色。2结果
2.1 SjPGAM基因的克隆及生物信息学分析
对本在双向电泳技术和质谱技术基础上获得的登陆号为AAL30898.2的19 天血吸虫童虫差异表达蛋白phosphoglycerate mutas进行了深入研究，设计特 异性引物，应用PCR技术得到了编码日本血吸虫PGAM的EST。经生物信息学分 析该EST长度为1003bp (SeQl)。利用NCBI的Blast软件对该序列进行同源性 搜索，结果显示该基因序列与血吸虫其它已知基因无显著同源性，为血吸虫新基 因。氨基酸序列的相似性比较结果显示该基因编码蛋白与PGAM家族蛋白具有高 度同源性，具有十分典型的PGAM家族蛋白特征。选择了分别来自华支睾吸虫 (GeneBank登陆号AY796059)、人(GeneBank登陆号AAH53356)、小鼠(GeneBank 登陆号NP—059024)、植物干酵母(GeneBank登陆号CAA41595)、大肠杆菌 (GeneBank登陆号NP—415276)， 5个物种的PGAM蛋白进行氨基酸序列的多重比 对，结果显示，该基因所编码氨基酸序列与华支睾吸虫的PGAM相似性最高，达 79% (E=4e-116)，与人PGAM的相似性为58% ，其余皆在51% 54%之间。据 此，推测该基因编码的蛋白为日本血吸虫PGAM蛋白，将该基因命名为日本血吸 虫PGAM (SjPGAM) (GenBank登陆号EU374631)。
对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析结果表明，SjPGAM基因的 ORF含753bp的核苷酸序列，由250个氨基酸残基组成，理论分子量为28257.2， 理论等电点为7.01。
本发明的又一目的是提供了日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因SjPGAM在制 备防治血吸虫病药物中的应用。 本发明人进行了下列试验
本发明所克隆的日本血吸虫PGAM基因(SjPGAM)属于PGAM基因家族的成员之 一。故选择一个在童虫期呈现高表达、同时又是糖酵解途径关键酶SjPGAM进行了 克隆、表达学研究。PGAM是糖酵解过程中的一个重要酶。糖酵解过程存在于几乎
11所有类型的细胞(包括真核细胞和原核细胞)。 一般认为，在血吸虫细胞中，糖酵 解主要发生在胞质(cytosol)中，经过很多步骤的酶促反应使葡萄糖分解为丙酮 酸，终产物丙酮酸再进入线粒体中作为起始物参与三羧酸循环，产生大量的高能 分子ATP，供血吸虫生长发育之需。其具有分子内转移酶活性，和碳水化合物转 运、新陈代谢、催化活性及生长发育有关。PGAM广泛地存在于大肠杆菌、酵母、 细菌、以及人类等生物，但对编码这种酶的基因表达调控研究和生长、发育、能 量代谢相关研究仍很少，尤其是在日本血吸虫方面。日本血吸虫PGAM基因的成功 克隆，不仅丰富了PGAM基因家族的普遍生物学知识，更为开展对血吸虫能量代谢、 生长发育机制的研究提供了切入点，具有重要的价值。
1、 SjPGAM基因的期别、性别表达分析
为了 了解S jPGAM基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况，提取7d、 14d、 19d、 27d、 32d虫体及42d雄虫、雌虫虫体总RNA，选择持家基因a -tubulin 作为内参，利用荧光定量PCR法检测该基因在日本血吸虫几个不同发育阶段虫体 的表达情况。实验结果表明，SjPGAM在日本血吸虫19d和14d童虫中表达量最 高，42d雄虫中的表达量比雌虫高(图l)。
2、 重组原核表达质粒pET28a(+)-SjPGAM的构建
经PCR、 Hind III和Xho I双酶切鉴定(图2)和测序证实重组表达质粒构建 成功。
3、 SjPGAM基因在大肠杆菌中的表达
重组表达质粒pET28a(+)-SjPGAM在大肠杆菌BL21 (DH5a )中获得表达， SDS-PAGE电泳结果显示，l福IPTG诱导4h达到最大表达量；重组蛋白分子量约 为31kD，与预期结果相符(SjPGAM蛋白推测分子量约为28.26kD，载体表达蛋白 3kD)(图3)。重组蛋白以包涵体形式存在，溶解于8M尿素的PBS。
4、 表达产物抗原性的鉴定以重组表达产物进行SDS-PAGE电泳，经电转移至NC膜上，用经 pET28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫血清作一抗进行 Western blot分析，结果在31kD处有一明显的识别条带(图4)，表明重组表达 产物蛋白具有良好的抗原性。
结果表明本发明SjPGAM基因在日本血吸虫感染宿主后第14d和19d童虫的 表达要显著高于7d、 27d、 32d虫体及42d雄虫和雌虫；与此同时，该基因在42d 雄虫中的表达高于42d雌虫。因此，通过对PGAM结构功能的研究，寻找可抑制 该酶活性、干扰血吸虫的糖酵解酶系、影响虫体糖酵解生化代谢和能量供给的功 能分子，通过人为干预，抑制血吸虫PGAM的表达或者以PGAM蛋白为药靶抑制它 的活性，从而控制血吸虫糖酵解途径，对减轻血吸虫病的病理损害及阻断传播将 有重要意义。Western blotting结果表明本研究获得的重组表达产物具有良好 的抗原性，可用于制备防治血吸虫病的药物。
本发明首次克隆和表达了日本血吸虫PGAM基因，为探索PGAM基因家族在血吸 虫能量代谢过程中碳水化合物转运、新陈代谢调节和生长发育提供了重要基础。
图1实时定量PCR检测5^7^4#基因在日本血吸虫不同期别和性别虫体中的表达
7天七天童虫；14天14天童虫；19天19天童虫；27天27天虫体；
32天32天虫体；42d (雌)42天雌虫；42d (雄)42天雄虫；42天42 天成虫
图2重组质粒pET28a(+)-57尸fiW双酶切及PCR鉴定
DNA标准分子量DL15 000; 1: pET28a(+) -5"jFftW重组质粒经///"t/IIIand J力oI双酶切；2: pET28a(+)空载体经历/ J IIIand /力oI双酶切；M2: DNA标准 分子量DL2 000; 3: PCR产物图3 SDS-PAGE分析pET28a(+)-SjPGAM/BL21 (DH5 a )不同时相的表达蛋白 M:蛋白标准分子量；1-6:重组质粒pET28a(+)-&H^#/BL21 (DH5 a )在诱导后 0h， 0. 5h， lh, 2h， 4h, 6h的表达产物.7: pET28a(+) -5^尸譜/BL21 (DH5 a )不加
IPTG培养6h的产物 图4 pET28a(+)-5"jP6^/重组蛋白的Western blQtting分析
M:预染蛋白标准分子量；1: pET28a(+) -SjPGAM未诱导产物2: pET28a(+)-SjPGAM诱导表达产物； 以日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗进行的Western blotting
具体实施方式
实施例l 1.克隆 总RNA提取
取液氮中冻存的日本血吸虫童虫和成虫，按TRIzol试剂盒说明书进行总 RNA的提取。具体步骤如下
1) 每100 mg组织加入lml TRIzol，用玻璃匀浆器匀浆。
2) 室温"5 30。C)放置5min，加入0.2 ml氯仿/lml TRIzol试剂，剧烈摇 动15 s，室温放置2 3 min。 4'C 12 000 g离心10 min，取上清。
3) 将水相转移至新管，加入0.5ml异丙醇/lmLTRIzo1，于室温放置10min。
4) 加入lml 75。/。乙醇/lml TRIzol洗涤沉淀，4'C 7 500 g离心5 min，弃上清。
5) 空气干燥5 10min，加入H20 (RNase free)溶液，反复吹打，并于55 6(TC助溶10min。
6) 琼脂糖凝胶电泳分析RNA样品的完整性，用紫外分光光度计检测RNA 的浓度，并分析其纯度。反转录cDNA 按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。
1) 反转录合成第一链cDNA，
2) 65°C 5min以解离RNA二级结构。冰上冷却至少lmin后，简要离心， 加入下列试剂
反应液组成体积(pi)
5xFirst-Strand Buffer4
Cloned AMVRT (15,)1
RNase OUT (40,1)1
Sterile water2
3) 温和混匀，45。C反转录60min。
4) 85 °C 15min以抑制Cloned AMVRT活性。
5) 简单离心即用或-2(TC储存
取5)^1产物，1X琼脂糖凝胶电泳分析cDNA产物。 2. SjPGAM基因原核表达质粒的构建
1) 以反转录所得S/尸04M的cDNA为模板进行目的基因的扩增
2) PCR产物和质粒pET28a(+)的酶切和纯化
37。C孵育2h。结束后用捷瑞生物工程有限公司DNA纯化试剂盒纯化目的片断。
3) PCR产物与pET28a(+)载体的连接和转化 16。C连接过夜，将PCR产物插入pET28a(+)载体中
将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DH5a)中
① 用CaCl2法新鲜制备BL21(DH5a)感受态细胞(萨姆布鲁克等，2002);
② 将10nl连接反应液加到200 nl感受态细胞中，轻轻混匀；
③ 冰浴放置30 min; 42。C水浴热激90s;
⑤ 冰浴放置2 min;
⑥ 加800 pl LB培养基，37。C振荡培养lh;
⑦ 室温4 000 rpm离心5 min，吸去800 上清液，用剩余的培养基将细胞 悬浮；
⑧ 将细菌涂布在含100 ng/ml Kan的LB固体培养基平板中；
◎平板在37'C正向放置lh以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。 4)质粒的抽提
挑选白色单菌落接种于3ml含100 pg/ml Kan的LB液体培养中，37。C振荡 培养过夜，质粒抽提方法如下-
① 取1.5ml菌液，在4°C 12 OOOg离心30s，尽量去净上清；
② 加100^1预冷的溶液I ，剧烈震荡悬浮细菌沉淀；
③ 加入20(HU溶液II，快速颠倒混匀溶液，置冰浴2min; 加入15(^1预冷的溶液in，温和振荡，置冰浴5min;
⑤ 4。C 12 000g离心10min，取上清放入新的1.5ml离心管中；
⑥ 加入等体积平衡酚溶液，混匀后在4。C 12 OOOg离心5min，取上清放入 新的1.5ml离心管中；
⑦ 加入等体积氯仿异戊醇(24: 1)溶液，混匀后在4'C 12 000g离心5min， 取上清放入新的1.5ml离心管中；
⑧ 加入1/10体积的醋酸钠溶液，2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-2(TC放 置lh;
◎ 4°C 12 OOOg离心10min，弃上清；
⑩用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，待沉淀干燥后加入20^1 ddH20重新溶 解，可放于-2(TC备用。
5)重组质粒pET28a(+)-》尸04M的PCR检测
166)重组质粒pET28a(+)-》'尸04M的双酶切检测 37。C孵育2h。
并将鉴定正确的阳性克隆送上海英骏生物技术公司测序。 3. ^户G4M基因的表达
1) Sy尸04M基因在大肠杆菌中的表达时相分析
① 将鉴定正确的阳性克隆划线培养，挑生长良好的单菌落接种至3ml LB培 养基中(含Kan) 37'C摇床培养过夜。
② 在三角瓶里加入20ml含Kan的LB液体培养基，按1: 100比例接种过 夜培养的菌液，于37'C培养至细菌对数生长期(OD6(K)=0.6)。
③ 在细菌培养物中加入IPTG，使其终浓度为lmM，继续于37'C振荡培养。 分别在加入IPTG后0h、 0.5h、 lh、 2h、 4h、 6h取出lml细菌培养物。
④ 将不同时间取出的菌液在12 000 rpm离心ltnin，弃上清。细菌沉淀用 20 pl水充分悬浮。
⑤ 在上述样品中加入2xSDS PAGE上样缓冲液并充分混匀。10(TC煮样品 5min，直接进行SDS-PAGE电泳或保存于-20"C 。
2) SDS-PAGE凝胶的配置和蛋白质电泳(萨姆布鲁克等，2002): ①溶液的配置
② 配制12。/。分离胶溶液，倒入装置好的玻璃槽中约4/5高，上层轻轻地覆 以适量蒸馏水隔离胶体与空气，并使表面平整。30min后，待胶体凝结，倒掉水 并以定性滤纸吸干表面残余蒸馏水，取配制好的5%浓縮胶，迅速搅拌均匀后倒 入玻璃槽内，插入样品梳，待胶体凝结后取出样品梳。
③ 在电泳槽内加入电泳槽电极液，赶出样品槽内的气泡，在样品槽内分别 加入蛋白电泳分子量标准品和蛋白样，上样量为20pl，接通电源，浓縮胶所加 电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直 至溴酚蓝到达分离胶底部，切断电源。④凝胶染色2h以上，随后脱色，其间更换脱色液3-4次。
凝胶成像系统拍照或制干胶保存。
序列表
SEQ ID 1: SjPGAM的核苷酸和推测氨基酸序列
<uo>中国农业科学院上海兽医研究所 <120> phosphoglycerate mutas <160> 1
<170> Patentln Version 3.3 <210> 1 <211>翻 <212>DNA
<213>日本血吸虫(Schistosomajaponicum)
<220>
<400> 1
gacacac6aaagcgggtttttacgcatttcggattgtgtacgtgattgtgacttcaggca60
cgtcagattgt|atg|gctccctacaaaattgtattcattcgtcatggggagagtgtttaca120
atgaagaaaatagattctgtggttggcatgatgcagacctttcagcgcaaggtgtcaccg180
aagctgaacaagctggtcaattactccaccaaaatcagttcacatttgacactgcctata240
caagtgttctaaaaagagctattaaaacgttaaactttgttttagacaaactcgatctta300
actggatacctgtaacgaaaacctggcgtctaaatgaaagaatgtacggtgctctccagg360
gacttaataagtctgaaactgctgctaaacatggtgagcaacaagttaagatatggagac420
gtgcatatgatatacctcctcctcctgttgatatttcggaccctcgcttccctggtaatg480
aagctaagtatgctttacttgactcttcttgcataccacgtactgaatgcttaaaggaca540
ctgtacaacgtctactaccattctgggttgatactatttctgctgatattaagagctgca600
aacgtgttcttattggcgctcacggtaacagtttacgagcgctcattaagtacttggata660
atacatctgattcggatatagtggagcttaatatacctactggtattccactcgtttatg720
aactagatgcaaacctaaggccaatcaaacactattatcttgcagatgaagcaacagttg780
cagctgctatagatcgtgtagcgaatcaaggaaagaagaaa|taa|atcaaatactctttct840
atggttacttttcacatcatttattcattaatcattaatgcactttcttccgagggattt900
tagttatctgtaggtcttagcgatgaacaaattgtctggttttccgtattcgtaattcga960
ttgcatgaaatcacgtaaatatatttttccgttctcttgtgta1003
起始密码子ATG and终止密码子TAA用方框标出；来源于EST(基因登录号: AAL30898.2)的原始序列用灰色标出。
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权利要求
1、一种日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因，其特征在于具有SEQ ID 1的序列GACACACGAA AGCGGGTTTT TACGCATTTC GGATTGTGTA CGTGATTGTG ACTTCAGGCA 60CGTCAGATTG T id="icf0001" file="A2008100343770002C1.tif" wi="6" he="4" top= "52" left = "47" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>GCTCCC TACAAAATTG TATTCATTCG TCATGGGGAG AGTGTTTACA 120ATGAAGAAAA TAGATTCTGT GGTTGGCATG ATGCAGACCT TTCAGCGCAA GGTGTCACCG 180AAGCTGAACA AGCTGGTCAA TTACTCCACC AAAATCAGTT CACATTTGAC ACTGCCTATA 240CAAGTGTTCT AAAAAGAGCT ATTAAAACGT TAAACTTTGT TTTAGACAAA CTCGATCTTA 300ACTGGATACC TGTAACGAAA ACGTGGCGTC TAAATGAAAG AATGTACGGT GCTCTCCAGG 360GACTTAATAA GTCTGAAACT GCTGCTAAAC ATGGTGAGCA ACAAGTTAAG ATATGGAGAC 420GTGCATATGA TATACCTCCT CCTCCTGTTG ATATTTCGGA CCCTCGCTTC CCTGGTAATG 480AAGCTAAGTA TGCTTTACTT GACTCTTCTT GCATACCACG TACTGAATGC TTAAAGGACA 540CTGTACAACG TGTACTACCA TTCTGGGTTG ATACTATTTC TGCTGATATT AAGAGCTGCA 600AACGTGTTCT TATTGGCGCT CACGGTAACA GTTTACGAGC GCTCATTAAG TACTTGGATA 660ATACATCTGA TTCGGATATA GTGGAGCTTA ATATACCTAC TGGTATTCCA CTCGTTTATG 720AACTAGATGC AAACCTAAGG CCAATCAAAC ACTATTATCT TGCAGATGAA GCAACAGTTG 780CAGCTGCTAT AGATCGTGTA GCGAATCAAG GAAAGAAGAA A id="icf0002" file="A2008100343770002C2.tif" wi="6" he="4" top= "136" left = "109" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>ATCAAA TACTCTTTCT 840ATGGTTACTT TTCACATCAT TTATTCATTA ATCATTAATG CACTTTCTTC CGAGGGATTT 900TAGTTATCTG TAGGTCTTAG CGATGAACAA ATTGTCTGGT TTTCCGTATT CGTAATTCGA 960TTGCATGAAA TCACGTAAAT ATATTTTTCC GTTCTCTTGT GTA 1003所述基因的完整编码框含753bp，编码250个氨基酸，理论分子量28.26kD，理论等电点7.01；同源性分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有典型磷酸甘油酸变位酶家族特征，基因库登陆号EU374631。
2、根据权利要求1所述的一种日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因的克隆和 表达，其特征在于包括下列步骤 (1)材料Trizol、 GeneRacer Kit; Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、 限制性内切酶Hind III、 Xho I 、荧光定量PCR检测试剂盒和随机引物；联苯二胺、DEPC;硝酸纤维素膜；逆转录酶；RNA酶抑制剂；绿色荧光染料I ;荧光定量PCR的标准品；羊抗兔IgG-HRP辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白； 日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清；(2) 菌种、质粒及实验动物pET28a(+)表达质粒菌液/大肠杆菌DH5 a 、 BL21、新西兰白兔雄性，2.5kg-3kg和日本血吸虫中国大陆株尾呦；(3) 方法(-)虫体的收集新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000、 8000、 5000、 2000 条血吸虫尾蚴，在7d、 14d、 19d、 27d、 32d和42d后剖杀，以肝门静脉灌注法 收集虫体，液氮冻存备用； 总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19d童虫200mg，按TRIzol 试剂盒说明书进行总RNA的提取；〇引物设计和含ORF cDNA片断的扩增首先在双向电泳结合肽质量指纹 图谱分析基础上获得的一个在童虫期呈现高表达的PGAM蛋白的一段序列，以此 肽序列为询问序列，在日本血吸虫EST库中搜索到1个日本血吸虫的相应EST 片段基因库登录号AAL30898.2;根据该EST序列，设计特异引物，应用PCR技 术进行cDNA片断的扩增；上游引物SjPGAMs: 5' -GCGAAGCTTCAGATTGTATGGCTCCCTAC-3'，引入酶切 位点Hind III;下游引物SjPGAMr: 5' -AGACTCGAGTCTTCTTTCCTTGATTCGC-3'， 引入酶切位点Xho I;取mi反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反 应条件为94。C预变性5min，然后94。C、 30s， 56°C、 30s， 72°C、 45s，共30个 循环，循环结束后72'C延伸10min、 PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行 回收，酶切纯化后与用同样酶酶切的pET28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌DH5 a感受态细胞，选单个菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定，阳性质粒命名为 pET28a(+)-SjPGAM并测序；卿生物信息学分析将测序得到的cDNA在NCBI上进行同源性比对；利用 NCBI上的ORF finder软件找出新基因的读码框，再利用ProtParam软件对氨基酸残基数目、组成、蛋白质相对分子质量、理论等电点参数进行在线分析；(B)荧光实时定量PCR :试验中选择血吸虫持家基因a-微管蛋白为内参，分 别提取7d、 14d、 19d、 27d、 32d虫体及42d雄虫、雌虫总RNA，去除基因组DNA 后利用随机引物合成cDNA第一链；SjPGAM荧光定量PCR引物SjPGAM FP:5' -ATGGCTCCCTACAAAATTGTATTCA-3， SjPGAM RP: 5' -ATCGAGTTTGTGCTAAAACAAAGTTT -3'，扩增SjPGAM基因片段长 度为220bp; a -tubulin荧光定量PCR引物SI: 5' -CTGATTTTCCATTCGTTTG-3'， S2: 5' -GTTGTCTACCATGAAGGCA-3'，片段扩增长度213bp;采用荧光染料法进行实时定量PCR，反应体系包括5XR-PCR Buffer 5W， 25mM Mg2+ 2.5W， IOmM引物LOW, 25XSYBR Green I 1, ， 10—3X Calibration LOW, 5胁1 Ex Taq HS 0. 25W， ddH20 14.7W，模板cDNA 1. OW， 共25W;反应参数95°C 90s， 95°C 5s， 58°C 30s 40个循环，其中58°C 30s 结束时间为荧光信号检测点，每个反应均做3孔重复，采用BIO-RAD公司 iCycler IQ version 3. O软件进行计算分析，以a-tubulin为内参标化反应 结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；的重组表达质粒的构建根据SjPGAM基因的cDNA序列设计引物，在其扩增 序列的5'端和3'端分别引入Hind III和XhoI酶切位点，通过PCR扩增得到含 完整ORF的SjPGAM基因序列，将该序列定向克隆于原核表达载体pET28(+)的多 克隆位点区，构建重组质粒pET28a(+)-SjPGAM,并转化表达宿主菌BL21 DH5 a ;的在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pET28a(+)-SjPGAM/ BL21 DH5 a接种 于LB培养基，37。C振荡培养，ODe。。时加入终浓度为lmMIPTG诱导表达。在IPTG 诱导后Oh、 0.5h、 lh、 2h、 4h、 6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；(A) Western blotting检测将高表达时相菌体蛋白SDS-PAGE电泳，转移 到硝酸纤维素膜上，用经pET28a(+)/BL21大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，DAB作为底 物进行显色；加生物信息学分析该基因编码的蛋白为日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因，基因登陆号 EU374631。
3、 一种如权利要求1所述的一种日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因在制备 防治血吸虫病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫磷酸甘油酸变位酶基因的克隆和表达。该基因的完整编码框含753bp，编码250个氨基酸，理论分子量28.26kD，理论等电点7.01。同源性分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有典型PGAM家族特征，为血吸虫的PGAM基因，命名为SjPGAM(GenBank登陆号EU374631)。实时定量PCR分析显示该基因在14d和19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段，42d雄虫中的表达量高于雌虫，可用于制备防治血吸虫病药物。
文档编号A61K48/00GK101525625SQ20081003437
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者傅志强, 刘金明, 岩 周, 姚利晓, 林矫矫, 王欣之, 石耀军 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所