3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸、其药物组合物及其用于治疗糖尿病和/或肥胖症的用途的制作方法

专利名称：：3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸、其药物组合物及其用于治疗糖尿病和/或肥胖症的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐、其药物组合物，以及其可作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂、l币-羟基类固醇脱氬酶1(lip-HSD！)抑制剂、糖皮质激素受体(GR)拮抗剂以及核受体LXRa:RXRoc异源二聚体激动剂而用于治疗糖尿病和/或肥胖症的医药用途。
背景技术：
：糖尿病(diabetesmellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低而引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。在糖尿病人中发生冠心病、缺铁性或出血性脑血管病、失明、肢端坏疽等严重并发症均明显高于非糖尿病人群。据世界卫生组织WHO预计，由于人口老龄化、肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式，到2025年，糖尿病患者的数目将由1995年的1.35亿上升为3亿。因此，糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。目前一般将糖尿病分为两类，即I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病，IDDM)与II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中85~90%属于11型糖尿病(澳洲健康与福利研究院，AustralianInstituteofHealthandWelfare,2003)。II型糖尿病发病机制多样而复杂，各病人间存在较大差异，概括起来可分为胰岛素分泌的相对不足和胰岛素抵抗两类。对于II型糖尿病人尤其是肥胖型糖尿病患者，胰岛素抵抗是II型糖尿病发生、发展3过程中的关键因素。因此，在研究脂肪细胞和肌肉细胞内胰岛素信号传导途径的基础上，设计开发胰岛素增敏剂,以改善胰岛素抵抗状态，是目前II型糖尿病新药研究的重点，也是其主要方向之一。在胰岛素信号通路中，胰岛素通过与其受体(Insulinreceptor,IR)的胞外a亚单位结合而激活受体胞内P亚单位内在的酪氨酸激酶活性，导致调节结构域中关键的酪氨酸残基自身磷酸化使其酪氨酸激酶活性被激活，活化的胰岛素受体(IR)再通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)等中间效应子将信号传递到蛋白激酶B(AKT)上，蛋白激酶B(AKT)被激活后将信号传递给负责葡萄糖运输的关键因子一葡萄糖转运子4(Glut4)，促使后者上膜并进行葡萄糖的转运。葡萄糖转运子4(Glut4)主要分布于胰岛素应答组织如肌肉和脂肪组织，它在机体细胞进行葡萄糖吸收维持血糖平衡中起着关键的作用。研究表明，葡萄糖转运子4(Glut4)基因敲除的杂合子Glut4(+/-)老鼠显示胰岛素抵抗综合症的表现，而重新引入葡萄糖转运子4(Glut4)可以恢复整体胰岛素的活性[NatMed，3:1096-101,1997.]。蛋白酪氨酸磷酸酶(ProteinTyrosinePhosphatase,PTPase)包括一组跨膜(受体型)和胞内(非受体型)酶，如蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)、CD45蛋白酪氨酸磷酸酶(CD45)、T细胞蛋白酪氨酸磷脂酶(TCPCP)、白细胞共同抗原相关蛋白(LAR)及蛋白质酪氨酸磷酸酶oc(PTPa)，它们参与调控一系列重要生命过程。研究表明，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)可直接作用于磷酸化活化的胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物l(IRS-1)并将其去磷酸化，从而削弱其活性，对胰岛素通路起负调控作用。Elchebly等报道，运用同源重组的方法产生的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因敲除的小鼠生长正常且有生殖力，更为重要的是该小鼠对胰岛素敏感性显著增强，而且这一增强作用与肝脏和骨骼肌中胰岛素受体及胰岛素受体底物l磷酸化水平的增强相关[Science,283:1544-8，1999]。同时，蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因敲除的小鼠基本代谢水平和总体能量消耗升高，对食物诱导的肥胖和胰岛素抵抗也具有4氐抗作用[MolCellBiol,20:5479-89，2000]。因此，目前蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)被认为是治疗II型糖尿病和肥胖症的一个重要的潜在药物作用耙点。然而，由于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)在细胞中参与了多种信号通路的调控，因此，非特异性的蛋白酪氨酸石粦酸酶(PTPases)抑制剂往往会伴随着多种副作用的产生。而由于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)家族成员间在结构上具有高度同源性，因此目前发现的绝大多数蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTP1B)都是非特异性的抑制剂，因此寻找天然、高效、高选择性的蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂具有重要的意义。糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)是由Hench、Kendall和Reichstein这三位科学家于1950年首次发现的，它是由肾上腺皮质分泌的一类甾体激素，有两种存在形式，在人类为有活性的皮质醇(Cortisol)与无活性的ll-脱氬皮质酮(cortisone,可的松)，在啮齿类为皮质酮(Corticosterone)与脱氬皮质酮(dehydro-corticosterone)。糖皮质激素被广泛地应用于治疗炎症及免疫抑制反应。然而近期研究发现，过量的糖皮质激素水平与柯兴氏综合症(Cushing，ssyndrome)密切相关[Diabetes,53:1790-7,2004],柯兴氏综合症表现最突出的是进行性的肥胖和胰岛素抵抗。11p-羟基类固醇脱氬酶(11(3-hydroxysteroiddehydrogenase,11(3-HSD)是短链氧化还原酶家族的成员，在人类，催化糖皮质激素Cll位的酮基与羟基之间的氧化还原反应，催化生物活性的皮质醇(Cortisol)与无活性的11-脱氲皮质酮(cortisone，可的松)之间的相互转化；在啮齿类，它催化皮质西同(Corticosterone)与脱氢皮质酮(dehydro-corticosterone)之间的相互转化。目前，已发现lip-羟基类固醇脱氢酶(11]3-HSD)分为两种亚型，即lip-羟基类固醇脱氢酶1(11(3-HSDO和11(3-羟基类固醇脱氬酶2(llp-HSD2)。ll卩-羟基类固醇脱氬酶1(11(3-HSD!)是一种低亲和力的NADP(H)依赖性氧化还原酶，主要在肝脏、脂肪组织、性腺、脑、胎盘和血管平滑肌等糖皮质激素的靶器官表达，具有氧化和还原酶活性。在无细胞体系或纯化的蛋白质中主要表现为氧化活性，在完整细胞或体内，由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)的存在能保证内质网中高浓度NADPH的供应而主要表现为还原活性。Up-羟基类固醇脱氢酶2(llp-HSD2)是一种高亲和力NAD依赖性脱氢酶，主要分布于肾远曲小管、集合管、胰腺、汗腺、直肠等盐皮质激素的靶器官。它是单一氧化酶，能催化皮质醇转化为可的松，在皮质醇过多时通过氧化作用使其转化成无活性的可的松，以保护肾和结肠等组织中非选择性盐皮质激素受体(Mineralocorticoidreceptor,MR),11(3-羟基类固醇脱氢酶2(11p-HSD2)被抑制将会产生严重的副作用，如高血压。Kotelevtsev等对11(3-羟基类固醇脱氢酶1()基因敲除小鼠的研究表明，11(3-HSDi(-/-)小鼠与正常小鼠相比在外观上没有任何异常，并且具有正常的生育能力，更为重要的是，研究人员通过考察lip-羟基类固醇脱氢酶l(lip-HSD!)在肝葡萄糖生成中的作用时，发现高脂肪喂食的11(3-HSD")小鼠禁食状态下的血糖水平显著低于对照组[ProcNatlAcadSciUSA94:14924-9,1997]。糖皮质激素的分子作用机理目前已被阐明，活化的糖皮质激素能自由穿过细胞膜与细胞浆中的糖皮质激素受体(Glucocorticoidreceptor,GR)结合，糖皮质激素受体(GR)在与糖皮质激素(GC)结合后二聚化，招募共激活因子，入核再招募其他转录因子，然后作用于糖皮质激素响应元件(GRresponseelment，GRE)上从而调控靶基因，如能上调糖异生途径的关键酶一磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)基因的表达。研究表明，利用糖皮质激素受体(GR)特异的拮抗剂一RU486能够消除小鼠因高脂肪喂食而导致的胰岛素抵抗症状[Diabetes44:718-720,1995]。因此，发现和设计lip-羟基类固醇脱氢酶1(llp-HSDi)的选择性抑制剂和糖皮质激素受体(GR)的拮抗剂对于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常及高血压等代谢性疾病将具有十分重要的意义。肝X受体a(LiverXreceptora,LXRa)作为一种氧化固醇激活的核受体，参与才几体多种生理活动的调节，包括胆固醇的代谢和转运、脂肪的形成、糖原异生和炎症等过程。在细胞质中，肝X受体a(LXRa)与其配体结合后与维曱酸X受体a(RXRa)形成异源二聚体并招募共激活因子，然后入核并在其他相关转录因子的协助下作用于靶基因的肝X受体(LXR)顺式反应元件(LXRresponseelement,LXRE)从而调控靶基因的转录。动脉粥样硬化(Atherosclerosis)是动脉硬化中最常见而重要的类型，其特点是动脉的内膜有类脂质的沉积，复合糖类的积聚，继而纤维组织增生和4丐沉积，并有动脉中层的病变，该疾病主要涉及大型及中型的肌弹力型动脉，以主动脉、冠状动脉及脑动脉为多见，常导致管腔闭塞或管壁破裂出血等严重后果。血脂异常是动脉粥样硬化的一个重要的危险因素。大量的流行病学研究和临床资料显示，血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平与动脉粥样硬化的发生呈明显负相关。血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)其最主要的作用机制在于参与胆固醇的逆向转运过程(RCT)。Brooks等通过对唐基尔(Tangier)病的研究发现由ATP结合盒转运子1(ATP-binding-cassettetransporter1,ABC1)基因编码的胆固醇流出调节蛋白(cholesterol-effluxregulatoryprotein)在细胞内月旦固醇向高密度脂蛋白(HDL)传送过程中起重要作用。研究表明，LXRoc:RXRa异源二聚体激动剂能够正调控ATP结合盒转运子1禾口载月旨蛋白ApoAl基因的表达[BiochemBiophysResCommun274:794-802，2000],可促进巨噬细胞中胆固醇的外流和肝脏中胆汁酸的合成，并可抑制肠道中胆固醇的吸收[NatGenet22:336-45,1999]。此外，LXRoc:RXRa异源二聚体激动剂还能增强葡萄糖转运子4(Glut4)的表达[JBiolChem278:48283-91，2003],抑制糖异生途径关键酶葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)基因的表达从而降低肝葡萄糖生成[BiochemBiophysResCommun338:981-6，2005]。因此，发现和设计LXRa:RXRa异源二聚体的激动剂对于治疗动脉粥样硬化及其病发症、II型糖尿病及其并发症将具有十分重要的作用。近年来许多抗II型糖尿病药物如过氧化物酶增生因子活化受体Y(PPARy)激动剂、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)抑制剂不断上市并用于临床治疗。然而，单一靶点的药物往往会促使机体产生补偿机制使其逃避药物的攻击从而产生耐药性，再加上II型糖尿病发病机制多样而复杂，靶点繁多，单一性耙点的药物往往难以达到很好的治疗效果。多靶点药物由于其涉及靶点和信号通路多、与单一靶点的结合强度低从而具有低毒、低耐药性等优点[ExpertOpiniononDrugDiscovery2:1-10,2007],因此，开展多耙点药物的研究将是攻克诸如癌症、糖尿病等疑难疾病的重要手段之本发明经随机筛选发现齐墩果酸衍生物3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸是蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPB1)抑制剂、llp-羟基类固醇脱氢酶1(llp-HSDi)抑制剂、糖皮质激素受体(GR)拮抗剂、核受体LXRa:RXRa异源二聚体激动剂，同时还能增强葡萄糖转运子4(Glut4)的表达，整体动物试验表明它具有降血糖活性，是一作用多靶点的抗糖尿病化合物。而8由于蛋白酪氨酸磷酸酶IB(PTPB1)抑制剂[MolCellBiol20:5479-89,2000]、ll卩-轻基类固醇脱氢酶1(11(3-HSDj抑制剂[ProcNatlAcadSdUSA94:14924-9,1997]、糖皮质激素受体(GR)拮抗剂[Diabetes44:718-720,1995]在抵抗肥胖症中的生理功能方面均有报道，因此3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸还具有潜在的抗肥胖症作用。
发明内容本发明的一个目的是提供结构式如下的3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐(例如其二钠盐、二钾盐或二铵盐)。本发明的3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐可通过如下的方法合成在吡啶存在下，齐墩果酸与邻苯二甲酸酐反应，生成3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸。3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸加热溶解在氯化钠(或氯化钾或氯化铵)饱和的80%乙醇溶液中，冷却后慢慢析出3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸二钠盐、二钾盐或二铵盐。本发明的另一目的是提供上述3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病和/或肥胖症的药物中的用途。特別是，所述的糖尿病是由胰岛素抵抗引起的II型糖尿病。本发明的再一目的是公开上述3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐作为蛋白酪氨S交磷酸酶1B抑制剂、llp-轻基类固醇脱氢酶1抑制剂、糖皮质激素受体拮抗剂以及核受体LXRa:RXRa异源二聚体j敫动剂。本发明的又一目的是提供一种用于治疗由胰岛素抵抗31起的糖尿病和/或肥胖症的药物组合物，其包含治疗有效剂量的3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐，并可进一步包含药学上常规辅料。本发明的有益效果本发明设计与合成了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐，其对蛋白酪氨酸磷酸酶1B和11(3-羟基类固醇脱氢酶1(11(3-HSD,)有抑制作用、对糖皮质激素受体(GR)有拮抗作用、对核受体LXRa:RXRa异源二聚体有激动作用，同时还能增强葡萄糖转运子4(Glut4)的表达。整体动物试验表明它具有降血糖活性。3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐可用于治疗由胰岛素抵抗引起的糖尿病、肥胖症及其并发症。3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸合成简单，易于制备，且合成原料丰富、便宜。图1A为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸抑制下PTP1B的酶动力学曲线。■、、A分别代表3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸浓度为0、9nM、12fiM时PTPlB的酶动力学曲线。图1B为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸的Ki值测定。横坐标表示3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸的浓度，纵坐标表示Km值，曲线与横坐标相交点的数值即为Ki值。图2A为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对胰岛素受体(IR)磷酸化的影响，其中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参。图2B为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对蛋白激酶B(AKT)磷酸化的影响，其中GAPDH为内参。图3为11(3-羟基类固醇脱氢酶1(lip-HSD,)蛋白的纯化。泳道1~5表示用500mM咪唑从镍柱上洗脱下来的11(3-HSD,(24-292位氨基酸)，大小约29kDa。图4A为甘草次酸(GA)对lip-HSDi酶活性抑制的浓度依赖性曲线。横坐标为化合物的浓度(M)的-Log值，纵坐标为化合物对11(3-HSD!的抑制率(％)。图4B为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对11P-HSD,酶活性抑制的浓度依赖性曲线。横坐标为化合物的浓度(M)的-Log值，纵坐标为化合物对llp-HSD!的抑制率(％)。图4C为3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸钠盐对lip-HSD,酶活性抑制图。图5为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对GR的拮抗活性。与对照2组比较，*尸<0.05，**尸<0.01。图6为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对LXRa:RXRa异源二聚体的激动活性。与只于照组比4交，*P<0.05,**尸<0.01。图7A为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对Glut4启动子转录活性的影响。图7B为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对3T3-L1脂肪细胞中Glut4mRNA转录水平的影响，与对照组比较，*户<0.05,**P<0.01。图8为3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对3T3-L1脂肪细胞中Glut4蛋白表达水平的影响。ii图9为3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对糖尿病才莫型鼠血糖水平的影响。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。下述制备例中，！H-NMR用VarianMercuryAMX300型仪器测定。所有溶剂在使用前均经过重新蒸馏，所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理获得。除另有说明外，所有反应均是在氩气保护下进行并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水疏酸镁干燥过程。产品的纯化除另有说明外均使用硅胶柱色谱法，所使用的硅胶为200-300目，GF254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。制备实施例3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸的制备将(438mg,1mmol)齐墩果酸溶于(10mL)吡啶中，加入(177mg,L2mmo1)邻苯二甲酸酐，反应过夜，加入(2mol/L)盐酸调节pH到3，用(30mL)乙酸乙酯萃取，用(10mL，2mol/L)盐酸洗涤有机相两次，用(10mL)蒸馏水洗涤一次。将有机相用无水^fu酸钠干燥，减压蒸馏，用硅胶柱层析分离(石油醚乙酸乙酯-10:1V/V)，得到白色粉末状化合物(527mg，0.87mmol)，产率87%。iHNMR(CDCl3,300MHz)(5):7.86(d,1H,/=7.5,苯基氢)，7.68(d,1H,J^7.2,苯基氬)7.56(m，2H，苯基氬)5.27(t,lH,J二3.3，12-CH)，4.72(m，1H，3-CH),2.80(m,1H，18-CH)。13CNMR(CDC13，75.0MHz)(5):38.10(C-l),27.90(C-2)，83.26(C画3),39.49(C-4)，55.59(C-5),18.36(C-6)，32.70(C隱7)，41.67(C-8)，47.72(C-9),37.89(C-10),23.64(C-ll)，122.78(C-12),143.80(C-13)，45.99(C-14),27.86(C陽15)，22.97(C-16),37.97(C-17)，41.74(C-18),46.64(C-19),30.89(C-20)，33.99(C-21)，32.71(C-22)，28.36(C-23),17.02(C-24)，15,65(C-25)，17.41(C-26),26.17(C-27),173.05(C-28),33.29(C-29),23.82(C-30),134.04,132.20，130.85，130.18，129.95，129.06(苯基氬),168.12(苯曱酯的-CO-)，185.23(苯曱酸的-CO-)。试验实施例试验实施例1:3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对PTPIB抑制活性测定实验本发明在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并分离纯化获得人源PTPIB蛋白及其他PTPases如CD45、TCPCP、LAR及PTPa，测试了化合物3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对这些PTPases的抑制活性。实验表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸能显著抑制PTPIB酶活性，并且对其他PTPases具有一定的选择性。1、实l全原理对硝基苯磷酸(p-Nitrophenylphosphate,pNPP)是碱性磷酸酶的可溶性底物，在PTPIB等PTPases的催化下，它脱去一个磷酸^^艮，生成黄色可溶产物一对硝基酚(p-Nitrophenol)，该产物在410nM处有光吸收，在BioRAD酶标仪上4企测410nM处光吸收的变化(每40秒读板一次，读40次)就可以测得PTPIB酶反应的初速度(V0)。2、实验材料1)10xpNPP(50mM):准确称18.5mg的pNPP4分末溶解于1mL双蒸水中配制成50mM的贮存液。2)人源PTPIB蛋白的制备将人源PTPIB(1321位氨基酸)基因序列克隆到pGEX4T-l原核表达栽体上，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，用GST柱纯化得到的PTPIB蛋白，透析、浓缩到约0.5mg/mL。3)PTP1B酶反应用緩冲液140mMNaCl，2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04JJ^pH到7.4。3、化合物抑制活性测定实-验将化合物与PTP1B预先赙育10min。反应体系反应緩冲液(50mMHEPES,pH7.4,100mMNaCl,2mMEDTA)88piL、化合物或DMSO(即二曱基亚石风，作为化合物的溶剂)1]iL和PTPlB(0.5mg/mL)1)iiL。然后往反应体系中加入10xpNPP(50mM)10pL,通过BioRAD酶标仪在410nm处测定OD值，每20s读板一次，读40次，求得反应初速度。所有实验均设定三个重复。抑制率计算公式抑制率(％)=(V,-Vo)/V0xl00(V,为加化合物时酶反应的初速度，VQ为加DMSO时的初速度)^中制率即可获得该化合物对PTP1B酶活性的ICso值。3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对其他PTPases的抑制活性测定方法同PTP1B。注本发明所涉及的实验设计中DMSO(二甲基亚砜，作为化合物溶剂)组均作为阴性对照。4、3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对PTP1B抑制类型的测定本实验选取了3个不同的3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸浓度即0,9,12iiM和5个不同的底物浓度即1,5，10,30,50mM，分别测定了在3个不同抑制剂浓度下不同底物浓度的初速度。然后通过Origin7.0软件进行作图分析来判断3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸的抑制类型。5、实验结果1)化合物抑制活性测定本实验分别测定了3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对PTP1B的抑制活性，其IC5(Tll.8^iM，然后还分别测定了它对PTPases家族中几种酶包括CD45、TCPCP、LAR及PTPa的抑制活性，结果如表1所示，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对LAR和PTPoc没有抑制活性，对CD45和TCPCP具有对PTP1B3倍以上的选择性。表13-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对不同PTPases的抑制活性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注"-"表示化合物浓度在100mM时对该酶没有抑制活性。以上结果表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸在分子水平上能抑制PTP1B的活性，且对其他PTPases具有一定的选择性。2)3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对PTP1B抑制类型的测定本实验选取了3个不同的抑制剂浓度即0，9，12pM和5个不同的底物浓度即1，5，10，30，50mM，分别测定了在3个不同抑制剂浓度下不同底物浓度的初速度。然后通过Origin7.0软件进行分析作图。结果如附图1所示，三条代表不同抑制剂浓度的直线相交于坐标轴Y轴，根据酶动力学理论，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸是PTPlB的竟争性抑制剂，其抑制常数Ki值为16.89|liM。试验实施例2:细胞水平测试化合物3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对胰岛素信号通路的增敏效果本发明测试了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对胰岛素通路的两个信号分子一胰岛素受体(IR)和AKT磷酸化水平的影响，这两个信号分子的磷酸化水平直接反应了胰岛素信号通路的敏感性。1、实-险原理胰岛素和细胞膜上的胰岛素受体结合后，胰岛素受体发生自磷酸化并激活下游信号的传导，随后AKT也被磷酸化而活化，最终激活葡萄糖转运子4(Glut4)，使其转位到细胞膜上进行葡萄糖的运输。PTP1B作为胰岛素通路的负调控因子会将IR去磷酸化，从而抑制胰岛素信号的传递。因此，抑制了PTP1B的活性将会增加IR和AKT的磷酸化水平。2、实验材料1)细胞培养HepG2细胞，用a-MEM培养基(力。10%FBS)在12孔板里培养(培养条件为37°C,5%C02)。2)实验所使用的抗体及使用稀释比例a.—抗:磷酸化胰岛素受体(IR)抗体phospho-IGF-IReceptorbeta(Tyrl135/1136)/InsulinReceptorbeta(Tyr1150/1151)(19H7)(1:1000,CellSignalingtechnology公司)；总月夷岛素受体4元体anti-InsulinReceptorbeta(1:1000，CellSignalingtechnology公司)；磷酸化AKT抗体anti-phospho-AKT(Ser473)(1:1000，CellSignalingtechnology公司)；总AKT抗体anti-AKT(1:1000，CellSignalingtechnology公司)；GAPDH(1:10,000,康城生物)。b.二抗anti-Rabbit(1:5000,Jackson),anti-mouse(1:10,000，AbCam有限公司)。3、胰岛素刺激下的IR和AKT磷酸化水平测试实验HepG2细胞用a-MEM培养基(力。10%FBS)在12孔板里培养，当细胞生长至90~100。/。密度时将培养基换成无血清的oc-MEM进行血清饥饿，同时孵育10~20|aM阳性化合物Compound-2(PTPIB阳性抑制剂，结构式如下所示)或不同浓度的3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或DMSO。化合孵育4h后，将培养基换成含16.7nM胰岛素的无血清a-MEM培养基，胰岛素刺激3min。然后用冰预冷的PBS洗3遍终止刺激，加入SDS样品緩冲液(60pg/孔)裂解细胞，将裂解的细胞收集，进行Westemblot实验检测IR和AKT的磷酸化水平。Compound-2结构式Westernblot主要实验参数实验所使用的抗体比例如实验材料中所述。取上述样品各8pL进行SDS-PAGE,电泳完后，半干法电转2h。电转好的PVDF膜在封闭液中室温封闭30min,再和相应的一抗在4"C孵育过夜。然后，用TBST緩冲液洗膜，5min次，洗3次。吸去TBST,再将PVDF膜和二抗在室温孵育1.5h。接着用TBST緩沖液洗PVDF膜，5min/次，洗3次。最后用辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP,Pierce)显影系统显影。4、实验结果本发明考察了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对胰岛素通路的两个关键效应子一IR和AKT磷酸化水平的影响，如前所述PTP1B能负调控胰岛素信号通路，即能削弱IR及AKT的磷酸化水平，而PTP1B的抑制剂则能逆转该效果。结果如附图2所示，在没有胰岛素刺激时几乎检测不到IR或AKT的磷酸化，胰岛素剌激3min后IR或AKT的磷酸化水平明显增强。PTP1B阳性抑制剂Compound-2能显著地增强胰岛素刺激下IR和AKT的磷酸化水平，3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸作为PTP1B的抑制剂17同样能显著地增强IR和AKT的磷酸化水平，并且具有浓度依赖性。上述研究结果表明，3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸在细胞水平上能显著地增强胰岛素通路的敏感性。试验实施例3:3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对llp-HSDi的抑制活性测定实验本发明通过在大肠杆菌表达并纯化获得人源llp-HSD,，测定了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸和其钠盐对lip-HSDi抑制活性，研究结果表明，该化合物及其钠盐都能抑制llp-HSD,的活性。1、实验原理11(3-HSD,是一种低亲和力的NADP(H)依赖性的氧化还原酶，体外表达纯化获得的11(3-HSD,主要表现为氧化活性。在NADP+的存在时，Cortisol在llp-HSD！的催化下其Cll位羟基被氧化成酮基，而NADP+则因此被还原生成NADPH，后者在340nm处有光吸收，在TECAN酶标仪上;f全测340nm处光吸收的变化(每分钟读一次，读40次)就可以计算得到llp-HSD!的反应初速度(Vo)。2、3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸及其钠盐对llp-HSD,的抑制活性测定实验1)lip-HSD！的表达和纯化将人源lip-HSD,(aa24292)DNA序列克隆到pET28a原核表达载体中，将重组质粒pET28a—ll卩-HSD,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在20。C，0.1mM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG),0.25mM皮质酮的条件下诱导表达3h，收集菌体并置于-80。C冻存lh以上。取一管菌体沉淀(0.5L)加入10~15mL裂解緩沖液(30mMCHAPS,50mMTris-HCl,150mMNaCl，3mg/mL溶菌酶，pH8.6)，充分悬浮后，室温搅拌0.5~1h。超声30s，13,000rpm,30min，取上清液于Ni柱结合4小时。洗脱让柱子中的溶液自由穿过后，用含40mM咪唑的洗脱緩冲液(+4mMCHAPS，pH8.0)洗脱10个柱体积，含60mM咪唑的洗脱緩冲液(+4mMCHAPS，pH8.0)，最后用20mL含500mM咪唑的洗脱緩冲液(+4mMCHAPS,pH8.0)洗脱得到目的蛋白。将该蛋白透析到500mL透析緩冲液(20mMTris,500mMNaCl,4mMCHAPS)中，3小时换:液一次，共三次。将蛋白浓度浓缩到0.5mg/mL以上，100pL每管分装，-80。C保存。2)化合物抑制活性测定实验将3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸、3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸二钠盐或DMSO与11(3-HSD,在反应緩沖液(50mMTris,150mMNaCl,0.5mMEDTA,0.01%Brij35，NADP+)中预先孵育lOmin,然后加入终浓度为180|uM的Cortisol启动反应。通过TECAN酶标仪测定获得反应初速度。抑制率计算公式抑制率(%)=(V广Vo)/V0xl00。(Vi为加化合物时酶反应的初速度，V。为加DMSO时的初速度)llp-HSD,的ICso值。本实验以llp-HSD,的抑制剂甘草次酸(Glycyrrhetinicacid,GA).为阳性化合物。3、实验结果1)lip-HSD!的表达和纯化11(3-HSDi是一个结合在内质网膜上的跨膜蛋白，其全长很难通过原核表达纯化获得，本发明在大肠杆菌中表达并通过镍柱亲和层析的方法纯化获得了截短型的11P-HSD,蛋白(24292位氨基酸，即不包含跨膜区)，通过SDS-PAGE电泳检测结果如附图3所示，所获得的11P-HSD,约29kDa，纯度相对專交高。2)3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸及其钠盐抑制活性测定实验为了验证所建立的酶活测定平台的正确性，本发明首先测定了阳性化合物GA对11(3-HSD!的抑制活性，测得IQo-12.1nM,与文献报道的3040nM相近，表明所建立的酶活系统正确可信。基于该平台，本发明测定了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对lip-HSDt的抑制活性，测得IQo=9.78|uM。同时，进一步了检测3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸二钠盐对11P-HSD,的抑制活性，结果表明其钠盐也具有抑制活性(附图4)。上述结果表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸及其钠盐在酶活水平上能抑制11(3-HSDi的活性。试验实施例4:3-(2-氣基苯曱酰基)-齐墩果酸对糖皮质激素受体(GR)的拮抗活性测定实验本发明采用糖皮质激素受体反应元件(GRE)调控的荧光素酶(luciferase)报告基因检测的方法测定了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对GR的拮抗活性。结果表明3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸能浓度依赖性地拮抗GR活性。1、实—险原理在细胞质中，GR与糖皮质激素结合后会招募共激活因子，并二聚化形成同源二聚体，后者入核后在其他相关转录因子的协助下作用于靶基因的糖皮质激素受体反应元件(GRE)上从而调控靶基因的转录。将含有两个GRE共有基序的DNA序列(5，-TGTACAGGATGTTCTCTCTGCCTCTGCTGTACAGGATGTTCT-3，)克隆到pGL3-启动子载体中获得重组载体pGL3-GRE-Luc,在该重组载体中，萤火虫荧光素酶基因(luciferase报告基因)的转录只受到反应元件GRE的控制。因此，愛火虫焚光素酶的活性就相当于GR的反式激活活性。在该系统中，共转pRL-SV40质粒，荧光素酶在SV40强启动子的控制下进行表达，然后测定该荧光素酶的活性作为内参，以此来消除由于转染效率不同而带来的误差。2、实验材料与方法1)细胞培养HEK-293细胞在DMEM培养基(10%FBS)里培养(培养条件为37°C，5%C02)。2)瞬时转染及GRE调控的荧光素酶报告基因的测定脂质体转染法参照Invitrogen公司Lipo2000试剂说明书进行。HEK-293细胞种在24孔板上，当细胞生长至50~70%密度时，瞬时共转染pGL3-GRE-Luc和GR真核表达质粒pEGFP-GR及内参质粒pRL-SV40,转染12小时后将培养基换成DMEM(10%FBS)，同时加化合物孵育，18小时后吸去培养基，PBS洗一次，用Luciferase试剂盒(Promega)裂解细胞并测定萤火虫荧光素酶和内参荧光素酶的活性(Luciferase测定方法参照Promega公司Luciferase试剂盒i兌明书进4亍)。3、实验结果地塞米松(Dex)是人工合成的GR配体，与GR结合后能引起后者构象变化，招募共激活因子并入核促进在启动子中具有GRE序列的基因的表达。Ru486是GR的拮抗剂，能阻止Dex等GR的配体与GR结合。本发明利用GRE调控的荧光素酶报告基因测定的方法，在HEK-293细胞中测定了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对GR的拮抗活性。结果如附图5所示，Dex(0.1)iiM)能激动GR的反式激活活性，激动活性约4倍。而Ru486(lpM)能强烈抑制Dex的效应。3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸也能浓度依赖地拮抗Dex的激动效果，且在浓度为lOpM时拮抗活性较显著。上述结果表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸能拮抗GR的反式激活活性，表现为GR的拮抗剂。试验实施例5:3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对核受体LXRa:RXRot异源二聚体的激动活性测定实验本发明在细胞水平上通过LXR顺式反应元件(LXRE)调控的荧光素酶报告基因测定的方法测试了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对LXRoc:RXRa异源二聚体的反式激活活性。研究结果表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸具有浓度依赖性地激动LXRa:RXRa异源二聚体的反式激活活性。1、实验原理在细胞质中，LXRa与RXRa形成异源二聚体并招募共激活因子，然后入核在其他相关转录因子的协助下作用于耙基因的LXRE上从而启动该基因的转录。将LXRE克隆到pGL3-启动子载体中构建重组载体pGL3-LXRE-Luc,在该重组载体中，萤火虫荧光素酶基因的转录只受到反应元件LXRE的控制。因此，萤火虫荧光素酶的活性就相当于LXRot:RXRoc的反式激活活性。将pCDNA3.1-LXRa，pCDNA3.1-RXRa,pGL3-LXRE-Luc及内参质粒pRL-SV40共转染到细胞中，通过分别测定萤火虫荧光素酶及内参荧光素酶活性，二者的比值即表征LXRa:RXRa的反式激活活性。2、实验材料与方法1)细胞培养HEK-293细胞的培养条件同试验实施例4。2)瞬时转染及LXR顺式反应元件调控的荧光素酶报告基因测定脂地塞米^f^结构式Ru486结构式质体转染法参照Invitrogen公司Lipo2000试剂-说明书进^亍。HEK-293细胞种在24孔板上，当细胞生长至50~70°/。密度时，利用脂质体瞬时共转染pGL3-LXRE-Luc、pCDNA3.1-LXRot、pCDNA3.1-RXRot及内参质粒pRL-SV40，转染12小时后将培养基换液成DMEM(10%FBS),同时加化合物孵育18小时，吸去培养基，PBS洗一次，用Luciferase试剂盒(Promega)裂解细胞并测定萤火虫荧光素酶和内参焚光素酶的活性(Luciferase测定方法参照Promega乂〉司Luciferase试剂盒i兌明书进4亍)。本实验以T0901317(LXR配体)为阳性化合物。oh3、实验结果TO901317是肝X受体(LXRa)的配体，当其与LXRa结合后能促使后者招募共激活因子并与RXRa形成异源二聚体，该异源二聚体入核后作用于LXRE上，从而促进在启动子中具有LXRE序列的基因的表达。本发明利用LXR顺式反应元件调控的荧光素酶报告基因测定的方法测定了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对LXRa:RXRoc异源二聚体的激动活性。结果如附图6所示，TO901317(1iliM)对LXRa:RXRa具有近2.5倍的激动活性，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸能浓度依赖性地激动LXRa:RXRa反式激活活性，表现为LXRa:RXRa异源二聚体的激动剂。试验实施例6:3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸对葡萄糖转运子4(Glut4)表达水平调控的实验23本发明通过Glut4启动子调控的焚光素酶(luciferase)报告基因测定、实时荧光定量PCR法和Westernblot等实验技术测试了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对Glut4表达水平的影响，结果表明3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸能增加Glut4的mRNA和蛋白表达水平。1、实-验原理葡萄糖转运子4(Glut4)主要分布于胰岛素应答组织如月几肉和脂肪组织，它在机体细胞进行葡萄糖吸收维持血糖平tf中起着关4建的作用。研究表明，Glut4基因敲除的杂合子Glut4(+/-)老鼠显示胰岛素抵抗综合症的表现，而重新引入Glut4可以恢复整体胰岛素的活性。1)Glut4启动子调控的荧光素酶报告基因的测定启动子是基因的一个组成部分，它控制着基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。将Glut4基因的启动子区克隆到pGL3-basic载体中，构建pGL3-Glut4启动子-luc重组载体，在该重组载体中，萤火虫荧光素酶基因的转录只受到Glut4启动子的控制，因此劳火虫荧光素酶的活性就直接反映Glut4基因的表达水平。2)实时荧光定量PCR法实验mRNA水平是一个基因转录水平的直接反映。将细胞总mRNA抽提出来并反转录成第一链cDNA，以此为才莫板，通过实时荧光定量PCR可以对模板水平进行定量分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。在荧光信号指数扩增阶段任意位置上设定一个阈值，然后根据每个反应管内的荧光信号到达该设定的阈值时所经历的循环数即CT值(thresholdvalue,阈值)来表征模板水平。3)Westernblot实验在脂肪细胞中存在Glut4蛋白的表达。分化3T3-L1细胞在用化合物处理24小时后，用冰预冷的PBS洗3遍，加入SDS样品緩冲液(60iag/孔)裂解细胞，将裂解的细胞收集，用Glut4抗体检测Glut4蛋白的表达水平，3-磷酸甘油醛脱氬酶(GAPDH)作为看家基因其表达水平不受化合物的影响，以此为内参可以消除系统误差。2、实验材料与方法1)细胞培养HEK-293细胞的培养条件同试验实施例4。2)瞬时转染及Glut4启动子调控的焚光素酶报告基因的测定HEK-293细胞用DMEM培养基(10%FBS)在24孔板里培养(培养条件为37。C,5%(:02)，当细胞生长至50~70%密度时，换成无血清DMEM培养基，利用脂质体法共转染pGL3-Glut4启动子-luc(0.2pg/孔)和内参pRL-SV40(0.05pg/孔)质粒，转染12小时后将培养基换液成DMEM(10%FBS),同时加化合物孵育18小时，吸去培养基，PBS洗一次，用Luciferase试剂盒(Promega)裂解细胞并测定萤火虫荧光素酶和内参荧光素酶的活性(Luciferase测定方法参照Promega公司Luciferase试剂盒说明书进行)。本实验以T0901317(LXR配体)为阳性化合物。3)3T3-L1细胞的培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细〗包用DMEM(10%FBS)培养在6孔板中，生长至100°/。密度后继续培养2天，培养液换成含10%FBS的DMEM并加入1昭/mL胰岛素(insulin),0.5mM异丁曱基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine,MIX)和1pM地塞米松(dexamethasone，Dex)(Sigma)，诱导3天，在第4天将撤去MIX和Dex，用含10%FBS，1jig/mLinsulin的DMEM继续诱导3天，在第7天换成DMEM(10%FBS)培养，此后每2天换液一次。在分化第8天卵孚育化合物，孵育24小时后进行总RNA的抽提或Westernblot检测Glut4mRNA或蛋白表达水平。4)总mRNA抽提及实时荧光定量PCR法用TRIZOL法抽提分化25的3T3-L1细胞总RNA(参照Promega试剂盒说明书)，第一链cDNA合成依照上海捷瑞/>司反转录试剂盒说明书进行。以此cDNA为才莫板，通过实时荧光定量PCR，以GAPDH为内参可以对才莫板水平进4亍定量分析。RT-PCR中所用的引物序列引物名称退火温度(。C)引物序列Glut4655，-gaacagagctacaatgcaacgtggctgggtaggca-3，(正向)5，-tccaagaatgagtatctcataggaggccgcg-3，(反向)GAPDH655'-ccactcacggcaaattcaacggca-3'(正向)5'-tccaggcggcacgtcagatccacg-3(反向)5)Westernblot实验主要参数一抗Glut4抗体(1:1,000,SantaCruz公司)，GAPDH(1:10,000,康城生物)；二抗anti-Rabbit(1:5,000，Jackson公司)，anti-mouse(1:10,000，AbCam有限公司)。3、实验结果研究表明，在脂肪细胞中Glut4基因的表达受LXR的调控，人们在Glut4的启动子中发现有LXR顺式作用元件(LXRE)的存在。TO901317作为LXR的配体能促进脂肪细胞中Glut4蛋白的表达(l)。本发明首先通过Glut4启动子调控的荧光素酶报告基因测定的方法分析了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对Glut4启动子的激动活性，结果如图7A所示，与对照DMSO处理组相比，TO901317(5pM)对Ghit4启动子具有约3倍的激动活性，而3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸的激动活性比TO901317更显著，并且具有浓度依赖性。然后，本发明还通过实时荧光定量PCR的方法测定了Glut4mRNA的转录水平，结果如图7B所示，TO901317(5(iM)能1.5倍地激动3T3-L1脂肪细胞中Glut4mRNA的转录水平，而相比而言，3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸的激动效果显然更强，并且具有浓度依赖性。为了进一步说明3-(2-羧基笨曱酰基)-齐墩果酸对Glut4蛋白表达水平上的激动活性，最后本发明还通过Westernblot的方法进行了考察。结果与上述两种测定方法的结果一致(如附图8所示)，即3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸能浓度依赖性地激动Glut4蛋白的表达水平。,上述研究结果表明，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对脂肪细胞中负责葡萄糖转运的关键效应子一Glut4的表达水平具有明显的增强效果。试验实施例7:3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸抗糖尿病动物模型实验方法及结果本发明通过测定腹腔注射3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸后II型糖尿病模型鼠的空腹血糖水平、测试了3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对II型糖尿病模型鼠血糖的影响，结果表明3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸具有良好的降血糖作用，并具有浓度依赖性。1、实-险原理链脲佐菌素(STZ)是一种抗菌及抗肺瘤药物，可以对某些种属的动物(狗、兔、猴、大鼠、小鼠等)胰岛卩细胞选择性破坏，而产生糖尿病。STZ由于其本身含有的葡萄糖部分结构而被胰岛p细胞上低亲和力的葡萄糖转运蛋白(GLUT2)转运，可以特异性地作用于胰岛(3细胞并引起其结构破坏和胰岛素分泌功能障碍。外源性胰岛素抑制GLUT2和(3细胞内胰岛素的表达，可以阻止STZ的致糖尿病效果。其对内脏毒性相对较小，成活率较高，是目前国内外使用较多的一种制备糖尿病动物模型的方法。一般认为，大剂量(40~90mg/kg)的STZ腹腔或静脉可直接破坏胰岛卩细胞，多次小剂量(15mg/kg)注射STZ可能是通过免疫机制使卩细胞不断破坏而致糖尿病，与T淋巴细胞介导的p细胞不断破坏有关。2、材料与方法1)实验动物3周龄雄性SPF级C57BL6小鼠40只，购自中国科学院上海实验动物中心，体重10士2g。动物随机分为正常组、模型组、溶剂组、2.5、5mg/kg組，每组8只。2)II型糖尿病模型的建立高脂飼料饲养4周后，链脲佐菌素(STZ,100mg/kg)腹腔注射1次。继续高脂伺料喂养3周，期间监测血糖值若干次，共7周。正常组不造模，仅喂食普通饲料，自由饮水。3)3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸抗II型糖尿病的研究正常组不给药；溶剂组腹腔注射2.5%Tween80;其它组均腹腔注射溶于2.5°/。Tween80溶剂中的相应药物。给药4周后，采用血糖仪(罗氏、Accu-CHEKActive)监测空腹12小时后的血糖值。3、实验结果血糖水平降低是治疗II型糖尿病的生化指标之一，通过^^金测3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸对II型糖尿病模型鼠的血糖水平影响来评价该化合物的抗II型糖尿病的活性、结果如附图9所示，3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸具有良好的降血糖作用，并具有浓度依赖性。说明该化合物对II型糖尿病有一定的治疗作用，同时具有潜在的治疗肥胖症作用。权利要求1、结构式如下的3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐2、根据权利要求1所述的3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐，其特征是，所述的盐为3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸二钠盐、二钾盐或二铵盐。3、权利要求1或2所述的3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病和/或肥胖症的药物中的用途。4、如权利要求3所述的用途，其特征是，所述的糖尿病是由胰岛素抵抗引起的II型糖尿病。5、如权利要求3所述的用途，其特征是，所述3-(2-羧基苯曱酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐作为蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂、11(3-羟基类固醇脱氢酶1抑制剂、糖皮质激素受体拮抗剂以及核受体LXRot:RXRoc异源二聚体激动剂。6、一种用于治疗由胰岛素抵抗引起的糖尿病和/或肥胖症的药物组合物，其特征在于，包含治疗有效剂量的权利要求1或2所述的3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐，并可进一步包含药学上常规辅料。全文摘要本发明公开了3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐、其用途以及包含该化合物的药物组合物。该化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)和11β-羟基类固醇脱氢酶1(11β-HSD₁)有抑制作用、对糖皮质激素受体(GR)有拮抗作用、对核受体LXRα:RXRα异源二聚体有激动作用，同时还能增强葡萄糖转运子4(Glut4)的表达。整体动物试验表明它具有降血糖活性。因此，3-(2-羧基苯甲酰基)-齐墩果酸或其生理上可接受的盐可用于治疗由胰岛素抵抗引起的糖尿病、肥胖症及其并发症。文档编号A61K31/56GK101525366SQ20081003434公开日2009年9月9日申请日期2008年3月6日优先权日2008年3月6日发明者林忠辉,旭沈,胡立宏,蒋华良,静陈申请人:中国科学院上海药物研究所