专利名称：γ-聚谷氨酸-铬复合物、制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Y-聚谷氨酸-铬复合物，并提供该复合物的制备方法，以及 该复合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
糖尿病是一种有遗传倾向的内分泌疾病,主要是由胰岛素分泌绝对或相对不 足引起的碳水化合物、脂肪、蛋白质、水及电解质的代谢紊乱。糖尿病按病理特性可分为i型和n型。i型通常采用外源补充胰岛素治疗；而对于n型目前尚缺乏有效的治疗手段。而且目前经典的治疗方法都不尽如人意，如I型糖尿病用胰岛素注射治疗增加了患者的痛苦，n型糖尿病所用的合成药，长期使用有一定的毒 副反应。因此寻找高效、低毒、价廉的抗糖尿病药物一直是医药工作者研究的热 占。研究表明,糖尿病患者铬明显降低，铬水平与血糖呈负相关。铬作为人类所 必需的微量元素,其所起的生理作用多限于0"3+。 &3+与烟酸、甘氨酸、谷氨酸等 形成八面体配合物——葡萄糖耐量因子。同时在体内铬通过协助胰岛素A链上的 硫基与细胞膜上胰岛素受体的硫基形成二硫键而促使胰岛素发挥作用。此外，铬可激活琥珀酸脱氢酶，加速糖氧化而促进糖代谢,这些研究均表明人体铬缺乏和n 型糖尿病密切相关。但无机铬化合物的脂溶性小、生物利用度低、活性不高、所 需剂量大，并常伴有胃肠道不适、恶心、呕吐、腹泻等副作用,为了减少副作用 和促进铬化合物的吸收，铬的有机配合物受到广泛关注，有机铬化合物的降血糖 作用一般高于无机格化合物,脂溶性高，细胞渗透力强，且无明显的消化道副作 用,因此利用有机铬作为新的铬源降低血糖,为治疗糖尿病开辟了新的领域。国内 外一系列研究结果表明，&3+的安全性完全依赖于配体的性质，因此选择合适的载体是铬发挥作用的关键。而他们选择的配体主要包括:(l)生物小分子氨基酸及 其衍生物(2)低毒的有机羧酸类(3)含杂原子三角架型有机化合物。但这些配体分 子量都较小，进入体内后缓释作用不显著，此外有机羧酸类还存在一定的毒性。发明内容本发明的目的之一在于提供一种新的毒性小、降血糖作用时间长、药效高， 聚谷氨酸-铬复合物。本发明的目的之二在于提供该Y-聚谷氨酸-铬复合物的一种制备简单、成本低廉的制备方法。本发明的目的之三在于提供该Y-聚谷氨酸-铬复合物制备治疗糖尿病药物中 的应用。本发明提供的Y-聚谷氨酸—铬复合物，其通式可表示为 Cr3+m— ( PGA)其中m是正整数，且400Sn^2000，表示铬数目；？聚谷氨酸分子量介于 20kD 2000kD。本发明提供的Y-聚谷氨酸一铬复合物，可以通过以下方法和步骤制备将？ 聚谷氨酸与六水氯化铬溶液混合搅拌，其特征在于Y-聚谷氨酸羧基摩尔数与六水氯化铬摩尔数的比值介于20: 1 1: 1之间，在2(TC 70'C温度条件下反应1小时 5小时；经透析、冷冻、干燥，即得产物Y-聚谷氨酸一铬复合物。一、 Cr-Y-PGA复合物表观特征采用傅里叶红外光谱仪测试，扫描范围400 4000cm。样品采用KBr压片 溶液法涂膜制样，扫描获得红外光谱；及全波长扫描仪判断化合物结合键。二、 Cr-y-PGA复合物生物活性1. 降血糖活性采用雄性健康昆明鼠，尾静脉注射70mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天 后禁食12h，血糖〉llmmol/L者，确认为成模鼠。选取20只体重为25g左右的 按上述方法制成的DM小鼠，禁食12h测血糖，综合考察初始血糖和体重平均 分成4组，分别设为正常生理盐水对照组,糖尿病模型生理盐水对照组,CrCl3.6H20 和C,卞PGA组。给药小鼠灌胃剂量为C,150ug/kg/day，生理盐水对照组灌服 相应体积生理盐水。给药四周，每天记录饮水情况，观察形态变化,隔天禁食12h 测血糖。2. 糖耐量检测采用2.1中相同制模方法和给药治疗过程,给药四周，停止给药当晚禁食过夜 (12h)，按lg/kg体重灌服50%葡萄糖溶液，用血糖仪测定Omin、 15min、 30min、 60min和120h的血糖值。 3.2-脱氧核糖损伤检测采用吡啶羧酸铬作为实验组对照，铬复合物在体外形成羟自由基的能力可以 用Gutteridge等人的方法进行评估。将样品与2-脱氧核糖(4mmol/L)、维生素 C(100咖ol/L)、过氧化氢(100翻1/L)、磷酸钾缓冲液(1Ommol/L)混匀37°C 孕育30min，加入2.8。/。(w/v)三氯醋酸，9(TC加热10min，迅速冷却。样品所形 成的色原体的量在532nm波长下进行检测。4. 3T3-脂肪细胞的葡萄糖转运效果 采用诱导前3T3-脂肪细胞96孔板含血清F12培养基抚育12h,然后无血清F12培养基饥饿12h.将样品Cr个PGA混合物20ul(Ci^+0.1umol)与胰岛素(INS)10ug/ml—同加入含细胞培养基,抚育12h,采用葡萄糖检测试剂盒检测细胞液含糖量.由以上研究发现本发明提供的？聚谷氨酸一铬复合物可以用于制备治疗糖 尿病药物。本发明在前期工作的基础上，应用生物发酵的方法获得药物载体——Y聚谷 氨酸(PGA)，来克服现有载体上述的不足，利用Y-PGA上的羧基与六水氯化络 再一定条件下生成Cr-O离子键，形成Cr-，PGA复合物。这种产物以Y-PGA为载体， 其分子量比目前常用配体大，能更好的起到缓释作用，且生物相容性好，无毒。 该复合物进入体内后可以缓慢释放出药物，而同时？PGA则可被溶酶体降解为内 源性谷氨酸,降解产物没有毒性。Cr-"PGA复合物的生物利用度也比游离药物要 高，所需剂量小；而且毒性副作用降低；此外其成本低廉。本发明的Cr- PGA 复合物与现有铬复合物相比，毒性小、降血糖作用时间长、药效高、成本低廉。
图1为Cr-Y-PGA复合物远红外光谱谱图。图2为Cr-Y-PGA复合物对糖尿病模型小鼠血糖的影响。图3为Cr-y-PGA复合物对糖尿病模型小鼠口服糖耐量的影响。图4为Cr-Y-PGA复合物对2-脱氧核糖的影响。图5为Cr- PGA复合物对3T3脂肪细胞促胰岛素利用的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不限于以下实施例.-实施例l Cr-，PGA制备方法一称取0.75g的y-PGA (微生物发酵所得，下同)溶于80mldH2O，室温搅拌； 称取1.5g的CrCl3.6H20溶于20mldH2O，室温搅拌至完全溶解；将CrCl3.6H20 溶液边搅拌边缓慢加入Y-PGA溶液(-COOH与Ci^摩尔数比约1:1)，搅拌反应 2h，反应温度25'C ，以蒸馏水为透析液反复透析，期间多次更换透析液。透析 时间48小时，冷冻干燥所得即产物。实施例2 Cr- PGA制备方法二称取0.75g的？PGA溶于80mldH2O，室温搅拌；称取500mg的CrCl3.6H20 溶于20mldH2O，室温搅拌至完全溶解；将CrCl3.6H20溶液边搅拌边缓慢加入 Y-PGA溶液(-COOH与C一+摩尔数比约5:1)，搅拌反应lh，反应温度20' C ， 以蒸馏水为透析液反复透析，期间多次更换透析液。透析时间48小时，冷冻干 燥所得即产物。实施例3 Cr-，PGA制备方法三称取0.75g的y-PGA溶于80mldH2O，室温搅拌；称取lOOmg的CrCl3.6H20 溶于20mldH2O，室温搅拌至完全溶解；将CrCl3.6H20溶液边搅拌边缓慢加入 Y-PGA溶液(-COOH与Cr"摩尔数比约20:l)，搅拌反应5h，反应温度70。 C ， 以蒸馏水为透析液反复透析，期间多次更换透析液。透析时间48小时，冷冻干 燥所得即产物。实施例4 Cr- PGA表征将上诉所得产物，采用红外光谱仪,全波长扫描仪判断化合物结合键. 结果说明:在红外668.92nm形成新的键，同时发生红移现象.证明Cr与聚谷氨 酸羧基间形成新键，是形成了新的复合物。 实施例5 Cr-Y-PGA复合物Cr含量测定称取0.75g的y-PGA溶于80mldH2O，室温搅拌；称取lOOmg的CrCl3.6H20 溶于20mldH2O，室温搅拌至完全溶解；将CrCl3.6H20溶液边搅拌边缓慢加入 Y-PGA溶液(-COOH与&3+摩尔数比约20:1 )，搅拌反应2h，反应温度20。 C ， 以蒸馏水为透析液反复透析，期间多次更换透析液。透析时间48小时完全后， 采用ICP定量复合物中的Cr的含量，测定得出y-PGA与CrCl3.6H20结合比率， 推断出Cr3+m— (Y-PGA)中m值为400。称取0.75g的y-PGA溶于80mldH2O，室温搅拌；称取500mg的CrCl3.6H20 溶于20mldH2O，室温搅拌至完全溶解；将CrCl3.6H20溶液边搅拌边缓慢加入 Y-PGA溶液(-COOH与&3+摩尔数比约5:1 ),搅拌反应2h，反应温度35。 C , 以蒸馏水为透析液反复透析，期间多次更换透析液。透析时间48小时完全后， 采用ICP定量复合物中的Cr的含量，测定得出？PGA与CrCl3.6H20结合比率， 推断出Cr3+m— (Y-PGA)中m值为1200。实施例6 Cr-y-PGA对糖尿病鼠血糖、饮水的影响采用雄性健康昆明鼠，尾静脉注射70mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天 后禁食12h，血糖Mlmmol/L者，确认为成模鼠。选取20只体重为25g左右的 按上述方法制成的DM小鼠，禁食12h测血糖，综合考察初始血糖和体重平均 分成分别设为正常生理盐水对照组,糖尿病模型生理盐水对照组,CrCl3.6H20和 Cr^-Y-PGA组。给药小鼠灌胃剂量为Cr3+150ug/kg/day，生理盐水对照组灌服相 应体积生理盐水。给药四周，隔天禁食12h测血糖。结果说明在一定剂量的药物作用下，Cr-Y-PGA具有明显的降血糖和改善 糖尿病症状的功能。实施例7 Cr-y-PGA对糖尿病模型小鼠葡萄糖耐量的影响才用实施例3中相同制模方法和给药治疗过程,给药四周，停止给药当晚禁 食过夜(12h)，按lg/kg体重灌服50。/。葡萄糖溶液，用血糖仪测定Omin、 15min、30min、 60min和120h的血糖值。结果说明对实验结果进行统计处理，给药后糖尿病鼠口服糖耐量明显提高实施例8 Cr-Y-PGA和吡啶甲酸铬对2-脱氧核糖损伤作用的比较采用吡啶羧酸铬作为实验组对照，铬复合物在体外形成羟自由基的能力可 以用Gutteridge等人的方法进行评估。将样品与2-脱氧核糖(4mmol/L)、维生 素C(100umol/L)、过氧化氢(100umol/L)、磷酸钾缓冲液(10mmol/L)混匀37°C 孕育30min，加入2.8。/。(w/v)三氯醋酸，9(TC加热10min，迅速冷却。样品所形 成的色原体的量在532nm波长下进行检测。结果说明:对实验结果统计,Cr-，PGA对2-脱氧核糖无统计意义上的损伤.实施例9 Cr-，PGA对3T3-脂肪细胞的葡萄糖转运效果.釆用诱导前3T3-脂肪细胞96孔板含血清F12培养基抚育12h,然后无血清F12 培养基饥饿12h.将样品Cr- PGA混合物20ul(C一+0.1umol)与胰岛素(INS) 10ug/ml—同加入含细胞培养基,抚育12h,采用葡萄糖检测试剂盒检测细胞液含糖结果说明Cr-Y-PGA能大幅度提高3T3-脂肪细胞细胞的葡萄糖转运能力。权利要求
1.一种γ-聚谷氨酸-铬复合物，其特征在于通式为 Cr3+m-(γ-PGA)其中m是正整数，且400≤m≤2000，γ-PGA分子量介于20kD～2000kD之间。
2. 如权利要求l所述的Y-聚谷氨酸一铬复合物的制备方法，其特征在于将聚谷氨酸与六水氯化铬溶液混合搅拌，其中聚谷氨酸羧基摩尔数与六水氯化铬摩尔数的比值介于20: 1 1: 1之间，在20。C 70。C温度条件下反应1小时 5小时；经透析、冷冻、干燥，即得产物Y-聚谷氨酸一铬复合物。
3. 如权利要求1所述的聚谷氨酸一铬复合物在制备治疗糖尿病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种γ-聚谷氨酸-铬复合物，并提供该复合物的制备方法，以及该复合物在制备治疗糖尿病的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明提供的γ-聚谷氨酸—铬复合物，其通式可表示为Cr<sup>3+</sup>m-(γ-PGA)，将γ-聚谷氨酸与六水氯化铬溶液混合搅拌，经透析、冷冻、干燥，即得产物γ-聚谷氨酸—铬复合物。由于分子量比目前常用配体大，与现有铬复合物相比，毒性小、降血糖作用时间长、药效高、成本低廉。
文档编号A61K31/74GK101250261SQ20081003519
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月26日 优先权日2008年3月26日
发明者何成良, 震 冯, 吴自荣, 燕 杨, 洋 汪, 薛晓敏, 静 黄 申请人:华东师范大学