专利名称：一氧化碳释放物质在制备治疗脓毒症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一氧化碳释放物质的新用途，具体的说，涉及二氯甲 烷在治疗脓毒症中的应用。
背景技术：
脓毒症是严重创伤、休克及感染后常见的并发症，进一步发展可导致脓 毒性休克、多器官功能障碍综合征，即便在基础与临床医学研究及重症监 护手段高度发展的现代，临床治疗仍然收效甚微，死亡率居高不下。研究 表明，严重脓毒症后重要脏器功能衰竭，特别是多脏器功能衰竭的死亡率 很高。多脏器功能衰竭一旦发生，现有治疗措施很难使之逆转，因此预防
或减轻脓毒症早期的脏器损害、有效控制炎症反应、预防SIRS的发生尤显 重要。
另外，严重创伤早期即可导致肺组织内白细胞大量激活，产生过量的 炎症介质而引起组织损伤。研究证实脓毒症后脏器微血管通透性明显增高， 中性粒细胞在组织中的浸润明显增加。当中性粒细胞到达组织细胞周围后 可通过释放氧自由基、胶原酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶、蛋白水解酶及 脂类代谢产物等造成微血管通透性的增高和组织细胞的损伤。预防脓毒症 后早期组织白细胞扣留和过度活化，减少氧化代谢产物和大量炎性物质、 蛋白酶等毒性物质的释放是防治局部组织损伤和SIRS发生的关键途径。治 疗方法的改进，抗生素的更新，如清除或拮抗内毒素治疗、保护肝脏网状 内皮系统的吞噬和清除功能、供给肝细胞支链氨基酸，保持良好的肝肠血 液循环、杀菌性通透性增强蛋白质、抗内毒素抗血清或抗体、拮抗细胞因
子的治疗等，但脓毒症休克的病死率并无明显下降。由于脓毒症的病理过 程极其复杂，只有致力于阐明其确切的病理生理机制，寻找新的、有效的 治疗靶点，才有希望逐步解决目前临床脓毒症防治的重重困难。业已证明， 内源性一氧化碳对脓毒症时炎症介质和细胞因子的释放具有有效的抑止作 用,从而可有效保护细胞、维持器官功能。作为体内一种重要的化学气体信
使， 一氧化碳能与可溶性鸟苷酸环化酶结合，并将其激活，使GTP变成 cGMP。升高的cGMP再刺激依赖cGMP的蛋白激酶、磷酸酶或通过调节离 子通道，从而介导一系列生物学变化。在动物实验中发现吸入低浓度一氧 化碳后，血管内皮细胞和小肠内皮细胞内sGC/cGMP途径被激活，引起早 期抗凋亡分子Bcl-2上调，凋亡前信号Bax下调。我们的早期研究也发现一 氧化碳在血管内皮细胞和胰岛细胞缺氧复氧过程中也是通过激活 sGC/cGMP途径发挥抗凋亡作用。而外源性一氧化碳干预脓毒症的研究较 少，主要是由于外源性一氧化碳的给予方式及浓度控制比较困难，不利于 长期观察实验结果。
二氯甲烷(Methylene chloride),又名dichloromethane,可以是粉末状固 体，也可以制成无色液体。人体吸收途径有经皮肤、胃肠道、吸入等。二 氯甲烷经肠道吸收比较充分，吸收后可在体内代谢，主要在肝脏分解，持 续性产生一氧化碳、二氧化碳等产物，其中一氧化碳约25—34%， 二氧化 碳70%，及极少量的HCHO，HCOOH等。二氯甲烷的代谢途径主要有两条 一是细胞色素P450代谢途径， 一是谷胱甘肽代谢途径。 一个重要的特点是， 二氯甲垸代谢所产生的一氧化碳其半衰期较长，可达13小时(因二氯甲烷 持续产生一氧化碳所致)。代谢产物一氧化碳和二氧化碳主要经由肺部排 出。
二氯甲烷毒理学
急性毒性LD50: 1600 2000mg/kg (大鼠经口)； LC50: 56.2g/m3， 8 小时(小鼠吸入)；小鼠吸入67.4g/m3X67分钟，致死；人经口 20 50ml， 轻度中毒；人经口 100 150ml，致死；人吸入2.9 4.0g/m3， 20分钟后眩晕。
亚急性和慢性毒性大鼠吸入4.69g/r^,8小时/天，75天，无病理改变。 暴露时间增加，有轻度肝萎縮、脂肪变性和细胞浸润。
致突变性微生物致突变鼠伤寒沙门氏菌5700ppm。 DNA抑制人 成纤维细胞5000ppm/小时(连续)。
生殖毒性大鼠吸入最低中毒浓度(TCL0)1250ppm(7小时，孕6 15 天)，引起肌肉骨骼发育异常，泌尿生殖系统发育异常。
致癌性IARC致癌性评论动物阳性，人类不明确。关于病人是否应 把二氯甲烷视为动物和人的致癌物，动物实验数据和人类流行病学数据尚 不充分。
分解产物 一氧化碳、二氧化碳、氯化氢、光气。 如何更好地利用二氯甲垸持续产生一氧化碳的特性，同时又要避免大 量、快速的二氯甲烷吸收导致二氯甲垸中毒、 一氧化碳中毒，是临床治疗 脓毒症的重要课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种一氧化碳释放物质在制备治疗脓毒症药物中 的应用，以满足临床治疗脓毒症的需要。
本发明的另一个目的是提供一种治疗脓毒症的制剂。
发明人经过大量的动物试验发现，二氯甲烷可以作为早期抑制脓毒症
的药物，将二氯甲垸溶解在溶剂中，然后将其置于生物体内，吸收后可以 持续性释放一氧化碳，故可作为一种外源性一氧化碳供体；
本发明采用小鼠盲肠结扎和穿孔(CLP)脓毒症模型，进行早期干预， 即动物伤后即刻开始使用的方法，进行试验，发现新型一氧化碳释放物质 制剂可以作为早期抑制脓毒症的药物。
本发明所述的治疗脓毒症的制剂，包括治疗有效量的二氯甲烷和溶剂;
所述溶剂为食用麻油；
优选的，制剂中，二氯甲烷的含量为50 600 mg/mL，最优选的为 100mg/mL。
本发明所述的制剂，可以通过口服的给药途径，施加于需要治疗的脓 毒症动物，剂量一般为480 520 mg/kg体重/天，优选500 mg/kg体重/天， 具体可根据病人的病情，由医师决定。
本发明的制剂，毒副作用较小。
本发明的制剂，将二氯甲烷溶于食用麻油中，具有相对缓释作用，对 机体具有双重保护作用 一是总剂量的限制，二是剂型的缓释吸收，其浓
度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便，能够满足临床应用的需要。
图1为本动物实验研究中选用500mg/kg新型一氧化碳释放物质制剂后
COHb的代谢动力学变化；
图2为新型一氧化碳释放物质制剂抑制细胞表面粘附分子的表达； 图3为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肝脏MPO活性； 图4为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肝脏内皮细胞对白
细胞的粘附；
图5为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肺脏MPO活性；
图6为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肺泡灌洗液TNF-的表达；
图7为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肺泡灌洗液IL-1 的表达；
图8为新型一氧化碳释放物质制剂抑制脓毒症小鼠肺内皮细胞对白细 胞的粘附；
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明的实质内容作进一步的说明。
实施例1
将500mg的二氯甲烷与5mL的麻油混合，即获得浓度含量为 100mg/mL的制剂。
所述麻油为一级小磨香油，为芝麻经高温炒料处理后，用水代法加工 制取的物质，采用符合食品要求的市售产品。
采用相同的方法，可以方便的制备浓度含量为50mg/mL 600 mg/mL 范围内的制剂。
以下实施例中，采用的试验药物为实施例1的药物。
实施例2
l.二氯甲烷制剂的使用及血液中的一氧化碳血红蛋白(COHb)结合程度 的判断
采用《全国临床检验操作规程第三版》(中华人民共和国卫生部易政 司主编，东南大学出版社，2006年，189—190页)文献规定的方法，进行 测定，动物使用新型一氧化碳释放物质制剂后COHb的检测结果(见表1 )。
表1 动物使用新型一氧化碳释放物质制剂后COHb的检测结果
COHb(%)
二氯甲垸(mg/kg)0h6h12h24h48h
1000.60.81.70.40.8
3000.56.45.40.50.8
5000.513.63.60.90.7
7000.619.416.42.51.5
9000.449.830.111.43.9
2、 本动物实验研究中新型一氧化碳释放物质制剂的剂量即选用500mg/kg 。
3、 本动物实验研究中选用500mg/kg新型一氧化碳释放物质制剂后COHb 的代谢动力学变化(见图1)。
实施例3
新型一氧化碳释放物质制剂对脓毒症小鼠肝脏炎症反应的抑制作用
试验方法
(1 )动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6 — 8周龄，体重18士2克，于普通实验室饲养(商品 化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成三组Sham组(n =9) ， CLP组(n=9) ， CLP加二氯甲烷组(n=9) 。 CLP组小鼠异氟烷 吸入麻醉下，行盲肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克； CLP加二氯甲垸组小鼠CLP清醒后口服二氯甲烷制剂(500mg/kg)。所有动物 伤后24小时用异氟垸过度吸入致死后收集标本。
(2)检测指标
肝组织髓过氧化物酶(MPO)活性检测取肝组织约100mg，力口0.5% HTAB 2ml制备匀浆，反复冻融3次并超声粉碎10s共3次，4。C40，000g 离心30min，取上清0.1ml加反应液2.9ml，保持温度于25。C，立即在分光 光度计460nm波长下进行2min的扫描，记录第30s和第卯s的光密度差值， 以此lmin内吸光度的变化代表酶活力的改变。
AA460/min
MPO活力单位(U/g)二
11.3 x所加组织量g / L反应液
核蛋白与胞浆蛋白的提取:组织标本于液氮中研磨，随后置于300 1缓 冲液E(10mmol/LHEPES (pH7.9) ， 1Ommol/LKC1， 1.5mmol/LMgC12， l%NP-40， 0.5mmol/L DTT， 0.5 mmol/L PMSF， 10 g/ml aprotinin, 10 g/ml leupeptin，5Q/。甘油)中冰浴匀浆，将匀浆液移至EP管中，4r下3,000g离心 10min，吸取上清为胞浆蛋白，-80。C保存。将沉淀再溶于300 1缓冲液A + (去除l。/。NP-40的BufferA)中，振荡混匀，3，000g4。C离心10min，弃上 清，将沉淀溶于60 1缓冲液Ec(20mmol/LHEPES(PH7.9)， 420 mmol/L NaCl， 1Ommol/LKC1， 1.5mmol/L MgC12， l%NP-40， 0. 5mmol/LDTT， 0.5 mmol/L PMSF， 10 g/ml aprotinin， 10 g/ml leupeptin ,25%甘油)中，冰浴 30min后14,000g离心20min，留取上清-80。C保存。
蛋白印迹(Western blotting):每组取等量蛋白(IO g)进行电泳，再 将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质电泳转移到硝酸纤维(SG)膜上依次加入相 应一抗(大鼠抗小鼠ICAM-1抗体，稀释度为l: 1000) 、 二抗(辣根过氧
化物酶标记的兔抗大鼠IgG，稀释度1: 2500)及化学发光剂(Enhanced Chemiluminescence试剂盒，ECL)，暗室中曝光于x光片，胶片经全自动 洗片机处理，蛋白带用图象分析系统分析。
白细胞粘附试验(Adhesion):肝窦内皮细胞(Sinusoidal endothelial cells, SECs)的分离参照Braet等方法。采用小鼠后肢骨髓常规分离多形核白细 胞(PMNs) 。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5xl07细胞/ml 用50pCi Na51Cr04/ml在37°C孵育60分钟。洗涤去除剩余同位素后，将 标记的PMN(5xl0" L)加入血清剌激4h后的肝窦内皮细胞，孵育30分钟， 收集细胞裂解液、上清液及洗涤液，液闪仪同位素计数，计算粘附的PMN 百分比
PMN粘附率(％)=细胞裂解液同位素/(细胞裂解液同位素+洗漆液同位素 十上清液同位素)xl00。
统计学处理数据用均数士标准差表示，均数的比较采用t检验。户0.05 为有统计学差异。差异显著性检验釆用SAS 6.02统计软件。
结果如下
二氯甲烷对CLP后小鼠肝组织ICAM-1蛋白表达的影响图2示 CLP24h后肝组织ICAM-l蛋白表达明显增高(尸<0.05)，应用二氯甲垸后 脏器的ICAM-1蛋白表达与CLP组相比明显下降，差异有显著意义(尸<0.05) 二氯甲烷对CLP后小鼠肝组织MPO活性的影响图3示正常肝组织 MPO活性较低，CLP24h后肝组织MPO活性明显增高(尸<0.05)，应用二 氯甲烷后脏器的MPO活性与CLP组相比明显下降，差异有显著意义 (尸<0.05)
白细胞粘附试验(Adhesion):图4示常规分离肝窦内皮细胞(SECs)
和小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5xl07 细胞/ml用50^iCiNa"CrO4/ml在37。C孵育60分钟。用CLP小鼠血清刺激 肝窦内皮细胞4小时后，肝窦内皮细胞对白细胞的粘附明显增强(/><0.05)， 应用二氯甲垸处理的CLP小鼠血清刺激肝窦内皮细胞4小时后，对白细胞的 粘附作用较未处理组明显下降，差异有显著意义(尸<0.05)。
实施例4
新型一氧化碳释放物质制剂对脓毒症小鼠肺组织炎症反应的抑制作用
试验方法
(1 )动物及CLP脓毒症模型
雄性C57BL/6小鼠，6 — 8周龄，体重18±2克，于普通实验室饲养(商品 化干块料，自由饮水)。实验动物按照随机数字表法分成三组Sham组(n =9) ， CLP组(n=9) ， CLP加二氯甲垸组(n=9) 。 CLP组小鼠异氟烷 吸入麻醉下，行盲肠结扎和穿孔术，伤后腹腔内注射生理盐水1.5ml抗休克； CLP加二氯甲垸组小鼠CLP清醒后口服二氯甲垸(500mg/kg)。所有动物伤后 24小时用异氟垸过度吸入致死后收集标本。
(2)检测指标
肺组织中髓过氧化物酶(MPO)活性检测取肺组织约100mg，加0.5% HTAB 2ml制备匀浆，反复冻融3次并超声粉碎10s共3次，4'C40,000g 离心30min，取上清0.1ml加反应液2.9ml，保持温度于25。C，立即在分光 光度计460nm波长下进行2min的扫描，记录第30s和第90s的光密度差值， 以此lmin内吸光度的变化代表酶活力的改变。
△A460/min
MPO活力单位(U/g):-
11.3 x所加组织量g / L反应液
肺泡灌洗液TNF-oc和IL-1卩的测定肺泡灌洗术(BAL)采用文献报 道方法.肺泡灌洗液保存于4。C ， TNF《和IL-1P的测定釆用酶链免疫吸 附法(enzyme-linked immunosorbent assay ， ELISA).肺泡灌洗液使用前 经0.22-mm滤器过滤。
白细胞粘附试验(Adhesion):常规分离肺内皮细胞(MiceLung Endothelial Cell, MLEC)和小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放 射性同位素标记，5xl07细胞/ml用50^iCiNa"Cr(Vml在37。C孵育60分 钟。洗涤去除剩余同位素后，将标记的PMN(5xl0" L)加入血清剌激4h后 的肺内皮细胞，孵育30分钟，计算粘附的PMN百分比 PMN粘附率(％)=细胞裂解液同位素/(细胞裂解液同位素+洗涤液同位素 十上清液同位素)x100。
统计学处理数据用均数±标准差表示，均数的比较采用t检验。户<0.05 为有统计学差异。差异显著性检验采用SAS 6.02统计软件。
结果如下
二氯甲烷对CLP后小鼠肺组织MPO活性的影响图5示正常肺组织 MPO活性较低，CLP24h后肺组织MPO活性明显增高(尸<0.05)，应用二 氯甲烷后脏器的MPO活性与CLP组相比明显下降，差异有显著意义 (尸<0.05)
二氯甲烷对CLP后小鼠肺泡灌洗液细胞因子水平的影响肺泡灌洗术(Bronchoalveolar lavage, BAL)采用文献报道方法，肺泡灌洗液保存于 4°C ，TNF-cc (图6)和IL-1 (图7)的测定采用酶链免疫吸附法(ELISA)。 肺泡灌洗液使用前经0.22-mm滤器过滤。结果显示，CLP24小时后小鼠肺 泡灌洗液细胞因子水平均较正常明显提高(尸<0.05)，应用二氯甲烷后与CLP 组相比则明显下降，差异有显著意义(尸<0.05)。
白细胞粘附试验(Adhesion):图8示常规分离肺内皮细胞(MLEC)和 小鼠后肢骨髓PMNs。 PMNs重悬于PBS中进行放射性同位素标记，5xl07细 胞/ml用50pCiNa"CrO4/ml在37。C孵育60分钟。用CLP小鼠血清剌激肺 内皮细胞4小时后，肺内皮细胞对白细胞的粘附明显增强(/><0.05)，应用 二氯甲烷处理的CLP小鼠血清刺激肺内皮细胞4小时后，对白细胞的粘附作 用较未处理组明显下降，差异有显著意义(P<0.05)。
权利要求
1.二氯甲烷在制备治疗脓毒症药物中的应用。
2. —种治疗脓毒症的制剂，包括治疗有效量的二氯甲烷和溶剂。
3. 根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述溶剂为食用麻油。
4. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，制剂中，二氯甲烷的含 量为50 600 mg/mL。
5. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，制剂中二氯甲垸的含量 为100mg/mL。
6. 根据权利要求3所述的制剂，其特征在于，通过口服的给药途径， 施加于需要治疗的脓毒症动物，剂量为480 520 mg/kg体重/天。
全文摘要
本发明公开了一种一氧化碳释放物质在制备治疗脓毒症药物中的应用，本发明将二氯甲烷溶于食用麻油中，制备成可供口服使用的制剂，口服吸收后可以在体内持续释放一氧化碳，故可作为一种外源性一氧化碳供体，并采用小鼠CLP脓毒症模型，进行干预，进行试验，发现使用所述口服制剂可以作为早期抑制脓毒症的药物。采用所述的口服制剂抑制脓毒症，其浓度控制相对容易且正确，长期使用时追加方便。能够满足临床应用的需要。
文档编号A61P29/00GK101357122SQ20081004268
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者刘东明, 孙炳伟, 曦 陈 申请人:江苏大学附属医院