维生素受体结合递药缀合物的制作方法

专利名称：维生素受体结合递药缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于靶向递药的组合物和方法。更具体地讲，本发明涉及用于治疗致病细胞群体所引起疾病的维生素受体结合递药缀合物，及其相关方法和药物组合物。

背景技术：
哺乳动物免疫系统为识别和消除肿瘤细胞、其它致病细胞和侵入的外源病原体提供方法。尽管免疫系统正常提供强大的保护线，但在许多情况下癌细胞、其它致病细胞或感染因子逃避宿主免疫反应并增殖或持续存在伴随宿主的致病性。已经开发出许多化疗药和放射疗法来消除如复制中的肿瘤。然而，许多目前可利用的化疗药和放疗方案都有毒副作用，因为它们不仅破坏致病细胞而且还影响正常宿主细胞如造血系统的细胞。这些抗癌药的毒副作用凸显出对开发具致病细胞群体选择性同时宿主毒性减少的新疗法的需求。
研究者已经开发出通过使细胞毒性化合物靶向这类细胞而破坏致病细胞的治疗方案。这些方案中的许多方案使用与抗体缀合的毒素，而所述抗体与只有所述致病细胞才有的或被该致病细胞过量表达的抗原结合，从而试图最小化传递到正常细胞的毒素。利用此方法，开发出由以下抗体组成的某些免疫毒素抗致病细胞上特异性抗原的抗体、连接到毒素例如篦麻毒素、假单胞菌外毒素、白喉毒素和肿瘤坏死因子上的抗体。这些免疫毒素靶向带有被所述抗体识别的特异性抗原的致病细胞，例如肿瘤细胞(Olsnes，S.，Immunol.Today，10，第291-295页，1989；Melby，E.L.，Cancer Res.，53(8)，第1755-1760页，1993；Better，M.D.，1991年5月30日公布的PCT公布号WO 91/07418)。
另一种靶向宿主中癌细胞或外来病原体等致病细胞群体的方法是，增强宿主抗致病细胞的免疫反应以避免给予化合物的需要，所述化合物也具有独立的宿主毒性。一个报道的免疫治疗策略为将抗体如基因工程多聚抗体结合至肿瘤细胞表面，以将抗体的恒定区展示在所述细胞表面，并因此诱导肿瘤细胞被各种免疫系统介导过程杀死(De Vita，V.T.，Biologic Therapy of Cancer，第二版，Philadelphia，Lippincott，1995；Soulillou，J.P.，美国专利5,672,486)。然而，这些方法已经被定义肿瘤特异性抗原上的困难复杂化。


发明内容
在试图开发对致病细胞具特异性并对正常细胞毒性最小的有效疗法时，开发出了维生素受体结合递药缀合物。本发明适用于引起宿主动物体内各种病变的致病细胞群体。可用本发明的递药缀合物治疗的致病细胞包括肿瘤细胞、感染因子如细菌和病毒、细菌或病毒感染的细胞以及任何独特表达、优先表达或过量表达维生素受体或结合维生素类似物或衍生物的受体的其它类型致病细胞。
在一个实施方案中，提供维生素受体结合递药缀合物。所述递药缀合物包含维生素受体结合部分、二价接头和药物。本文所用的“V”是指维生素受体结合部分并包括维生素及其维生素受体结合类似物或衍生物，术语“维生素或其类似物或衍生物”是指能够结合维生素受体的维生素及其类似物和衍生物。本文所用的“D”是指药物并包括其类似物或衍生物。所述维生素或其类似物或衍生物共价连接到二价接头(L)上，所述药物或其类似物或衍生物也共价连接到二价接头(L)上。所述二价接头(L)可包含多接头。例如，二价接头(L)可包含一个或多个组分，其选自按任何次序排列的间隔接头(ls)、可释放接头(lr)和杂原子接头(lH)及其组合。
说明该实施方案的递药缀合物包括V-L-D V-(lr)c-D V-(ls)a-D V-(ls)a-(lr)c-D V-(lr)c-(ls)a-D V-(lH)b-(lr)c-D V-(lr)c-(lH)b-D V-(lH)d-(lr)c-(lH)e-D V-(ls)a-(lH)b-(lr)c-D V-(lr)c-(lH)b-(ls)a-D V-(lH)d-(ls)a-(lr)c-(lH)e-D V-(lH)d-(lr)c-(ls)a-(lH)e-D V-(lH)d-(ls)a-(lH)b-(lr)c-(lH)e-D V-(lH)d-(lr)c-(lH)b-(ls)a-(lH)e-D V-(ls)a-(lr)c-(lH)b-D V-[(ls)a-(lH)b]d-(lr)c-(lH)e-D 其中a、b、c、d和e各自独立地为0、1、2、3或4，(ls)、(lH)和(lr)如本文所定义，V为维生素或其类似物或衍生物，D为药物或其类似物或衍生物，并且其中二价接头L包含一个或许多按任何次序排列和以任何组合的(ls)、(lH)和(lr)。不言而喻，前述二价接头L的实例旨在说明，而非限制包含于所述二价接头的(lH)、(ls)和(lr)的广泛的装配种类。
不言而喻，所述间隔接头、杂原子接头和可释放接头的每一个都是二价的。同样，本文所定义的各种间隔接头、杂原子接头和可释放接头间的连接，以及各种间隔接头、杂原子接头和可释放接头与D和/或V间的连接，可发生在存在于各种间隔接头、杂原子接头和可释放接头中的任何原子上，并且未必在各种间隔接头、杂原子接头和可释放接头的任何明显末端。例如，在说明性的实施方案中，其中二价接头为
即，其中二价接头L为-(lH)-(ls)5-(lr-lH)2-D，其中分别地，(lH)为氮，(ls)5为Ala-Glu-Lys-Asp-Asp，(lr-lH)2为-(CH2)2-S-S-(CH2)2-O-C(O)-O-，所述(lr-lH)2接头连接到所述(ls)5接头的中部。
在另一实施方案中，提供维生素受体结合递药缀合物。所述递药缀合物包含维生素受体结合部分、二价接头(L)和药物，而二价接头(L)包含一个或多个杂原子接头(lH)。所述维生素受体结合部分通过第一杂原子接头(lH)d共价连接到二价接头(L)上，药物通过第二杂原子接头(lH)e共价连接到二价接头(L)上。二价接头(L)也包含一个或多个间隔接头和可释放接头，其中间隔接头和可释放接头可通过第三杂原子接头(lH)b相互共价连接。说明该实施方案的递药缀合物如下 V-(lH)d-(ls)a-(lH)b-(lr)c-(lH)e-D 其中a、b、c、d和e各自独立地为0、1、2、3或4，(ls)、(lH)和(lr)以及V和D如本文所定义，并且其中二价接头L包含如所说明的(ls)、(lH)和(lr)。
在另一实施方案中，提供维生素受体结合递药缀合物。所述递药缀合物包含维生素受体结合部分、二价接头(L)和药物，二价接头(L)包含一个杂原子接头(lH)。所述维生素受体结合部分为维生素或其类似物或衍生物，药物包括其类似物或衍生物。维生素或其类似物或衍生物共价连接到二价接头(L)上，药物或其类似物或衍生物共价连接到二价接头(L)上。二价接头(L)也包含间隔接头和可释放接头，并且间隔接头和可释放接头可通过杂原子接头相互共价连接。说明该实施方案的递药缀合物如下 V-(ls)a-(lH)b-(lr)c-D 其中a、b和c各自独立地为0、1、2、3或4，(ls)、(lH)和(lr)以及V和D如本文所定义，并且其中二价接头L包含如所说明的(ls)、(lH)和(lr)。
在另一实施方案中，提供通式V-L-D的维生素受体结合递药缀合物。在该实施方案中，L由一个或多个按任何次序排列的接头(lr)c、(ls)a和(lH)b及其组合构成，其中(lr)为可释放接头，(ls)为间隔接头，(lH)为杂原子接头，a、b和c各自独立地为0、1、2、3或4，V为维生素或其类似物或衍生物，D为药物或其类似物或衍生物。不言而喻，本文所述递药缀合物可包括具有不止一个间隔接头、可释放接头或杂原子接头的二价接头。例如，仔细考虑了包括两个或更多个可释放接头(lr)的二价接头。此外，这种可释放接头的构型包括二价接头，其中可释放接头相互共价连接，并且其中可释放接头被一个或多个杂原子接头和/或间隔接头相互间隔开。
在另一实施方案中，描述通式V-L-D的维生素受体结合递药缀合物，其中L为包含按任何次序排列的(ls)a和(lH)b及其组合的二价接头，其中(ls)a和(lH)b以及V和D如本文所定义。在该实施方案中，递药缀合物中的药物可为半抗原，例如但不限于荧光素、二硝基苯基等。
在另一实施方案中，描述通式V-L-D的维生素受体结合递药缀合物，其中L为包含按任何次序排列的(ls)a、(lH)b和(lr)c及其组合的二价接头，其中(ls)a和(lH)b以及V和D如本文所定义，并且其中至少一个(lr)不是二硫化物。不言而喻，在该实施方案中具有不止一个(lr)，即其中c大于1的二价接头，除另一个或其它可释放接头外还可包括二硫化物可释放接头。
在本文所述的各种维生素受体结合递药缀合物的一个方面，二价接头包括结合在一起形成3-硫基琥珀酰亚胺-1-基烷氧基甲基氧基的杂原子接头、间隔接头和可释放接头，其中所述甲基任选被烷基或取代芳基取代。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-硫基琥珀酰亚胺-1-基烷基羰基的杂原子接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成酰基氮丙啶。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成1-烷氧基亚环烷氧基的杂原子接头、间隔接头和可释放接头。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成亚烷基氨基羰基(二羧基亚芳基)羧酸酯的间隔接头、杂原子接头和可释放接头。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成二硫基烷基羰基酰肼的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述酰肼与所述药物或其类似物或衍生物形成腙。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-硫基琥珀酰亚胺-1-基烷基羰基酰肼的杂原子接头、间隔接头和可释放接头，其中所述酰肼与所述药物或其类似物或衍生物形成腙。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-硫基烷基磺酰基烷基(二取代甲硅烷基)氧基的杂原子接头、间隔接头、杂原子接头、间隔接头和可释放接头，其中所述二取代甲硅烷基被烷基或任选取代的芳基取代。
另一方面，二价接头包括许多选自天然存在的氨基酸及其立体异构体的间隔接头。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷氧基羰基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成碳酸酯。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基芳基烷氧基羰基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成碳酸酯，并且所述芳基为任选取代的。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-硫基琥珀酰亚胺-1-基烷氧基烷氧基亚烷基的杂原子接头、间隔接头、可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述亚烷基与所述药物或其类似物或衍生物形成腙，每个烷基独立选择，并且所述氧基烷氧基任选被烷基或任选取代的芳基取代。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷氧基羰基酰肼的可释放接头、间隔接头和可释放接头。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷基氨基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述氨基与所述药物或其类似物或衍生物形成联乙烯酰胺。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷基氨基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述氨基与所述药物或其类似物或衍生物形成联乙烯酰胺，并且所述烷基为乙基。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷基氨基羰基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成氨基甲酸酯。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基烷基氨基羰基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成氨基甲酸酯，并且所述烷基为乙基。
另一方面，二价接头包括结合在一起形成3-二硫基芳基烷氧基羰基的可释放接头、间隔接头和可释放接头，其中所述羰基与所述药物或其类似物或衍生物形成氨基甲酸酯或氨基甲酰基氮丙啶。
一方面，可释放接头、间隔接头和杂原子接头可以按这种方式排列，使得在二价接头中的键断裂之后，释放出的官能团在化学上促进另外键的断裂或裂解，也称为邻位促进裂解或断裂。这种二价接头或其部分的说明性的实施方案包括具有下式的化合物
其中X为杂原子，例如氮、氧或硫，n为选自0、1、2和3的整数，R为氢或取代基，包括能够通过诱导或通过在芳环上的共振稳定正电荷的取代基，例如烷氧基等，符号(*)表示形成二价接头的附加的间隔接头、杂原子接头或可释放接头的连接点，或药物或其类似物或衍生物，或所述维生素或其类似物或衍生物的连接点。不言而喻，其它取代基包括但不限于可存在于芳环、苯甲基碳、烷酸或亚甲基桥上的羟基、烷基、烷氧基、烷硫基、卤素等。促进裂解可包括涉及苯甲中间体、苯炔中间体、内酯环化、氧中间体、β-消除等的机理。同样不言而喻，除在可释放接头裂解之后的裂解外，可释放接头的初始裂解也可通过邻位促进机理易化。
在另一实施方案中，提供维生素受体结合递药缀合物中间体。所述中间体包含维生素受体结合部分、具有第一末端和第二末端的二价接头和偶联基团。所述维生素受体结合部分为维生素或其类似物或衍生物，所述偶联基团包括亲核试剂、亲电试剂或其前体。所述维生素受体结合部分在所述二价接头的第一末端共价连接到所述二价接头上，所述偶联基团在所述二价接头的第二末端共价连接到所述二价接头上，并且所述二价接头包括按任何次序排列的一个或多个间隔接头、可释放接头和杂原子接头及其组合。
在另一实施方案中，描述维生素受体结合递药缀合物中间体。所述中间体包含具有第一末端和第二末端的二价接头、药物或其类似物或衍生物和偶联基团。如本文所述，二价接头包括一个或多个选自间隔接头、可释放接头和杂原子接头的组分。所述偶联基团在所述二价接头的第一末端共价连接到所述二价接头上，所述药物或其类似物或衍生物在所述二价接头的第二末端共价连接到所述二价接头上。此外，所述偶联基团为能够与维生素受体结合部分形成共价键的亲核试剂、亲电试剂或其前体，其中所述维生素受体结合部分为维生素或其类似物或衍生物。
在另一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性实施方案中，所述偶联基团为迈克尔(Michael)受体，所述二价接头包括具有式-C(O)NHN＝、-NHC(O)NHN＝或-CH2C(O)NHN＝的可释放接头。在本文所述维生素受体结合递药缀合物中间体的一个说明性方面，所述偶联基团和所述二价接头结合在一起形成具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中D为能够如本文说明形成腙的药物或其类似物或衍生物；n为整数，例如1、2、3或4。在另一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性方面，维生素或其类似物或衍生物包括烷基硫醇亲核试剂。
在另一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性实施方案中，所述偶联基团为杂原子，例如氮、氧或硫，二价接头包括共价连接维生素或其类似物或衍生物到所述偶联基团上的一个或多个杂原子接头和一个或多个间隔接头。在一个说明性的方面，本文所述维生素受体结合递药缀合物中间体包括具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中X为氧、氮或硫，m为整数，例如1、2或3，其中V、ls和lH如本文所定义。
在另一个说明性的方面，本文所述维生素受体结合递药缀合物中间体包括具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中X为氮或硫，其中V和ls如本文所定义。
在另一个说明性的方面，本文所述维生素受体结合递药缀合物中间体包括具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中Y为氢或取代基，说明性地为吸电子取代基，包括但不限于硝基、氰基、卤素、烷基磺酰基、羧酸衍生物等，其中V和ls如本文所定义。
在另一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性实施方案中，所述偶联基团为迈克尔受体，二价接头包括共价结合维生素或其类似物或衍生物到所述偶联基团上的一个或多个杂原子接头和一个或多个间隔接头。在一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性方面，所述偶联基团和二价接头结合在一起形成具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中X为氧、氮或硫，m和n为独立选择的整数，例如1、2或3，其中V、ls和lH如本文所定义。在一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性方面，所述药物或其类似物或衍生物，包括烷基硫醇亲核试剂。
在另一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性方面，中间体包括具有下式的化合物
或其被保护衍生物，其中V为维生素或其类似物或衍生物，AA为说明性选自天然存在的氨基酸或其立体异构体的氨基酸，X为氮、氧或硫，Y为氢或取代基，说明性地为吸电子取代基，包括但不限于硝基、氰基、卤素、烷基磺酰基、羧酸衍生物等。n和m为独立选择的整数，例如1、2或3，并且p为整数如1、2、3、4或5。AA也可为任何其它氨基酸，例如任何具有以下通式的氨基酸 -N(R)-(CR′R″)q-C(O)- 其中R为氢、烷基、酰基或合适的氮保护基，R′和R″为氢或取代基，其中每个每次出现时独立选择，q为整数如1、2、3、4或5。说明性地，R′和/或R″独立符合但不限于氢或存在于天然存在的氨基酸上的侧链，例如甲基、苯甲基、羟基甲基、硫基甲基、羧基、羧基甲基、胍基丙基等，及其衍生物和保护的衍生物。上述式包括所有立体异构变体。例如，氨基酸可选自天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、鸟尿酸、苏氨酸等。在一个本文所述的维生素受体结合递药缀合物中间体的说明性方面，所述药物或其类似物或衍生物，包括烷基硫醇亲核试剂。
在另一实施方案中，描述了制备具有下式的化合物或其被保护衍生物的方法
其中L为含有(lr)c、(ls)a和(lH)b及其组合的接头；D为能够形成腙的药物或其类似物或衍生物，其中(lr)c、(ls)a和(lH)b以及V如本文所定义，所述方法包括下述步骤 (a)使具有下式的化合物或其被保护衍生物
与具有下式的化合物或其被保护衍生物反应
生成硫基琥珀酰亚胺衍生物；和 (b)与硫基琥珀酰亚胺衍生物形成药物或其类似物或衍生物的腙衍生物。
在另一实施方案中，描述了制备具有下式的化合物的方法
其中L为包含(lr)c、(ls)a和(lH)b及其组合的接头；其中D为能够形成腙的药物或其类似物或衍生物，(lr)c、(ls)a和(lH)b以及V如本文所定义，所述方法包括下述步骤 使具有下式的化合物或其被保护衍生物
与具有下式的化合物
或其被保护衍生物反应。
在另一实施方案中，描述了药物组合物。所述药物组合物包含本发明的递药缀合物及其药物可接受的载体。
在另一实施方案中，描述了一种消除带有致病细胞群体的宿主动物体内致病细胞群体的方法，其中所述致病细胞群体的成员具有可及的维生素或其类似物或衍生物的结合部位，并且其中所述结合部位被所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达，所述方法包括给予所述宿主本发明的递药缀合物或其药物组合物的步骤。
附图简述

图1显示EC112(实施例9c)对M109肿瘤生长的抑制。
图2显示EC112(实施例9c)对动物体重的影响。
图3显示EC105(实施例10a)对M109肿瘤生长的抑制。
图4显示EC105(实施例10a)对动物体重的影响。
图5显示EC105(实施例10a)缺乏对4T1肿瘤生长的抑制。
图6显示EC145(实施例16b)对M109肿瘤生长的抑制。
图7显示EC140(实施例17a)对M109肿瘤生长的抑制。
图8显示EC136(实施例10b)对L1210肿瘤生长的抑制。
图9-16显示EC135、EC136、EC137、EC138、EC140、EC145、EC158和EC159(分别为实施例17b、10b、16a、10c、17a、16b、14e和15)对细胞DNA合成的抑制。
发明详述 本发明涉及维生素受体结合递药缀合物，其含有维生素受体结合部分、二价接头(L)和药物，其中所述维生素受体结合部分和所述药物各自任选通过杂原子接头连接到所述二价接头(L)上。二价接头(L)包含一个或多个按任何次序排列的间隔接头、杂原子接头和可释放(即可裂解)接头及其组合。
本文所用的术语“可释放接头”是指包括至少一个在生理条件下可断裂的键(例如pH不稳定键、酸不稳定键、氧化不稳定或酶不稳定键)的接头。不言而喻，这种导致键断裂的生理条件包括发生在生理pH下的，或作为区室化入细胞器例如其pH比胞质pH低的核内体的结果而发生的标准化学水解反应。
不言而喻，如本文所述，可裂解键可连接可释放接头内的两个相邻原子，和/或在所述可释放接头的任一端或两端连接其它接头或V和/或D。在这种可裂解键连接可释放接头内的两个相邻原子的情况下，该键断裂后，所述可释放接头断裂成两个或更多个片段。或者，在这种可裂解键在可释放接头和另一部分例如杂原子接头、间隔接头、另一可释放接头、药物或其类似物或衍生物或维生素或其类似物或衍生物之间的情况下，该键断裂后，可释放接头从其它部分中分离出来。
可裂解键的不稳定性可进行调整，例如通过在可裂解键位置或其附近的取代改变，例如包括毗邻可裂解二硫键的α分支化，增加具可水解硅氧键的部分中硅上取代基疏水性，同系化形成可水解的部分缩酮或缩醛的烷氧基等。
根据本发明，所述维生素受体结合递药缀合物可用于治疗以宿主中存在致病细胞群体为特征的疾病，其中致病细胞群体的成员具有可及的维生素或其类似物或衍生物结合部位，其中所述结合部位被所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达。所述致病细胞的选择性消除，由所述维生素受体结合递药缀合物的维生素部分连接到维生素受体、转运蛋白或其它特异性结合维生素或其类似物或衍生物的表面存在蛋白上介导，并且所述表面存在蛋白被所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达。所述致病细胞独特表达、过量表达或优先表达的表面存在蛋白是提供选择性消除致病细胞的方法的在非致病细胞中不存在或浓度较低的受体。
例如，高亲和力叶酸受体等表面表达维生素受体在肿瘤细胞上过量表达。卵巢、乳腺、结肠、肺、鼻、咽和脑上皮癌都被报道表达高水平叶酸受体。事实上，已知超过90％的人类卵巢肿瘤以高水平表达这种受体。因此，本发明递药缀合物可用于治疗各种肿瘤细胞类型，以及其它致病细胞类型如感染因子，所述细胞类型优先表达维生素受体，并因此具有表面可及的维生素或维生素类似物或衍生物结合部位。
除本文所述的维生素外，不言而喻，其它配体可与本文所述或所考虑的药物或接头偶联，形成配体-接头-药物缀合物，该缀合物可使药物递至所需靶易化。除所述维生素及其类似物和衍生物外，这些其它配体可用于形成能够结合到靶细胞上的递药缀合物。一般来说，细胞表面受体的任何配体可有效地用作可制备成接头-药物缀合物的靶向配体。本文考虑的说明性的其它配体包括从文库筛选鉴定出的肽配体、肿瘤细胞特异性肽、肿瘤细胞特异性适体(aptamer)、肿瘤细胞特异性糖类、肿瘤细胞特异性单克隆抗体或多克隆抗体、抗体的Fab或scFv(即单链可变区)片段(例如抗EphA2或其它被转移癌细胞特异性表达的或转移癌细胞独有的蛋白的抗体的Fab片段)、得自组合文库的有机小分子、生长因子(如EGF、FGF、胰岛素和胰岛素样生长因子，及同源多肽)、促生长素抑制素及其类似物、转铁蛋白、脂蛋白复合物、胆盐、选凝素、类固醇激素、含Arg-Gly-Asp肽、类视黄醇、各种半乳凝集素、δ-阿片样受体配体、缩胆囊肽A受体配体、血管紧张素AT1或AT2受体特异性配体、过氧化物酶体增殖物激活受体λ配体、β-内酰胺抗生素例如青霉素、有机小分子(包括抗微生物药物和其它分子，所述分子特异性结合优先表达于肿瘤细胞或感染生物体上的受体)、抗微生物药物和其它根据受体或其它细胞表面蛋白的晶体结构设计来适应具体受体结合口袋的药物、在肿瘤细胞表面优先表达的肿瘤抗原或其它分子或所有这些分子的片段。可用作配体-免疫原缀合物的结合部位的肿瘤特异性抗原的实例包括肝配蛋白家族成员的细胞外表位，例如EphA2。在正常细胞中，EphA2表达被限制在细胞-细胞接点，但在转移肿瘤细胞中，EphA2分布在整个细胞表面。因此，转移细胞上的EphA2可接近结合到缀合在免疫原上的抗体Fab片段上，所述蛋白不接近结合到正常细胞上的Fab片段上，产生转移癌细胞特异性配体-免疫原缀合物。
本发明还考虑了配体-接头-药物缀合物的组合的用途，以最大化靶向要消除的致病细胞。
说明性递药缀合物如下 V-L-D V-(lr)c-D V-(ls)a-DV-(ls)a-(lr)c-DV-(lr)c-(ls)a-DV-(lH)b-(lr)c-DV-(lr)c-(lH)b-D V-(lH)d-(lr)c-(lH)e-D V-(ls)a-(lH)b-(lr)c-D V-(lr)c-(lH)b-(ls)a-D V-(lH)d-(ls)a-(lr)c-(lH)e-D V-(lH)d-(lr)c-(ls)a-(lH)e-D V-(lH)d-(ls)a-(lH)b-(lr)c-(lH)e-D V-(lH)d-(lr)c-(lH)b-(ls)a-(lH)e-D V-(ls)a-(lr)c-(lH)b-D V-[(ls)a-(lH)b]d-(lr)c-(lH)e-D 其中a、b、c、d和e各自独立地为0、1、2、3或4，(ls)为间隔接头，(lH)为杂原子接头，(lr)为可释放接头，V为维生素或其类似物或衍生物，D为药物或其类似物或衍生物，并且其中二价接头L包含一个或许多任何排列和任何组合的(ls)、(lH)和(lr)。不言而喻，前述二价接头L的实例旨在说明，而非限制包含于所述二价接头的(lH)、(ls)和(lr)的广泛的装配种类。
在一个递药缀合物V-L-D的实施方案中，其中V为维生素叶酸； L不是下式的乙二胺
在另一递药缀合物V-L-D的实施方案中，其中V为维生素叶酸，D为药物丝裂霉素C；L不是下式的L-Cys-(S-硫基乙基)
L不是下式的L-Asp-L-Arg-L-Asp-L-Cys-(S-硫基乙基)
L不是下式的L-Arg-L-Cys-(S-硫基乙基)-L-Ala-L-Gly-OH
也考虑了本发明的递药缀合物，其中维生素或其类似物或衍生物连接到可释放接头上，后者又通过间隔接头连接到药物上。而且，所述药物和所述维生素或其类似物或衍生物，可各自连接到间隔接头上，其中所述间隔接头通过可释放接头相互连接。此外，所述药物和所述维生素或其类似物或衍生物，可各自连接到可释放接头上，其中所述可释放接头通过间隔接头相互连接。杂原子接头可置于任何两个接头之间，或任何接头和维生素或其类似物或衍生物之间，或任何接头和药物或其类似物或衍生物之间。也考虑了所有其它可能的排列和组合。
在一个实施方案中，本发明提供维生素受体结合递药缀合物。所述递药缀合物由维生素受体结合部分、二价接头(L)和药物组成。所述维生素受体结合部分，为能够结合到维生素受体上的维生素或其类似物或衍生物，所述药物包括具有药物活性的其类似物或衍生物。所述维生素或其类似物或衍生物，共价连接到所述二价接头(L)上，药物或其类似物或衍生物，也共价连接到所述二价接头(L)上。二价接头(L)包含一个或多个按任何次序排列的间隔接头、可释放接头和杂原子接头及其组合。例如，所述杂原子接头可为氮，所述可释放接头和所述杂原子接头可结合在一起形成二价基，所述二价基包括亚烷基氮丙啶-1-基、亚烷基羰基氮丙啶-1-基、羰基烷基氮丙啶-1-基、亚烷基磺酸基氮丙啶-1-基、磺酸基烷基氮丙啶-1-基、磺酰基烷基氮丙啶-1-基或亚烷基磺酰基氮丙啶-1-基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代。或者，杂原子接头可为氮、氧、硫和式-(NHR1NHR2)-、-SO-、-(SO2)-和-N(R3)O-，其中R1、R2和R3各自独立选自氢、烷基、芳基、芳基烷基、取代芳基、取代芳烷基、杂芳基、取代杂芳基和烷氧基烷基。在另一实施方案中，所述杂原子接头可为氧，所述间隔接头可为任选被如下定义的取代基X1取代的1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基，所述可释放接头可为亚甲基、1-烷氧基亚烷基、1-烷氧基亚环烷基、1-烷氧基亚烷基羰基、1-烷氧基亚环烷基羰基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代，并且其中所述间隔接头和所述可释放接头各自连接到杂原子接头上形成琥珀酰亚胺-1-基烷基缩醛或缩酮。
所述间隔接头选自羰基、硫代羰基、亚烷基、亚环烷基、亚烷基环烷基、亚烷基羰基、亚环烷基羰基、羰基烷基羰基、1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基、亚烷基磺酸基、磺酰基烷基、亚烷基磺酸基烷基、亚烷基磺酰基烷基、羰基四氢-2H-吡喃基、羰基四氢呋喃基、1-(羰基四氢-2H-吡喃基)琥珀酰亚胺-3-基和1-(羰基四氢呋喃基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个所述间隔接头任选被如下定义的取代基X1取代。在该实施方案中，所述杂原子接头可为氮，所述间隔接头可为亚烷基羰基、亚环烷基羰基、羰基烷基羰基、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个间隔接头被如下定义的取代基X1任选取代，所述间隔接头连接到所述氮上形成酰胺。或者，所述杂原子接头可为硫，所述间隔接头可为亚烷基和亚环烷基，其中每个所述间隔接头任选被羧基取代，所述间隔接头连接到所述硫上形成硫醇。在另一实施方案中，所述杂原子接头可为硫，所述间隔接头可为1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基和1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基，所述间隔接头连接到所述硫上形成琥珀酰亚胺-3-基硫醇。
在上述实施方案的备选方案中，所述杂原子接头可为氮，所述可释放接头和所述杂原子接头可结合在一起形成二价基，所述二价基包括亚烷基氮丙啶-1-基、羰基烷基氮丙啶-1-基、磺酸基烷基氮丙啶-1-基或磺酰基烷基氮丙啶-1-基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代。在该备选实施方案中，所述间隔接头可为羰基、硫代羰基、亚烷基羰基、亚环烷基羰基、羰基烷基羰基、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个所述间隔接头任选被如下定义的取代基X1取代，并且其中所述间隔接头连接到所述可释放接头上形成氮丙啶酰胺。
所述取代基X1可为烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、卤素、卤代烷基、巯基烷基、烷基硫基烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、杂芳基、取代杂芳基、羧基、羧基烷基、烷基羧酸酯基、烷基烷酸酯基、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-酰氨基和R7-酰氨基烷基，其中R4和R5各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽，并且其中R6和R7各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽。在该实施方案中，所述杂原子接头可为氮，所述取代基X1和所述杂原子接头可与连接它们的间隔接头结合在一起形成杂环。
所述可释放接头可为亚甲基、1-烷氧基亚烷基、1-烷氧基亚环烷基、1-烷氧基亚烷基羰基、1-烷氧基亚环烷基羰基、羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基、卤代亚烷基羰基、亚烷基(二烷基甲硅烷基)、亚烷基(烷基芳基甲硅烷基)、亚烷基(二芳基甲硅烷基)、(二烷基甲硅烷基)芳基、(烷基芳基甲硅烷基)芳基、(二芳基甲硅烷基)芳基、氧基羰基氧基、氧基羰基氧基烷基、磺酰基氧基、氧基磺酰基烷基、亚氨基亚烷基、羰基亚烷基亚氨基、亚氨基亚环烷基、羰基亚环烷基亚氨基、亚烷基硫基、亚烷基芳基硫基和羰基烷基硫基，其中每个所述可释放接头任选被一个或多个如下定义的取代基X2取代。
在上述实施方案中，所述杂原子接头可为氧，所述可释放接头可为亚甲基、1-烷氧基亚烷基、1-烷氧基亚环烷基、1-烷氧基亚烷基羰基和1-烷氧基亚环烷基羰基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代，并且所述可释放接头连接到所述氧上形成缩醛或缩酮。或者，所述杂原子接头可为氧，所述可释放接头可为亚甲基，其中所述亚甲基被任选取代的芳基取代，所述可释放接头连接到氧上形成缩醛或缩酮。此外，所述杂原子接头可为氧，所述可释放接头可为磺酰基烷基，所述可释放接头连接到氧上形成烷基磺酸酯。
在另一上述可释放接头实施方案的实施方案中，所述杂原子接头可为氮，所述可释放接头可为亚氨基亚烷基、羰基亚烷基亚氨基、亚氨基亚环烷基和羰基亚环烷基亚氨基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代，所述可释放接头连接到氮上形成腙。在替代构型中，所述腙可用羧酸衍生物、原甲酸酯衍生物或氨基甲酰基衍生物酰化形成各种酰腙可释放接头。
或者，所述杂原子接头可为氧，所述可释放接头可为亚烷基(二烷基甲硅烷基)、亚烷基(烷基芳基甲硅烷基)、亚烷基(二芳基甲硅烷基)、(二烷基甲硅烷基)芳基、(烷基芳基甲硅烷基)芳基和(二芳基甲硅烷基)芳基，其中每个所述可释放接头任选被如下定义的取代基X2取代，所述可释放接头连接到氧上形成甲硅烷醇。
在上述可释放接头实施方案中，所述药物可包括氮原子，所述杂原子接头可为氮，所述可释放接头可为羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基，所述可释放接头可连接到杂原子氮上形成酰胺，也连接到所述药物氮上形成酰胺。
在上述可释放接头实施方案中，所述药物可包括氧原子，所述杂原子接头可为氮，所述可释放接头可为羰基芳基羰基、羰基(羧基芳基)羰基、羰基(双羧基芳基)羰基，所述可释放接头可连接到所述杂原子接头氮上形成酰胺，也可连接到所述药物氧上形成酯。
所述取代基X2可为烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、卤素、卤代烷基、巯基烷基、烷基硫基烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、杂芳基、取代杂芳基、羧基、羧基烷基、烷基羧酸酯基、烷基烷酸酯基、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-酰氨基和R7-酰氨基烷基，其中R4和R5各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽，并且其中R6和R7各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽。在该实施方案中，所述杂原子接头可为氮，所述取代基X2和所述杂原子接头可与连接它们的间隔接头结合在一起形成杂环。
所述杂环可为吡咯烷、哌啶、唑烷、异唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吡咯烷酮、哌啶酮、唑烷酮、异唑烷酮、噻唑烷酮、异噻唑烷酮和琥珀酰亚胺。
所述药物可为丝裂霉素、丝裂霉素衍生物或丝裂霉素类似物，在该实施方案中，所述可释放接头选自羰基烷基硫基、羰基四氢-2H-吡喃基、羰基四氢呋喃基、1-(羰基四氢-2H-吡喃基)琥珀酰亚胺-3-基和1-(羰基四氢呋喃基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个所述可释放接头任选被一个取代基X2取代，其中所述丝裂霉素的氮丙啶连接到所述可释放接头上形成酰基氮丙啶。
所述药物可包括氮原子，所述可释放接头可为任选被取代基X2取代的卤代亚烷基羰基，所述可释放接头连接到所述药物氮上形成酰胺。
所述药物可包括氧原子，所述可释放接头可为任选被取代基X2取代的卤代亚烷基羰基，所述可释放接头连接到所述药物氧上形成酯。
所述药物可包括双键氮原子，在该实施方案中，所述可释放接头可为亚烷基羰基氨基和1-(亚烷基羰基氨基)琥珀酰亚胺-3-基，所述可释放接头可连接到所述药物氮上形成腙。
所述药物可包括硫原子，在该实施方案中，所述可释放接头可为亚烷基硫基和羰基烷基硫基，所述可释放接头可连接到所述药物硫上形成二硫化物。
维生素可为包括氮原子的叶酸，在该实施方案中，所述间隔接头可为亚烷基羰基、亚环烷基羰基、羰基烷基羰基、1-亚烷基琥珀酰亚胺-3-基、1-(羰基烷基)琥珀酰亚胺-3-基，其中每个所述间隔接头任选被取代基X1取代，所述间隔接头连接到叶酸氮上形成二酰亚胺或烷基酰胺。在该实施方案中，所述取代基X1可为烷基、羟基烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、巯基烷基、烷基硫基烷基、芳基、取代芳基、芳基烷基、取代芳基烷基、羧基、羧基烷基、胍基烷基、R4-羰基、R5-羰基烷基、R6-酰氨基和R7-酰氨基烷基，其中R4和R5各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽，并且其中R6和R7各自独立选自氨基酸、氨基酸衍生物和肽。
本文所用的术语“烷基”是指可任选分支的单价线性碳原子链，例如甲基、乙基、丙基、3-甲基戊基等。
本文所用的术语“环烷基”是指其中一部分形成环的单价碳原子链，例如环丙基、环己基、3-乙基环戊基等。
本文所用的术语“亚烷基”是指可任选分支的二价线性碳原子链，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、3-甲基亚戊基等。
本文所用的术语“亚环烷基”是指其中一部分形成环的二价碳原子链，例如环丙-1，1-二基、环丙-1，2-二基、环己-1，4-二基、3-乙基环戊-1，2-二基、1-亚甲基环己-4-基等。
本文所用的术语“杂环”是指单价碳和杂原子链，其中所述杂原子选自氮、氧和硫，其中包括至少一个杂原子的一部分形成环，例如氮丙啶、吡咯烷、唑烷、3-甲氧基吡咯烷、3-甲基哌嗪等。
本文所用的术语“烷氧基”是指与端基氧结合的本文定义的烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、3-甲基戊氧基等。
术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。
本文所用的术语“芳基”是指碳原子的芳族单环或多环，例如苯基、萘基等。
本文所用的术语“杂芳基”是指碳原子和至少一个杂原子的芳族单环或多环，所述杂原子选自氮、氧和硫，例如吡啶基、嘧啶基、吲哚基、苯并唑基等。
本文所用的术语“取代芳基”或“取代杂芳基”是指被一个或多个所选的取代基例如卤素、羟基、氨基、烷基或二烷基氨基、烷氧基、烷基磺酰基、氰基、硝基等取代的芳基或杂芳基。
本文所用的术语“亚氨基亚烷基”是指含有本文定义的亚烷基和氮原子的二价基，其中所述亚烷基的端基碳原子双价键合到氮原子上，例如式-(CH)＝N-、-(CH2)2(CH)＝N-、-CH2C(Me)＝N-等等。
本文所用的术语“氨基酸”通常是指氨基烷基羧酸酯，其中所述烷基任选被烷基、羟基烷基、巯基烷基、氨基烷基、羧基烷基等取代，包括与对应于天然氨基酸的基团，例如丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等。
本文所用的术语“芳基烷基”是指被被本文定义的亚烷基取代的本文定义的芳基，例如苯甲基、苯乙基、α-甲基苯甲基等。
应该理解，上述术语可组合产生化学相关基团，例如“烷氧基烷基”是指甲氧基甲基、乙氧基乙基等，“卤代烷氧基烷基”是指三氟甲氧基乙基、1，2-二氟-2-氯代乙-1-基氧基丙基等。
本文所用的术语“氨基酸衍生物”一般指氨基烷基羧酸酯，其中氨基或羧酸酯基各自任选被烷基、羧基烷基、烷基氨基等取代或任选被保护；中间的二价烷基片段任选被烷基、羟基烷基、巯基烷基、氨基烷基、羧基烷基等取代，包括与天然存在的氨基酸中存在的侧链对应的基团，例如丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等中存在的基团。
本文所用的术语“肽”一般是指一系列通过酰胺键相互共价连接的氨基酸和氨基酸类似物和衍生物。
所述可释放接头包括至少一个在生理条件下可断裂的键(例如pH不稳定键、酸不稳定键、氧化不稳定或酶不稳定键)。一个或多个可裂解键可存在于可裂解接头内部和/或可裂解接头的一或两端。不言而喻，所述可裂解键的不稳定性可通过将能够促进或易化这种键断裂的官能团或片段包括在二价接头L内来调整，也称为邻位促进。此外，不言而喻，额外的官能团或片段可包括在二价接头L内，该二价接头能够促进或易化所述维生素受体的额外片段在所述可释放接头的键断裂后结合药物缀合物。
说明性的可释放接头的键裂解机理包括如下的氧促进裂解
其中Z为维生素或其类似物或衍生物，或药物或其类似物或衍生物，或各自为与二价接头的其它部分连接的维生素或药物部分，例如包括一个或多个间隔接头、杂原子接头和/或其它可释放接头的药物或维生素部分。在该实施方案中，氨基甲酸酯的酸催化的消除导致CO2的释放和含氮部分连接到Z上，以及可被水或任何其它路易斯碱捕获的苯甲基阳离子的形成。
另一说明性的连接到可释放接头上或者包含其中的键裂解机理，可形成部分二价接头L，包括如下的β消除和联乙烯β消除机理
其中X为亲核试剂、GSH、谷胱甘肽或生物还原剂等，Z或Z′为维生素或其类似物或衍生物，或药物或其类似物或衍生物，或为与二价接头的其它部分连接的维生素或药物部分。不言而喻，所述键裂解也可通过氨基甲酸酯部分的酸催化消除而发生，可通过由上述实例中的β硫的芳基或二硫化物提供的稳定化被邻位促进。在这些实施方案的修改方案中，所述可释放接头为氨基甲酸酯部分。
另一说明性机理涉及可释放接头、间隔接头和杂原子接头以这种方式的重排二价接头中的键裂解后，释放的官能团化学促进其它键的断裂或裂解，也称为邻位促进裂解或断裂。这种二价接头或其部分的说明性的实施方案包括具有下式的化合物
其中X为杂原子，例如氮、氧或硫，n为选自0、1、2和3的整数，R为氢或取代基，包括能够通过诱导或通过在芳环上的共振稳定正电荷的取代基，例如烷氧基等，并且Z或Z′为维生素或其类似物或衍生物，或药物或其类似物或衍生物，或为与二价接头的其它部分连接的维生素或药物部分。不言而喻，其它取代基包括但不限于羟基、烷基、烷氧基、烷硫基、卤素等可存在于芳环、苯甲基碳、氨基甲酸酯氮、烷酸或亚甲基桥上。促进裂解可包括涉及苯甲中间体、苯炔中间体、内酯环化、氧中间体、β-消除等的机理。同样，除在可释放接头裂解之后的裂解外，可释放接头的初始裂解也可通过邻位促进机理易化。
在该实施方案中，可为环状的羟基烷酸易化亚甲基桥的裂解，其方式为通过例如氧离子，并易化所述可释放接头的键裂解或键裂解后的片段化。或者，亚甲基桥的酸催化的氧离子促进裂解可启动此说明性接头或其片段的片段化级联反应。或者，氨基甲酸酯的酸催化的水解可易化可为环状的羟基烷酸的β消除，并通过例如氧离子易化亚甲基桥的裂解。不言而喻，其它在本文描述代谢、生理性或细胞条件下的键断裂或裂解的化学机理可启动这种片段化级联。
本文所述的递药缀合物可通过本领域认可的合成方法制备。所述合成方法的选择取决于杂原子接头的选择，所述官能团存在于所述间隔接头和所述可释放接头上。一般而言，相关键形成反应描述于Richard C.Larock，″Comprehensive Organic Transformations，a guideto functional group preparations，″VCH Publishers，Inc.New York(1989)，和Theodora E.Greene & Peter G.M.Wuts，″Protective Groupsion Organic Synthesis，″第二版，John Wiley & Sons，Inc.New York(1991)，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。
常规酰胺和酯的形成 例如，其中所述杂原子接头为氮原子，存在于间隔接头或可释放接头上的末端官能团为羰基，如方案1所示，所需的酰胺基可通过相应羧酸或衍生物的偶联反应或酰化反应得到，其中L为适当选择的离去基团例如卤素、三氟甲磺酰氧基(triflate)、五氟苯氧基、三甲基甲硅烷氧基、琥珀酰亚胺-N-氧基等，以及胺。
方案1
偶联试剂包括DCC、EDC、RRDQ、CGI、HBTU、TBTU、HOBT/DCC、HOBT/EDC、BOP-Cl、PyBOP、PyBroP等。或者，母体酸可被转化成活化的羰基衍生物，例如酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯基酯等。成酰胺反应也可在碱如三乙胺、二异丙基乙胺、N，N-二甲基-4-氨基吡啶等存在下进行。本文所述合适的成酰胺溶剂包括CH2Cl2、CHCl3、THF、DMF、DMSO、乙腈、EtOAc等。说明性地，所述酰胺可在范围为约-15℃至约80℃，或约0℃至约45℃温度下制备。酰胺可由例如含氮氮丙啶环、糖类和α-卤代羧酸制备。适用于成酰胺的说明性羧酸衍生物包括具有下式
等的化合物，其中n为整数如1、2、3或4。
同样，其中所述杂原子接头为氧原子，存在于间隔接头或可释放接头上的末端官能团为羰基，所需的酯基可通过相应羧酸或衍生物与醇的偶联反应得到。
偶联试剂包括DCC、EDC、CDI、BOP、PyBOP、氯甲酸异丙烯酯、EEDQ、DEAD、PPh3等。溶剂包括CH2Cl2、CHCl3、THF、DMF、DMSO、乙腈、EtOAc等。碱包括三乙胺、二异丙基-乙胺和N，N-二甲基-4-氨基吡啶。或者，母体酸可被转化成活化的羰基衍生物，例如酰氯、N-羟基琥珀酰亚胺基酯、五氟苯基酯等。
常规缩酮和缩醛的形成 此外，其中所述杂原子接头为氧原子，存在于间隔接头或可释放接头上的末端官能团为1-烷氧基烷基，如方案2所示，所需缩醛或缩酮基团可通过相应醇和烯醇醚的缩酮和缩醛形成反应制备。
方案2
R1＝H或烷基 R2＝烷基 溶剂包括乙醇、CH2Cl2、CHCl3、THF、乙醚、DMF、DMSO、乙腈、EtOAc等。这种缩醛和缩酮的形成可用酸催化剂完成。其中所述杂原子接头包含两个氧原子，所述可释放接头为任选被本文所述的基团X2取代的亚甲基，如方案3所示，所需的对称缩醛或缩酮基可由相应的醇和醛或酮通过缩醛和缩酮形成反应而形成。
方案3
或者，其中亚甲基被任选取代的芳基取代，所需缩醛或缩酮可分步制备，其中L为适当选择的离去基团如卤素、三氟乙酰氧基、三氟甲磺酰氧基等，如方案4所示。方案4所述方法为常规制备，一般遵循R.R.Schmidt等，Chem.Rev.，2000，100，4423-42所综述的步骤，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。
方案4
所得的芳基烷基醚用氧化剂如DDQ等处理，产生中间体氧离子，接着用另一种醇处理以产生缩醛或缩酮。
常规琥珀酰亚胺的形成 此外，其中所述杂原子接头为如氮原子、氧原子或硫原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为琥珀酰亚胺衍生物，如方案5所示，所得的碳-杂原子键可通过相应胺、醇或硫醇和顺丁烯二酰亚胺衍生物的迈克尔加成形成，其中X为杂原子接头。
方案5
X＝O，NR，S 形成迈克尔加成的溶剂包括THF、EtOAc、CH2Cl2、DMF、DMSO、H2O等。这种迈克尔加成化合物的形成可用加入等摩尔量的碱如三乙胺、Hünig碱或通过调节水溶液的pH至6.0-74来完成。不言而喻，当所述杂原子接头为氧或氮原子时，可调节反应条件来易化迈克尔加成，例如通过采用较高反应温度、加入催化剂、使用极性较强的溶剂如DMF、DMSO等，以及用硅烷基化试剂活化顺丁烯二酰亚胺。
常规甲硅烷氧基的形成 此外，其中所述杂原子接头为氧原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为甲硅烷基衍生物，如方案6所示，所需的甲硅烷氧基可通过使相应的甲硅烷基衍生物和醇反应来形成，其中L为适当选择的离去基团如卤素、三氟乙酰氧基、三氟甲磺酰氧基等。
方案6
甲硅烷基衍生物包括适当官能化的甲硅烷基衍生物，例如乙烯基磺酰基烷基二芳基，或二芳基，或烷基芳基甲硅烷基氯化物。可用β-氯代乙磺酰基烷基前体替代乙烯基磺酰基烷基。任何质子惰性和无水溶剂以及任何含氮碱可用作反应介质。在该转化中的温度范围可以在-78℃至80℃之间变动。
常规腙的形成 此外，其中所述杂原子接头为氮原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为亚氨基衍生物，分别如方案7反应式(1)和(2)所示，所需的腙基可通过使相应的醛或酮和肼或酰肼衍生物反应来形成。
方案7
可用的溶剂包括THF、EtOAc、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、DMF、DMSO、MeOH等。在该转化中使用的温度范围可介于0℃至80℃之间。可用任何酸性催化剂如矿物酸、H3CCOOH、F3CCOOH、p-TsOH·H2O、对甲苯磺酸吡啶等。就反应式(2)中酰腙而言，所述酰腙可通过用合适的羧酸或衍生物开始酰化肼来制备，如上述方案1所概述，随后使酰肼与相应的醛或酮反应形成酰腙。或者，所述腙官能团可通过使肼与相应的醛或酮反应开始形成。所得的腙可随后用合适的羧酸或衍生物酰化，如上述方案1所概述。
常规二硫化物的形成 此外，其中所述杂原子接头为硫原子，存在于可释放接头上的官能团为亚烷基硫醇衍生物，如方案8所示，所需的二硫化物基团可通过使相应的烷基或芳基磺酰基硫基烷基衍生物或相应的杂芳基二硫基烷基衍生物如吡啶-2-基二硫基烷基衍生物等与亚烷基硫醇衍生物反应形成。
方案8
可用的溶剂为THF、EtOAc、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、DMF、DMSO等。在该转化中使用的温度范围可在0℃至80℃之间变动。所需的烷基或芳基磺酰基硫基烷基衍生物可用本领域认可的方案制备，也可根据Ranasinghe和Fuchs，Synth.Commun.18(3)，227-32(1988)的方法制备，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。其它不对称二烷基二硫化物的制备方法基于不对称杂芳基-烷基二硫化物例如2-硫基吡啶基、3-硝基-2-硫基吡啶基和类似的二硫化物与烷基硫醇的转硫醇作用，如WO 88/01622、欧洲专利申请0116208A1和美国专利4,691,024所述，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。
常规碳酸酯的形成 此外，其中所述杂原子接头为氧原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为烷氧基羰基衍生物，如方案9所示，所需的碳酸酯基可通过使相应的羟基取代的化合物与活化的烷氧基羰基衍生物反应来形成，其中L为合适的离去基团。
方案9
可用的溶剂为THF、EtOAc、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、DMF、DMSO等。在该转化中使用的温度范围可在0℃至80℃之间变动。任何碱性催化剂例如无机碱、胺碱、聚合物结合碱等可用于易化所述反应。
常规缩氨基脲的形成 此外，其中所述杂原子接头为氮原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为亚氨基衍生物，存在于其它间隔接头或其它可释放接头上的官能团为烷基氨基或芳基氨基羰基衍生物，如方案10所示，所需的缩氨基脲基可通过相应的醛或酮和氨基脲衍生物反应来形成。
方案10
可用的溶剂为THF、EtOAc、CH2Cl2、CHCl3、CCl4、DMF、DMSO、MeOH等。在该转化中使用的温度范围可在0℃至80℃之间变动。可用任何酸性催化剂如矿物酸、H3CCOOH、F3CCOOH、p-TsOH·H2O、对甲苯磺酸吡啶等。此外，在形成缩氨基脲方面，所述腙官能团可通过使肼与相应的醛或酮反应开始形成。所得的腙可随后用异氰酸酯或氨基甲酰基衍生物例如氨基甲酰卤酰化，得到缩氨基脲。或者，相应的氨基脲可通过使肼与异氰酸酯或氨基甲酰基衍生物例如氨基甲酰卤反应，形成氨基脲。随后氨基脲可以与相应的醛或酮反应形成缩氨基脲。
常规磺酸酯的形成 此外，其中所述杂原子接头为氧原子，存在于间隔接头或可释放接头上的官能团为磺酰基衍生物，如方案11所示，所需的磺酸酯基可通过使相应的羟基取代的化合物来形成与活化的磺酰基衍生物反应，其中L为合适的离去基团如卤素等。
方案11
可用的溶剂为THF、EtOAc、CH2Cl2、CHCl3、CCl4等。在该转化中使用的温度范围可在0℃至80℃之间变动。任何碱性催化剂例如无机碱、胺碱、聚合物结合碱等可用于易化所述反应。
常规叶酸-肽的形成 含叶酸肽基片段Pte-Glu-(AA)n-NH(CHR2)CO2H(3)通过聚合物支持的连续方法，用标准方法例如Fmoc-策略，在酸敏感Fmoc-AA-Wang树脂(1)上制备，如方案12所示。
方案12
(a)20％哌啶/DMF；(b)Fmoc-AA-OH，PyBop，DIPEA，DMF；(c)Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；(d)1.N10(TFA)-Pte-OH；PyBop，DIPEA，DMSO；(e)TFAA，(CH2SH)2，i-Pr3SiH；(f)NH4OH，pH 10.3. 在本文所述方法的说明性实施方案中，R1为Fmoc，R2为所需的适当保护的氨基酸侧链，DIPEA为二异丙基乙胺。可用标准偶联方法，例如PyBOP和其它本文所述或本领域已知方法，其中偶联剂说明性地用作活化试剂以确保有效偶联。Fmoc保护基在每次偶联步骤之后，在标准条件下除去，所述标准条件例如用哌啶、氟化四丁基铵(TBAF)等处理。如方案12所示，可用适当保护的氨基酸构件，例如Fmoc-Glu-OtBu、N10-TFA-Pte-OH等，并以步骤(b)中Fmoc-AA-OH为代表。因此，AA是指任何适当保护的氨基酸原料。不言而喻，本文所用的术语氨基酸是指任何具有被一个或多个碳分隔的胺和羧酸官能团，并包括天然存在的α和β氨基酸，以及这些氨基酸的衍生物和类似物。通常，具有侧链的被保护氨基酸如被保护的丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸酯等也可用于本文所述的叶酸-肽的合成。此外，γ、δ或更长的同源氨基酸，也可作为原料包括在本文所述叶酸-肽合成中。此外，具有同源侧链的氨基酸类似物或分支结构，如正亮氨酸、异缬氨酸、β-甲基苏氨酸、β-甲基半胱氨酸、β，β-二甲基半胱氨酸等也可作为原料包括在本文所述叶酸-肽合成中。
涉及Fmoc-AA-OH的偶联序列(步骤(a)和(b))进行“n”次，以制备固体支持肽2，其中n为整数并可为0至约100。最后的偶联步骤之后，除去剩余的Fmoc基(步骤(a))，所述肽接着偶联到谷氨酸衍生物上(步骤(c))，脱保护，并偶联到TFA-保护的蝶酸上(步骤(d))。随后，所述肽通过用三氟乙酸、乙二硫醇和三异丙基甲硅烷处理，从聚合物载体上切下(步骤(e))。这些反应条件导致t-Bu、t-Boc和Trt保护基同时去除，所述保护基可形成部分适当保护的氨基酸侧链。所述TFA保护基通过用碱处理(步骤(f))除去，得到含叶酸肽基片段3。
间隔接头和可释放接头，以及所述杂原子接头可以不同方式组合。举例说明，所述接头通过杂原子接头相互连接，例如亚烷基--氨基--亚烷基羰基、亚烷基--硫基--羰基烷基琥珀酰亚胺-3-基等，如下式进一步所述，其中整数x和y为1、2、3、4或5
另一本文所述接头的说明性的实施方案，包括可释放接头，该接头在本文所述条件下，通过涉及β-消除的化学机理来裂解。一方面，这种可释放接头包括β-硫基、β-羟基和β-氨基取代羧酸及其衍生物，例如酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。另一方面，这种可释放接头包括2-和4-硫基芳基酯、氨基甲酸酯和碳酸酯。
此外，维生素或药物与杂原子接头的连接可通过存在于已经转化成杂原子接头的药物或维生素上的反应性官能团制成，例如阿克拉霉素(aclamycin)酮转化成相应的腙，叶酸转化成相应的酰胺等，如下式所说明
二价接头(L)包含一个或多个选自间隔接头、可释放接头、杂原子接头及其以任何次序组合的组分。例如，考虑了表1和表2中举例说明的间隔接头、可释放接头和杂原子接头及其组合。这些接头的目录不是全面性的，仅仅是说明性的并且不得解释为对本文所述发明的限制。位于上述结构前的星号以及示于表1和表2的星号，等同于额外间隔接头、可释放接头或杂原子接头的说明性连接点，或为所述维生素受体结合递药缀合物的药物或维生素组分的说明性连接点。不言而喻，二价接头L包含一个或多个间隔接头、可释放接头和杂原子接头，包括表1和表2中举例说明的那些接头，并且这种间隔接头、可释放接头和杂原子接头可以任何次序组合以形成二价接头L。
表1.设计的接头，及某些间隔接头和杂原子接头的组合

表2.设计的接头，及某些可释放接头和杂原子接头的组合

本发明递药缀合物也可由中间体制备。在一个实施方案中，可制备下式的化合物 V-L-Z1 其中Z1为适用于易化药物或其类似物或衍生物的连接的亲电试剂、亲核试剂或前体。
一方面，Z1可为离去基团，其可使药物的连接通过存在于药物或其类似物或衍生物上的亲核残基如氮等杂原子进行。
另一方面，Z1可为亲核试剂，例如氮等杂原子，其能够置换存在于药物或其类似物或衍生物上的离去基团，例如酰氯等羧酸衍生物。
另一方面，Z1可为前体，例如能够经还原反应制成亲核氮的硝基，或能够由连续水解和氯化制成亲电酰氯的酯。不言而喻，Z1可为杂原子接头。
在另一实施方案中，所述递药缀合物可由以下中间体制备 Z2-L-D 其中Z2为适用于易化维生素或其类似物或衍生物的连接的亲电试剂、亲核试剂或前体。
一方面，Z1可为离去基团，其可使维生素的连接通过存在于维生素或其类似物或衍生物上的亲核残基如氮等杂原子进行。
另一方面，Z1可为亲核试剂，例如氮等杂原子，其能够置换存在于维生素或其类似物或衍生物上的离去基团，例如酰氯等羧酸衍生物。
另一方面，Z1可为前体，例如能够经还原反应制成亲核氮的硝基，或能够由连续水解和氯化制成亲电酰氯的酯。不言而喻，Z2可为杂原子接头。
在另一实施方案中，二价接头(L)可分别合成，然后在后续步骤中连接到维生素和药物上，例如通过制备下式的中间体化合物 Z1-L-Z2 其中Z1和Z2各自独立选择，并如上定义。
本发明递药缀合物可适用于人临床医学和兽医应用。因此，含有所述致病细胞群体的和用所述维生素受体结合递药缀合物治疗的宿主动物可为人，或在兽医应用情况下可为实验室动物、农牧牲畜、家畜或野生动物。本发明可应用于的宿主动物包括但不限于人，实验室动物如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔、猴、黑猩猩，驯养动物如狗、猫和兔，农牧动物如牛、马、猪、羊、山羊，以及圈养的野生动物如熊、熊猫、狮、虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸。
本发明适用于引起这些宿主动物体内各种病变的致病细胞群体。根据本发明“致病细胞”是指癌细胞、感染因子如细菌和病毒、细菌或病毒感染的细胞、能够引起疾病状态的活化巨噬细胞和任何其它独特表达、优先表达或过量表达维生素受体或结合维生素类似物或衍生物的受体的致病细胞。致病细胞也可包括任何其引起的疾病，用本发明所述维生素受体结合递药缀合物治疗，导致所述疾病症状减轻的细胞。例如，所述致病细胞可为在一些情况下具致病性，但在其它情况下不具致病性的宿主细胞，例如引起移植物抗宿主病的免疫系统细胞。
因此，致病细胞群体可为致瘤(包括良性肿瘤和恶性肿瘤)的癌细胞群体，也可为不致瘤的。所述癌细胞群体可自发产生或者由于诸如存在于宿主动物生殖系中的突变或体细胞突变之类的过程产生，或其可通过化学、病毒或放射诱导产生。本发明可用于治疗诸如癌、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgekin′s disease)、黑素瘤、间皮瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、鼻咽癌、白血病和骨髓瘤之类的癌。所述癌细胞群体可包括但不限于口腔癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、皮肤癌、胃癌、食管癌、喉癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、骨癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、肝癌和肺癌。
在致病细胞群体为癌细胞群体的实施方案中，缀合物给药的效果为由减少或消除肿瘤块或抑制肿瘤细胞增殖测定的治疗反应。就肿瘤而言，消除可为原发性肿瘤细胞的消除，或为已经转移的或为在从原发性肿瘤分离过程中细胞的消除。用所述维生素受体结合递药缀合物预防性治疗，以防止肿瘤在由任何治疗方法，包括手术切除肿瘤、放疗、化疗或生物疗法去除之后复发，也根据本发明做了仔细考虑。所述预防性治疗可为用递药缀合物的初期治疗，例如以每天多剂量方案的治疗，和/或可为初期治疗后间隔几天或几月后的附加治疗或系列治疗。因此，根据本发明处理的致病细胞群体的消除，包括减少致病细胞数量、抑制致病细胞增殖、防止致病细胞复发的预防性治疗或引起疾病症状减轻的致病细胞的治疗。
在癌细胞要消除的情况下，本发明的方法可联用手术切除肿瘤、放疗、化疗或生物疗法，例如其它免疫疗法，包括但不限于单克隆抗体疗法、用免疫抑制剂治疗、免疫效应细胞的继承性转移、用造血生长因子、细胞因子和疫苗治疗。
本发明也适用于引起各种感染性疾病的致病细胞群体。例如，本发明适用于诸如细菌、包括酵母的真菌、病毒、病毒感染细胞、支原体和寄生虫之类的致病细胞群体。可用本发明递药缀合物治疗的感染性生物体为任何引起动物发病的本领域认可的感染性生物体，包括诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性球菌或杆菌之类的生物体。例如，变形杆菌(Proteus sp.)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella sp.)、普罗威登斯菌(Providencia sp.)、耶尔森氏菌(Yersinia sp.)、欧文氏菌(Erwiniasp.)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、沙雷氏菌(Serratia sp.)、气杆菌(Aerobacter sp.)、埃希氏菌(Escherichia sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、志贺氏菌(Shigella sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、气单胞菌(Aeromonas sp.)、弯曲杆菌(Campylobacter sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)、微球菌Micrococcus sp.)、摩拉克氏菌(Moraxellasp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、梭状芽孢杆菌(Clostridium sp.)、棒状杆菌(Corynebacterium sp.)、埃氏菌(Eberthella sp.)、微球菌Micrococcussp.)、分枝杆菌(Mycobacterium sp.)、奈瑟氏菌(Neisseria sp.)、嗜血杆菌(Haemophilus sp.)、拟杆菌(Bacteroides sp.)、李斯特氏菌(Listeriasp.)、丹毒丝菌(Erysipelothrix sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、布鲁氏菌(Brucella sp.)、巴斯德氏菌(Pasteurella sp.)、弧菌(Vibrio sp.)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)、梭杆菌(Fusobacterium sp.)、链杆菌(Streptobacillus sp.)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium sp.)、军团菌(Legionella sp.)、密螺旋体(Treponema sp.)、疏螺旋体(Borrelia sp.)、钩端螺旋体(Leptospira sp.)、放线菌(Actinomyces sp.)、诺卡氏菌(Nocardia sp.)、立克次氏体(Rickettsia sp.)和任何其它引起宿主中可用本发明递药缀合物治疗的疾病的细菌。
特别有趣的是，具抗生素抗性的细菌如抗生素抗性链球菌和葡萄球菌，或对抗生素敏感但引起用抗生素治疗的复发感染以致最终发展成耐药生物体的细菌。对抗生素敏感但引起用抗生素治疗的复发感染以致最终发展成耐药生物体的细菌，可用本发明递药缀合物在抗生素不存在的情况下治疗，或与比正常情况下给予患者的剂量低的抗生素联用，以避免这些抗生素耐药菌株的发展。
病毒，例如DNA和RNA病毒，也可根据本发明治疗。这类病毒包括但不限于DNA病毒如乳头瘤病毒(papilloma viruses)、细小病毒(parvoviruses)、腺病毒(adenoviruses)、疱疹病毒(herpesviruses)和牛痘病毒(vaccina viruses)，以及RNA病毒如沙粒病毒(arenaviruses)、冠状病毒(coronaviruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial viruses)、流感病毒(influenza viruses)、细小核糖核酸病毒(picornaviruses)、副粘病毒(paramyxoviruses)、呼肠孤病毒(reoviruses)、逆转录病毒(retroviruses)、慢性病毒(lentiviruses)和弹状病毒(rhabdoviruses)。
本发明也适用于任何真菌，包括酵母(yeast)、支原体(mycoplasmasp.)、寄生虫(parasite)或其它引起动物疾病的感染性生物体。可用本发明方法和组合物治疗的真菌的实例包括像霉一样生长或为酵母样的真菌，例如包括引起诸如下列疾病的真菌癣、组织胞浆菌病、芽生菌病、曲霉病、隐球菌病、孢子丝菌病、球孢子菌病、类球孢子菌病、毛霉菌病、着色芽生菌病、皮肤真菌病、原壁菌病、镰刀菌病、糠疹、足分枝菌病、巴西芽生菌病、暗色丝孢霉病、假性阿利什利菌病、孢子丝菌病、毛孢子菌病、肺囊虫感染和念珠菌病。
本发明也可用来治疗寄生虫感染，包括但不限于下列生物体引起的感染绦虫(tapeworms)，例如绦虫(Taenia sp.)、膜壳绦虫(Hymenolepsis sp.)、裂头绦虫(Diphyllobothrium sp.)和棘球绦虫(Echinococcus sp.)；吸虫(flukes)，例如姜片虫(Fasciolopsis sp.)、异形吸虫(Heterophyes sp.)、后殖吸虫(Metagonimus sp.)、支睾吸虫(Clonorchis)、片吸虫(Fasciola sp.)、并殖吸虫(Paragonimus sp.)和血吸虫(Schitosoma sp.)；线虫(roundworms)，例如蛲虫(Enterobius sp.)、鞭虫(Trichuris sp.)、蛔虫(Ascaris sp.)、钩虫(Ancylostoma sp.)、板口线虫(Necator sp.)、类圆线虫(Strongyloides sp.)、毛线虫(Trichinellasp.)、吴策线虫(Wuchereria sp.)、布鲁丝虫(Brugia sp.)、罗阿丝虫(Loasp.)、盘尾丝虫(Onchocerca sp.)和龙线虫(Dracunculus sp.)；阿米巴(ameba)，例如纳氏虫(Naegleria sp.)和棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)；和原虫(protozoans)，例如疟原虫(Plasmodium sp.)、锥虫(Trypanosomasp.)、利什曼原虫(Leishmania sp.)、弓形虫(Toxoplasma sp.)、内变形虫(Entamoeba sp.)、贾第虫(Giardia sp.)、等孢子球虫(Iospora sp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium sp.)和肠胞虫(Enterocytozoon sp.)。
本发明递药缀合物所涉及的致病细胞也可为包含内源性病原体的细胞，例如病毒、支原体、寄生虫或细菌感染的细胞，条件是这些细胞优先表达维生素受体。
在一个实施方案中，维生素受体结合递药缀合物可通过结合维生素部分到维生素受体、转运蛋白或其它特异性结合维生素且优先在致病细胞上表达的表面存在蛋白上，内化到靶向致病细胞中。例如，这种内化可通过受体介导的胞吞作用发生。如果递药缀合物含有可释放接头，则维生素部分和药物可在胞内分离，药物可对其胞内靶起作用。
在一个备选实施方案中，递药缀合物的维生素部分可结合到致病细胞上，使药物与致病细胞表面紧密结合。所述药物可随后通过可释放接头的裂解被释放。例如，如果所述可释放接头为二硫基，则所述药物可被蛋白二硫化物异构酶释放。所述药物可随后被所述维生素受体结合递药缀合物结合在其上的致病细胞摄取，或所述药物可被另一紧邻该细胞的致病细胞摄取。或者，所述药物可被细胞内部的蛋白二硫化物异构酶释放，其中所述可释放接头为二硫基。所述药物也可通过水解机理释放，例如酸催化水解，如以上某些β消除机理所述，或由邻位促进裂解通过氧离子或内酯离子产生机理释放。对一个或多个可释放接头的选择取决于药物从缀合物中释放的机理。不言而喻，这种选择可被药物缀合物的使用条件提前定义。
在另一所述接头不包含可释放接头的实施方案中，所述递药缀合物维生素部分可结合到致病细胞上，使药物置于致病细胞表面以通过能够结合到药物上的其它分子定向要攻击的致病细胞。或者，在该实施方案中，所述递药缀合物可通过结合内化到靶向细胞中，并且所述维生素部分和所述药物可保持细胞内连接，其中所述药物发挥其效应而不需从所述维生素部分分离。
在又一实施方案中，或与上述实施方案组合，所述维生素受体结合递药缀合物可通过不依赖于细胞内维生素受体的机理起作用。例如，所述递药缀合物可结合到存在于血清中或附着于血清蛋白上的可溶性维生素受体上，导致所述缀合物的循环相对于未缀合药物延长，并导致所述缀合物针对致病细胞群体的活性相对于未缀合药物提高。
在本发明另一实施方案中，提供通式V-L-D的维生素受体结合递药缀合物。L选自(ls)a、(lH)b及其组合，其中(ls)a、(lH)b和V如本文所定义，D为药物如免疫原。所述免疫原可为半抗原，例如荧光素、二硝基苯基等。在该实施方案中，所述维生素受体结合递药缀合物结合到所述致病细胞表面，并用免疫原“标记”细胞，由此触发针对标记的致病细胞群体的免疫反应。在被动免疫中给予宿主的抗体，或存在于宿主系统中先天的或从获得性免疫得来的抗体，结合到免疫原上，触发内源性免疫反应。结合到细胞-结合维生素-免疫原缀合物上的抗体，引起补体介导的细胞毒性、抗体-依赖的细胞介导的细胞毒性、抗体调理素作用和吞噬作用、抗体诱导的受体群集信号传导细胞死亡或休眠或任何其它由抗体结合到细胞-结合配体-免疫原缀合物刺激的体液或细胞免疫反应。在免疫原可被免疫细胞直接识别而无需先前的抗体调理素作用的情况下，可发生致病细胞的直接致死。该实施方案的更详细描述见美国专利申请09/822,379，该专利通过引用结合到本文中。不言而喻，在其中药物为免疫原的某些该实施方案的修改中，二价接头也可包括可释放接头，如上所述，例如通式V-L-D的维生素受体结合递药缀合物，其中L选自(ls)a、(lH)b、(lr)c及其组合，其中(ls)为间隔接头，(lH)为杂原子接头，(lr)为可释放接头，V为维生素或其类似物或衍生物，a、b和c为整数。
本文所述维生素受体结合递药缀合物包含维生素受体结合部分、二价接头(L)、药物和任选的连接所述维生素受体结合部分和所述药物到二价接头(L)上的杂原子接头。二价接头(L)可包含间隔接头、可释放(即可裂解)接头和杂原子接头或其组合。
本文所述维生素受体结合递药缀合物可由非常大量的维生素或受体结合维生素类似物/衍生物、接头和药物制备。本发明递药缀合物能够选择性靶向宿主动物体内的致病细胞群体，原因在于适用于维生素结合的维生素受体优先在致病细胞上表达。说明性的维生素部分包括卡尼汀、肌醇、硫辛酸、吡哆醛、抗坏血酸、烟酸、泛酸、叶酸、核黄素、硫胺素、生物素、维生素B12，以及脂溶性维生素A、D、E和K。这些维生素及其受体结合类似物和衍生物，构成靶向实体，所述实体可与所述药物通过二价接头(L)偶联以形成本文所述维生素受体结合递药缀合物。因此，术语“维生素”包括维生素类似物和/或衍生物(例如为叶酸衍生物的蝶酸、生物素类似物例如生物胞素、生物素亚砜、氧代生物素和其它生物素受体结合化合物等)。不言而喻，根据本发明，维生素类似物或衍生物可指掺入了杂原子的维生素，维生素类似物或衍生物通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上。
说明性的维生素部分包括叶酸、生物素、核黄素、硫胺素、维生素B12和这些维生素分子的受体结合类似物和衍生物，以及其它相关维生素受体结合分子。说明性的维生素类似物和/或衍生物的实施方案包括叶酸类似物和衍生物如亚叶酸、蝶酰谷氨酸，叶酸受体结合蝶啶如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其脱氮和二脱氮类似物。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物是指具有用碳原子替代天然存在的叶酸结构或其类似物或衍生物中一或两个氮原子的本领域认可的类似物。例如，所述脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮和10-脱氮叶酸类似物。所述二脱氮类似物包括，例如1，5-二脱氮、5，10-二脱氮、8，10-二脱氮和5，8-二脱氮叶酸类似物。其它用作形成本发明配体的复合物的叶酸，为叶酸受体结合类似物氨蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基-羟基叶酸，脱氮类似物例如1-脱氮甲氨蝶呤或3-脱氮甲氨蝶呤和3′，5′-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。前述叶酸类似物和/或衍生物通常称为“叶酸”，反映出它们结合叶酸受体的能力，并且这类配体当与外源分子缀合时，对提高跨膜转运有效，例如经本文所述的叶酸介导的胞吞作用。其它能够结合到叶酸受体上而启动受体介导的复合物胞吞转运的合适配体包括抗叶酸受体的抗独特型抗体。与抗叶酸受体的抗独特型抗体复合的外源性分子，用于触发本发明复合物的跨膜转运。
说明性的维生素类似物和/或衍生物的实施方案也包括生物素的类似物和衍生物，例如生物胞素、生物素亚砜、氧代生物素和其它生物素受体结合化合物等。不言而喻，本文所述其它维生素的类似物和衍生物也在本文做了考虑。在一个实施方案中，本文所述可用于递药缀合物的维生素包括结合到维生素受体上的维生素，所述维生素受体特异性在活化巨噬细胞上表达，例如本文所述结合叶酸或其类似物或衍生物的叶酸受体。
维生素的结合部位可包括任何维生素分子或其衍生物或类似物的受体，该部位能够特异性结合到受体上，其中所述受体或其它蛋白被致病细胞群体独特表达、过量表达或优先表达。被致病细胞独特表达、过量表达或优先表达的表面存在蛋白，典型地为不存在于或以低浓度存在于非致病细胞上的受体，提供选择性消除致病细胞的方法。所述维生素受体结合递药缀合物可以高亲和力结合到癌细胞或其它类型致病细胞上的受体上。所述高亲和力结合可以是所述维生素部分固有的，或者结合亲和性也可以由化学修饰的维生素(即类似物或衍生物)的使用来增强。
所述药物可为任何能够调节或以另外方式改变细胞功能的分子，包括药物活性化合物。合适的分子可包括但不限于肽、寡肽、反向倒位寡肽、蛋白质、其中至少一个非肽键代替肽键的蛋白质类似物、脱辅基蛋白质、糖蛋白、酶、辅酶、酶抑制剂、氨基酸及其衍生物、受体和其它膜蛋白；抗原及其抗体；半抗原及其抗体；激素、脂类、磷脂、脂质体；毒素；抗生素；镇痛药；支气管扩张药；β-受体阻断药；抗微生物药；抗高血压药；心血管药，包括抗心律不齐药、强心苷、抗心绞痛药和血管扩张药；中枢神经系统药，包括中枢神经兴奋剂、促精神药物、抗躁狂药和镇静剂；抗病毒药；抗组胺药；抗癌药，包括化疗药；镇定剂；抗抑郁药；H-2受体拮抗剂；抗惊厥药；止恶心药；前列腺素和前列腺素类似物；肌松驰药；消炎药；兴奋剂；减充血药；止吐药；利尿剂；镇痉药；止喘药；抗震颤麻痹药；祛痰药；镇咳药；粘液溶解药；和矿物质和营养添加剂。
此外，所述药物可为任何本领域已知药物，所述药物为细胞毒性、提高肿瘤通透性、抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、降低靶细胞中抗凋亡活性、用于治疗感染因子引起的疾病、增强针对致病细胞的内源免疫反应或适用于治疗由任何类型致病细胞引起的疾病的药物。适用于本发明的药物包括肾上腺皮质激素和皮质类固醇、烷化剂、抗雄激素药、抗雌激素药、雄激素、阿克拉霉素和阿克拉霉素衍生物、雌激素、抗代谢药如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物和氨甲喋呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其它铂化合物、他莫昔芬、泰素、紫杉醇、紫杉醇衍生物、多西紫杉醇、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、盘皮海绵内酯、微管抑制剂、大环内酯类抗肿瘤药(epothilones)、tubulysin、环丙基苯并[e]吲哚酮、开环-环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-开环-环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素和任何其它抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春新碱、长春碱及其类似物和衍生物，例如脱乙酰长春碱一酰肼、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、异秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B(HalicondrinB)、多拉司他汀例如多拉司他汀10、鹅膏蕈碱例如α-鹅膏蕈碱、喜树碱、依立替康以及其它喜树碱衍生物、格尔德霉素和格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙胺、炎性因子和促炎因子、肽和肽模拟物信号转导抑制剂和任何本领域认可的药物或毒素。其它可适用于本发明的药物包括青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、三氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林和任何其它本领域认可的抗微生物化合物。
在一个实施方案中，用于本发明的药物在血清中保持稳定至少4小时。在另一实施方案中，药物的IC50在纳摩尔范围内，在另一实施方案中，药物为水溶性的。如果药物不是水溶性的，二价接头(L)可被衍生化以增加水溶性。术语“药物”也指任何上述药物类似物或衍生物，包括但不限于多拉司他汀例如多拉司他汀10、鹅膏蕈碱例如α-鹅膏蕈碱、喜树碱和依立替康以及其它喜树碱和依立替康的衍生物。不言而喻，根据本发明，药物类似物或衍生物可指掺入了杂原子的药物，所述药物类似物或衍生物通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上。
本发明维生素受体结合递药缀合物可包含维生素受体结合部分、二价接头(L)、药物和任选的连接所述维生素受体结合部分和所述药物到二价接头(L)上的杂原子接头。不言而喻，根据本发明，维生素类似物或衍生物可指掺入了杂原子的维生素，所述维生素类似物或衍生物通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上。因此，所述维生素可通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上，或者维生素类似物或衍生物(即掺有杂原子)可直接连接在二价接头(L)上。同样，为本发明的药物和药物类似物或衍生物的药物类似物或衍生物可指掺入了杂原子的药物，所述药物类似物或衍生物通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上。因此，所述药物可通过所述杂原子接头共价连接到二价接头(L)上，或者药物类似物或衍生物(即掺有杂原子)可直接连接在二价接头(L)上。二价接头(L)可包含间隔接头、可释放(即可裂解)接头，以及连接含有这两种接头的缀合物中间隔接头到可释放接头上的杂原子接头。
因此，根据本发明，二价接头(L)可包含连接维生素和药物的方法，例如通过杂原子接头(即间隔臂或桥接分子)连接，或通过直接共价键合二价接头(L)到维生素或药物类似物或衍生物上。每个连接方法都不应妨碍维生素或维生素受体结合衍生物或类似物结合到细胞膜上的维生素受体上，以使本发明方法可操作。
通常，可根据本发明使用任何方式以形成二价接头(L)和所述维生素或其类似物或衍生物间缀合物、二价接头(L)和所述药物或其类似物或衍生物间的缀合物，包括任何间插杂原子接头的缀合物。同样地，可使用任何本领域认可的形成所述间隔接头、所述可释放接头与所述杂原子接头间的缀合物方法来形成二价接头(L)。所述缀合物可通过任何这些分子的直接缀合形成，例如通过氢键、离子键或共价键。例如，共价结合可通过形成酸基、醛基、羟基、氨基、巯基或联亚氨基间的酰胺键、酯键、二硫键或亚氨键而存在。
间隔接头和/或可释放接头(即可裂解接头)可为任何生物相容接头。例如，可裂解接头可为在存在于细胞内或细胞上的还原或氧化条件下易于裂解的接头、可为酸不稳定或碱不稳定接头的pH敏感接头或可被生化或代谢过程裂解的接头如酶不稳定接头。典型地，间隔接头和/或可释放接头包含约1个至约30个碳原子，更典型地，约2个至约20个碳原子。通常使用低分子量接头(即分子量约等于约30个至约300的分子)。这类接头的前体通常选择具有亲核或亲电，或这两者官能团的，任选以带有可容易地裂解的保护基的被保护形式以促进它们在中间体形式合成中的应用。
本发明也涉及包含有效量的维生素受体结合递药缀合物的药物组合物，当以一个或多个剂量给药时，有效消除宿主动物体内的致病细胞群体。所述递药缀合物优选胃肠外给予宿主动物，例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或鞘内给予。或者，所述递药缀合物给予宿主动物时，可通过其它医药有效途径如口服，并且可使用任何有效剂量和合适的治疗剂型，包括缓释剂型。
胃肠外剂型的实例包括活性剂的等渗盐水、5％葡萄糖或其它众所周知的药物可接受的液体载体例如液体醇、二元醇、酯和酰胺的水溶液。本发明的胃肠外剂型可以为包含一定剂量递药缀合物的重建冻干形式。在该实施方案的一个方面，可给予任何一些本领域已知缓释剂型，例如，描述于美国专利4,713,249；5,266,333；和5,417,982的可生物降解碳酸酯基质，其所公开的内容通过引用结合到本文中，或者，可使用减速泵(例如渗透泵)。
至少一种包含治疗因子的额外组合物，可与上述方法联用或作为上述方法的辅助剂给予宿主，以增强致病细胞群体的递药缀合物的消除，或者可给予不止一种额外治疗因子。所述治疗因子可选自能够刺激内源免疫反应的化合物、化疗药或另一能够补充所给予的递药缀合物有效性的治疗因子。除了给予宿主上述缀合物之外，本发明的方法可通过给予宿主能够刺激内源免疫反应的化合物或组合物(例如细胞因子)来实施，所述化合物或组合物包括但不限于细胞因子或免疫细胞生长因子如白介素1-18、干细胞因子、碱性FGF、EGF、G-CSF、GM-CSF、FLK-2配体、HILDA、MIP-1α、TGF-α、TGF-β、M-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、可溶性CD23、LIF及其组合。
可使用这些因子的治疗有效组合。例如，在一个实施方案中，例如，在每天多剂量的方案中量的范围为约0.1MIU/m2/剂/天至约15MIU/m2/剂/天的治疗有效量的IL-2，和在每天多剂量的方案中量的范围为约0.1MIU/m2/剂/天至约7.5MIU/m2/剂/天的治疗有效量的IFN-α，可与所述递药缀合物一道用于消除、减少或抵消含有致病细胞的宿主动物体内的致病细胞(MIU＝百万国际单位；m2＝约等于普通人的体表面积)。在另一实施方案中IL-12和IFN-α以上述治疗有效量，用作白介素和干扰素组合，在又一实施方案中，IL-15和IFN-α以上述治疗有效量，用作白介素和干扰素组合。在一个备选实施方案中，IL-2、IFN-α或IFN-γ和GM-CSF以上述治疗有效量，组合使用。本发明也考虑任何其它有效细胞因子组合，包括其它白介素和干扰素和集落刺激因子的组合。
例如，本身是细胞毒性的或可用来增加肿瘤通透性的化疗药，也在本发明方法中适合与递药缀合物联合使用。这类化疗药包括肾上腺皮质激素和皮质类固醇、烷化剂、抗雄激素药、抗雌激素药、雄激素、阿克拉霉素和阿克拉霉素衍生物、雌激素、抗代谢药如阿糖胞苷、嘌呤类似物、嘧啶类似物和氨甲喋呤、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其它铂化合物、他莫昔芬、泰素、紫杉醇、紫杉醇衍生物、多西紫杉醇、环磷酰胺、道诺霉素、根霉素、T2毒素、植物碱、泼尼松、羟基脲、替尼泊苷、丝裂霉素、盘皮海绵内酯、微管抑制剂、大环内酯类抗肿瘤药、tubulysin、环丙基苯并[e]吲哚酮、开环-环丙基苯并[e]吲哚酮、O-Ac-开环-环丙基苯并[e]吲哚酮、博来霉素和任何其它抗生素、氮芥、亚硝基脲、长春新碱、长春碱及其类似物和衍生物例如脱乙酰长春碱一酰肼、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、异秋水仙碱、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、软海绵素B、多拉司他汀例如多拉司他汀10、鹅膏蕈碱例如α-鹅膏蕈碱、喜树碱、依立替康以及其它喜树碱衍生物、格尔德霉素和格尔德霉素衍生物、雌莫司汀、诺考达唑、MAP4、秋水仙胺、炎性因子和促炎因子、肽和肽模拟物信号转导抑制剂和任何本领域认可的药物或毒素。其它可适用于本发明的药物包括青霉素、头孢菌素、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、氯霉素、氨基糖苷类抗生素、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、三氟尿苷、更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦林、美登素及其类似物和衍生物、吉西他滨和任何其它本领域认可的抗微生物化合物。
治疗因子可在所述维生素受体结合递药缀合物之前、之后或同时给予宿主动物，并且所述治疗因子可以含有所述递药缀合物的部分相同组合物给予或以部分不同于所述递药缀合物的组合物给药。任何这类含有治疗有效剂量的治疗因子的治疗组合物，可用于本发明。
此外，可以使用不止一种类型的递药缀合物。例如，宿主动物可在共同给药方案中，用带有不同维生素，但相同药物的缀合物进行治疗(例如叶酸-丝裂霉素缀合物和维生素B12-丝裂霉素缀合物)。在其它的实施方案中，宿主动物可用含有相同维生素与不同药物连接的缀合物进行治疗，或用不同维生素与不同药物连接的缀合物进行治疗。例如，宿主动物可用叶酸-丝裂霉素和叶酸-顺铂缀合物进行治疗，或者用叶酸-丝裂霉素和维生素B12-顺铂缀合物进行治疗。此外，可以使用带有相同或不同维生素的递药缀合物，或包含作为相同递药缀合物组成部分的多种维生素和多种药物的递药缀合物。
单一的日剂量的递药缀合物可根据宿主条件、要治疗的疾病、缀合物的分子量、其给药途径和组织分布以及其它治疗方法例如放疗的联用可能性而显著变动。给予病人的有效量取决于病人体表面积、体重和医生对病人疾病的诊断。有效剂量变动范围为例如约1ng/kg至约1mg/kg、约1μg/kg至约500μg/kg和约1μg/kg至约100μg/kg。
任何给予递药缀合物的有效用药方案都可以使用。例如，所述递药缀合物可以单剂量给予或可分开并以每天多剂量给予。此外，交错用药方案，例如，每周一到三天可用作每日治疗的选择性治疗，并且为了定义本发明的目的，这些间断的或交错的每天用药方案，被认为等同于每天的治疗并且在本发明范围内。在本发明的一个实施方案中，宿主用多次注射所述递药缀合物治疗以消除致病细胞群体。在一个实施方案中，宿主被多次注射(优选约2次最高至约50次)递药缀合物，例如，在12-72小时时间段或在48-72小时时间段。额外注射的递药缀合物可在最初的注射之后的几天或几个月时间段内给予，并且所述额外注射预防致病细胞引起的疾病复发。
在一个实施方案中，维生素或其类似物或衍生物可用于本发明递药缀合物，包括结合到特异性在活化巨噬细胞上表达的受体上的缀合物，所述受体例如结合叶酸或其类似物或衍生物的叶酸受体。例如，连接叶酸的缀合物可用于杀死引起宿主疾病的活化巨噬细胞或抑制所述活化巨噬细胞的活性。这种巨噬细胞靶向缀合物，当给予患活化巨噬细胞介导的疾病的病人时，造成浓缩并结合活化巨噬细胞群体中的缀合药物以杀死活化巨噬细胞或抑制巨噬细胞功能。活化巨噬细胞群体的消除、减少或失活造成要治疗疾病的活化巨噬细胞介导的发病特征的停止或减少。已知由活化巨噬细胞介导的示例性疾病包括类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、牛皮癣、骨髓炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、肺纤维化、肉状瘤病、全身性硬化症、器官移植排斥(GVHD)和慢性炎症。所述递药缀合物的给药通常持续到所述疾病症状减少或消除时。
用于杀死活化巨噬细胞或抑制活化巨噬细胞功能的递药缀合物可由胃肠外例如皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内与药学可接受的载体混和在一起给予患所述疾病的动物或患者。或者，所述递药缀合物通过其它医学适用方法给予，有效剂量可以标准或缓释剂型给予。所述治疗方法可单独使用或与其它公认的治疗由活化巨噬细胞介导疾病的治疗方法联用。
下述递药缀合物为说明性的递药缀合物，认为它们在本文所述本发明范围内。这些递药缀合物可根据本发明用除本领域认可方案外的本文所述方法制备。

X＝(CH2)n，n＝0，1，2，3，4

R＝H、烷基、酰基
此外，下述递药缀合物也为说明性的递药缀合物，认为它们在本文所述本发明范围内。所附的合成方法为说明性的方法，可用于制备本文所述递药缀合物。

向蛇形菌素(diacetoxyscirpenol(DAS))的乙腈溶液中加入1.0eg.的1，2，4，5-苯四甲酸二酐，然后加入1eg.的Hünig碱。在氩气和室温下，搅拌反应混合物1.5小时。如果还有一些DAS未反应，再加入0.2eg.的二酐并连续搅拌1小时。加入1.2eg.的蝶酰肼(根据J.Am.Chem.Soc.，1997，119，10004制备，其公开内容通过引用结合到本文中)的无水DMSO溶液，然后加入1.0eg.的Hünig碱。搅拌反应混合物1小时，并在乙醚中沉淀。所得沉淀再用制备型HPLC纯化。

如实施例10a所概述，使Boc-酰肼与丁二酸酐反应，所得产物与缩合剂5″-氨基-双-吲哚基-开环-CBI在EDC存在下反应。NHS酯活化后，Boc的除去和带有游离乙酰丙酸的酰基腙的形成为肽片段Pte-γ-Glu-Asp-Arg-Asp-Dap-OH提供反应配偶体。此肽片段由聚合物支持的连续方法用Fmoc策略以Fmoc-Dap(Boc)-Wang树脂开始制备，如方案12所概述。

Fmoc-酰肼与3-(2-吡啶基二硫基)丙酸反应得到Fmoc-酰肼基-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯]。与丝裂霉素C衍生物(丝裂霉素C，N-(CH2)2SH)反应，产生含二硫化物丝裂霉素C的衍生物。连续的NHS酯活化后，用标准方案的Fmoc的除去和带有乙酰丙酸的酰基腙的形成为肽片段Pte-γ-Glu-Dap-OH提供反应配偶体，其可如方案12所概述制备。
下述说明性的示例实施方案不是预期的，不得解释为限制性的。例如，在存在于本文的化合物中，用于形成接头的氨基酸的立体化学可任选选自天然L构型或D构型。每个实施例由NMR、MS和/或UV光谱表征，和/或由HPLC表示；适当记录所选的特征信号。
实施例1
根据P.Fuchs等，J.Am.Chem.Soc.，1997，119，10004描述的方法制备二亚乙基三胺叶酸，γ-酰胺(DETA-叶酸)，该文献的公开内容通过引用结合到本文中。将此化合物(100mg)溶解于2ml的0.1N HCl中。所得溶液加入到K2PtCl4(158mg)的1ml 0.1N HCl搅拌溶液中。加入3ml DMSO并连续搅拌3天，过滤溶液，滤液在乙腈中沉淀，得到170mg黄色粉末； MS(MALDI)1249.92，1286.27；1H NMR(D2O)δ1.05(t，1H)，2.3(t，2H)，3.1(t，2H)，4.45(m，1H)，6.65(d，2H)，7.5(d，2H)，8.65(s，1H)。
实施例2a
N10-三氟乙酰基保护的含叶酸肽基片段N10-TFA-Pte-Glu-Glu-Lys-OH通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略制备，如方案12所概述。在酸敏感Fmoc-Lys(Boc)-Wang树脂上进行合成。PyBop用作活化剂以确保用低当量的氨基酸的有效偶联。在标准条件(20％哌啶的DMF)下，每个偶联步骤之后除去Fmoc保护基。Fmoc-Glu-OtBu和N10-TFA-Pte-OH用作被保护的氨基酸构件。在最后的装配步骤之后，通过用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基甲硅烷处理，将肽从聚合物载体上切下。此反应也导致t-Bu和t-Boc保护基的同时除去。粗肽用制备型HPLC纯化，得到N10-TFA-Pte-γGlu-γGlu-Lys-OH的TFA盐。81mg(0.1mmol)所得肽的2ml DMSO溶液，用15μL(0.11mmol)Et3N和35mg(0.1mmol)的丝裂霉素A处理。丝裂霉素A可由丝裂霉素C根据M.Matsui，Y.Yamada，K.Uzu，和T.Hirata，J.Antibiot.21，189-198(1968)和D.Vias，D.Benign，R.Partyka，和T.Doyle，J.Org.Chem.51，4307-4309(1986)所描述的方法制备，该文献的公开内容通过引用结合到本文中。反应混合物在室温下搅拌48h并冻干除去溶剂。除非另有说明，所有溶剂的蒸发都在减压条件下进行。最终，三氟乙酰基保护基在氢氧化铵水溶液(pH＝10.0)中分离，并在乙腈中沉淀产物，得到102mg所述缀合物的黄色固体； 1H NMR(D2O)δ2.45(q，1H)，2.95(m，2H)，3.35(dd，1H)，3.5(d，1H)，6.5(d，2H)，7.55(d，2H)，8.55(s，1H)。
实施例2b
N10-三氟乙酰基保护的含叶酸肽基片段N10-TFA-Pte-Glu-Cys-OH通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略制备，如方案12所概述和实施例2a中的描述。使胱胺与丝裂霉素A反应(参见Matsui等，J.Antibiot.21，189-198(1968)；Vias等，J.Org.Chem.51，4307-4309(1986))得到含有具有末端游离氨基的丝裂霉素C衍生物的二硫化物，其与乙酰丙酸偶联，然后随即进行羰基与马来酰亚胺衍生的酰基酰肼反应。所得的迈克尔受体与N10-TFA-Pte-Glu-Cys-OH反应，在三氟乙酰基保护基用氢氧化铵水溶液(pH＝10.0)除去后，由乙腈沉淀，得到最终的缀合物； MS(MALDI)1059.04，1148.44，1225.32，1300.8；1H NMR(D2O)δ1.8(d，2H)，1.9(s，1H)，2.3(q，1h)，2.45(q，1H)，2.9(t，1H)，3.35(dd，1H)，4.45(s，1H)，4.5(dd，1H)，6.65(d，2H)，7.55(d，2H)，8.6(s，1H). 实施例3
T-2毒素的中间体丁二酰亚氨基对甲氧基亚苯甲基乙缩醛，由市售N-(2-羟乙基)顺丁烯二酰亚胺开始合成。在氧化银(I)(2eg.)作为二氯甲烷中的弱碱存在的情况下，其羟基与对甲氧基二氯甲基苯反应。粗品在硅胶柱上纯化。在含OH-的T-2毒素(1eg.)存在下，用1.5eg.2，3-二氯-5，6-二氰基-苯醌(DDQ)氧化处理所得的对甲氧基苯甲基醚，经稳定的对甲氧基苯甲基碳正中间体形式，得到所需的甲氧基亚苯甲基乙缩醛。
其它的反应配偶体，Pte-γ-Glu-Arg-Asp-Cys-OH，通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略制备。在酸敏感的H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂上进行合成。PyBop用作活化剂以确保用低当量的氨基酸的有效偶联。Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu-OtBu)和N10-TFA-Pte-OH用作被保护的氨基酸构件。在标准条件(20％哌啶的DMF)下，每个偶联步骤之后除去Fmoc保护基。在最后的装配步骤之后，通过用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基甲硅烷处理，将肽从聚合物载体上切下。此反应也导致t-Bu和t-Boc保护基的同时除去。粗肽用制备型HPLC纯化，得到N10-TFA-Pte-γ-Glu-Arg-Asp-Cys-OH。三氟乙酰基保护基在氢氧化铵水溶液(pH＝10.0)中分离。
最后，目标分子对甲氧基亚苯甲基乙缩醛-束缚叶酸-药物缀合物，通过在氩下混合所得肽的缓冲水溶液(pH＝7.0)与等摩尔的含顺丁烯二酰亚胺T-2毒素的缩醛的乙腈溶液制备。室温下搅拌1小时后，最终的缀合物用制备型HPLC纯化，冻干所收集的流分后，得到黄色粉末； MS(m+H)+1541.3；1H NMR(DMSO-d6)δ0.1(s，1H)，0.55(d，2H)，0.9(dd，3H)，1.65(s，1H)，2.0(d，1H)，3.75(d，2H)，5.25(d，1H)，6.65(d，2H)，6.9(d，2H)，7.3(t，2H)，7.65(d，2H)，8.65(s，1H)。
实施例4a
实施例4b
实施例4c
实施例4a、4b和4c的化合物，根据实施例3中描述的通用方法制备，只是酰基氮丙啶通过丝裂霉素A与合适的市售N-(烷酸)顺丁烯二酰亚胺的酰化(参见方案1)制备。
实施例5
在2.2eg.的NaHCO3为碱，乙腈/水(1/1)为溶剂的条件下，反-4-氨基环己醇盐酸盐与等摩尔量的Fmoc-OSu反应，得到N-Fmoc-保护的氨基醇，应用Swern条件(Synthesis，1981，165)氧化得到相应的N-Fmoc-保护的氨基酮。4当量的原甲酸甲酯和催化量的三氟乙酸缩酮化，得到定量收率的N-Fmoc-保护的氨基缩酮。用等摩尔量的三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯和2，4，6-三-叔丁基-吡啶处理此缩酮，得到产物4-Fmoc-氨基环己基烯醇醚。在下一步骤，在分子筛(3)和催化量的三氟乙酸存在下，药物、T-2毒素用四倍过量的烯醇醚处理。所得的不对称混合缩酮在硅胶上纯化。Fmoc保护基通过用树脂结合DMF的哌啶来去除。在1.1eg.的Hünig碱存在下，游离的氨基与1.1eg.的马来酰亚胺乙酸-NHS-酯反应。T-2毒素的含顺丁烯二酰亚胺缩酮经硅胶纯化。
含叶酸的肽片段，Pte-γ-Glu-β-Dap-Asp-Cys-OH，通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略制备，如方案12所概述。在载有Fmoc-L-Cys(Trt)-OH的酸敏感的Wang树脂上进行合成。PyBop用作活化剂以确保用低当量的氨基酸的有效偶联。在标准条件(20％哌啶的DMF)下，每个偶联步骤之后除去Fmoc保护基。Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Dap(Fmoc)-OH、Fmoc-Glu-OtBu和N10-TFA-Pte-OH用作保护的氨基酸构件。在最后的装配步骤之后，通过用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基甲硅烷处理，将肽从聚合物载体上切下。此反应也导致t-Bu和t-Boc和三苯甲基保护基的同时除去。最终，三氟乙酰基部分在氢氧化铵水溶液中分离得到所需的含硫醇的肽。粗肽用制备型HPLC纯化。
最后，目标分子乙缩醛-束缚叶酸-药物缀合物，通过在氩下混合所得肽的缓冲水溶液(pH＝7.0)与等摩尔的T-2毒素的含顺丁烯二酰亚胺缩醛的乙腈溶液制备。室温下搅拌1小时后，最终的缀合物用制备型HPLC纯化，冻干所收集的流分后，得到黄色粉末；ESMS(m-H)-1474.5，(m+H)+1476.2，(m+Na)+1498.3。
实施例6
根据P.Fuchs等(J.Am.Chem.Soc.，1997，119，10004；参见例如该文献所描述的化合物52的合成)描述的方法制备乙二胺叶酸，γ-酰胺(EDA-叶酸)，该文献的公开内容通过引用结合到本文中。将EDA-叶酸(600mg)悬浮于5ml无水DMSO中。于60℃搅拌4小时后，所得的溶液冷却至20℃，加入4eg.的1，2，4，5-苯四甲酸二酐(BTCA酸酐)。5分钟后，反应混合物倾入充分搅拌的无水乙腈中。所得的沉淀通过离心，分离得到657mg的BTCA(单酐)-EDA-叶酸。
向充分搅拌的道诺霉素的无水DMSO溶液中加入固体BTCA(单酐)-EDA-叶酸(1.5eg.)。再搅拌14小时后，50％的道诺霉素仍未反应(HPLC)，于是加入1.5eg.的BTCA(单酐)-EDA-叶酸。再搅拌4小时后，所有道诺霉素反应完全。在HPLC图中，观察到两个新峰，其保留时间相近，代表最终缀合物的两个区域异构体(regioisomers)。所得粗品在乙腈中沉淀后分离，然后用反相HPLC纯化。产物的结构与ES MS(m-H)-1227.1相一致。
实施例7
在氩气存在下，于0℃，向充分搅拌的250mg(0.25mmol)紫杉醇和130μL(0.73mmol)Hünig碱的4ml无水二氯甲烷溶液中，缓慢加入85μL(0.8mmol)Alloc-Cl。再连续搅拌12小时，产物用标准萃取技术分离。该2′-alloc-紫杉醇白色粉末无需进一步纯化就可直接用于下一步骤。
在此步骤，将108mg(0.117mmol)2′-alloc-紫杉醇溶解于1.0ml无水乙腈中。在氩气存在下，边搅拌边将25mg(0.117mmol)的1，2，4，5-苯四甲酸二酐(BTCA酐)和21μl(0.120mmol)Hünig碱加入到该溶液中。继续搅拌2.5小时。在单独反应瓶中，52mg EDA-叶酸于60℃搅拌，直到所有物质溶解(约60分钟)。冷却至室温后，此前反应混合物加入到此溶液中，再连续搅拌2小时。反应混合物滴加到充分搅拌的乙腈/乙醚(20∶80)中。离心分离出黄色沉淀，通过制备型HPLC进一步纯化。产物结构与1D和2D(COSY)1H-NMR谱；ESMS(m+H)+1555.5相一致。
实施例8
在氩气存在下，1.0eg.阿克拉霉素、2.0eg.酰肼基-[3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯](SPDP-腙)和少许对甲苯磺酸吡啶的混合物，在搅拌下，溶解于无水甲醇中。反应混合物在室温下搅拌8小时。将溶剂蒸发至干。残留物经用1.5％氯仿/甲醇(90∶10)中的三乙胺预处理的硅胶柱纯化。所得的阿克拉霉素酰腙溶解于最小量的乙腈中。在氩气存在下，向所得溶液中缓慢加入等摩尔量的Pte-γ-Glu-Cys-OH(溶于水并调至pH＝6.8)。Pte-γ-Glu-Cys-OH的制备与实施例2a中所述方法类似，并概述于方案12中。二硫化物的交换反应在10分钟内发生。将反应混合物缓慢加入到过量乙腈中，所得沉淀离心后分离。沉淀再次重悬于乙腈中，搅拌15分钟后，离心分离。高真空干燥过夜后，最终缀合物足够纯(HPLC)；ES MS(m+H)+1474.1。
实施例9
1.0eg.阿克拉霉素和1.2eg.β-顺丁烯二酰亚胺基丙酸-TFA的混合物在氩气存在下，经搅拌溶解于无水甲醇中。反应混合物在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发至干。残留物经过用1.5％氯仿/甲醇(90∶10)中的三乙胺预处理的硅胶柱。在氩气存在下，在单独的烧瓶中，肽片段Pte-γ-Glu-γ-Glu-Cys-OH溶于水并调至pH＝6.8。Pte-γ-Glu-γ-Glu-Cys-OH的制备类似于实施例2a中所述方法，并概述于方案12中。向所得的淡黄色溶液中缓慢加入溶于最小量乙醇中的阿克拉霉素的顺丁烯二酰亚胺基-腙。反应混合物在氩气存在下，搅拌1小时。除去甲醇，残留物在制备柱上用HPLC纯化，然后冻干；ES MS(m+H)+1722.3。
实施例9b
实施例9c
实施例9b和9c的化合物由多柔比星(14-羟基柔红霉素)衍生物，按照概述于实施例9a的方法制备。
实施例10a
高效细胞毒性药的5″-(N-Boc)氨基类似物，即双-吲哚基-开环-1，2，9，9a-四氢环丙烷并[c]苯并[e]吲5哚-4-酮(双-吲哚基-开环-CBI)按照D.Boger等，J.Org.Chem.，1992，57，2873首先报道方法的略加修改后制备，该文献的公开内容通过引用结合到本文中。
肽片段Pte-γ-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-OH，通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略，在酸敏感的H-Cys(4-甲氧基三苯甲基)-2-氯三苯甲基-树脂上制备。如方案12所概述。PyBop用作活化剂以确保用低当量的氨基酸的有效偶联。Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu-OtBu)和N10-TFA-Pte-OH用作保护的氨基酸构件。在标准条件(20％哌啶的DMF)下，每个偶联步骤之后除去Fmoc保护基。在最后的装配步骤之后，通过用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基甲硅烷处理，将肽从聚合物载体上切下。此反应也导致t-Bu和t-Boc保护基的同时除去。粗肽用制备型HPLC纯化，得到N10-TFA-Pte-γ-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-OH。三氟乙酰基保护基在氢氧化铵水溶液(pH＝10.0)中分离。
Lev-Val-OH用标准方案制备，该方案包括在EDC和Hünig碱存在下，使盐酸缬氨酸甲基酯与乙酰丙酸(levolinic acid)缩合，然后用氢氧化锂和水水解该甲基酯化合物。
复合的缀合物的最终装配，始于由5″-(N-Boc)氨基-双-吲哚基-开环-CBI上去除N-Boc基，以及在EDC存在下，游离氨基与Lev-Val-OH的羧基官能团的偶联。酰腙形成通过乙酰丙基(levolinic)部分与1.2eg.的β-顺丁烯二酰亚胺基丙酸·TFA在四氢呋喃中的反应完成。用色谱法纯化(硅胶，THF/己烷＝1/1)后，将上述反应产物溶于DMSO中。在氩气存在下，向该溶液中加入0.9eg.的Pte-γ-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-OH并将反应混合物搅拌18小时。溶剂通过冻干除去，残留物用HPLC纯化。
实施例10b
实施例10c
实施例10c和10c的化合物由5″-(N-Boc)氨基-双-吲哚基-开环-CBI衍生物根据概述于实施例10a中的方法制备。
实施例11
在碳酸钾存在下，2-巯基乙醇的S-烷基化用烯丙基溴完成。在所得的烯丙基β-羟基乙基硫中的羟基被亚硫酰氯换成氯。用过氧化氢在乙酸和乙酐存在下氧化此产物(J.Am.Chem.Soc.，1950，72，59，该文献的公开内容通过引用结合到本文中)，得到烯丙基β-氯乙基砜。此产物与氯代二甲基甲硅烷的反应，在催化量的六氯络铂氢酸(IV)存在下，同时高温蒸馏后，得到3-(β-氯乙基磺酰基)丙基二甲基甲硅烷基氯。当用1eg.吡啶作为碱时，此氯代硅烷硅烷化高细胞毒性化合物根霉素的羟基。用过量的三乙胺处理该分子中的β-氯乙基砜部分，导致顺利的氯化氢的β-消除，同时各自形成乙烯基砜。
其它的反应配偶体，即肽片段Pte-γ-Glu-Arg-Asp-Cys-OH，通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-方案制备，如实施例2a和方案12所概述。
复合的缀合物的最终装配，通过迈克尔加成反应，将肽片段的硫醇基连接在根霉素上的硅接头的乙烯基砜部分上而实现。此转化的反应介质为50∶50乙腈/水(pH＝7.2)。室温下搅拌24小时后，最终的缀合物在制备型柱上进行HPLC后分离；ES MS(m+H)+1631.6；(m-H)-1629.6。
实施例12
此根霉素的硅-束缚缀合物，用实施例11所述方案合成，只是用市售氯代甲基苯甲基硅烷替代氯二甲基硅烷。
实施例13 含半胱氨酸二硫键化合物的通用制备 根据Ranasinghe和Fuchs，Synth.Commun.18(3)，227-32(1988)的方法(该文献的公开内容通过引用结合到本文中)制备的硫代磺酸酯4(1当量)，与药物、药物类似物或药物衍生物5(1当量)反应，制备药物硫代磺酸酯6的甲醇溶液，如方案13所示。R为烷基或芳基，L为合适的离去基团，例如卤素、五氟苯甲基等，n为1-4的整数，X为-O-、-NH-、-C(O)O-或-C(O)NH-。转化可通过用TLC(硅胶；CHCl3/MeOH＝9/1)观察每种原料的消耗来方便地监测。
方案13
含叶酸肽基片段Pte-Glu-(AA)n-Cys-OH(9)通过聚合物支持的连续方法用Fmoc-策略，在酸敏感Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂(7)上制备，如方案14所示。R1为Fmoc，R2为三苯甲基，DIPEA为二异丙基乙胺。PyBop用作活化剂以确保有效偶联。Fmoc保护基在每个偶联步骤之后，在标准条件下除去。使用适当保护的氨基酸构件，如Fmoc-Glu-OtBu、N10-TFA-Pte-OH等，如方案14所示，并以步骤(b)中Fmoc-AA-OH表示。因此，AA是指任何适当保护的氨基酸原料。涉及Fmoc-AA-OH的偶联程序(步骤(a)&(b))进行″n″次，以制备固体支持的肽8，其中n为整数，并可等于0至约100。最后的偶联步骤之后，除去剩余的Fmoc基，所得肽随后偶联到谷氨酸衍生物上(步骤(c))，脱保护，并偶联到TFA-保护的蝶酸上(步骤(d))。随后，所得肽用三氟乙酸、乙烷二硫醇和三异丙基硅烷处理，从聚合物载体上切下(步骤(e))。这些反应条件导致t-Bu、t-Boc和Trt保护基的同时除去。TFA保护基通过用碱处理(步骤(f))除去，得到含叶酸含Cys肽基片段9。
方案14
(a)20％哌啶/DMF；(b)Fmoc-AA-OH，PyBop，DIPEA，DMF； (c)Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，PyBop，DIPEA，DMF；(d)1.N10(TFA)-Pte-OH；PyBop，DIPEA，DMSO；(e)TFAA，(CH2SH)2，i-Pr3SiH； (f)NH4OH，pH 10.3. 在去离子水(0.04M，用0.1N NaHCO3调pH至7)中，在氩气存在下，约30分钟，通过使叶酸衍生物9(0.9-0.95当量)与药物硫代磺酸酯6反应形成二硫键，以制备药物缀合物。真空蒸发甲醇后，缀合物可用制备型HPLC(Prep Novapak HR C1819X 300mM柱；流动相(A)-1.0mM磷酸缓冲液，pH＝6；有机相(B)-乙腈；条件-梯度99％A和1％B至50％A和50％B，在30分钟内，流速＝15ml/min)纯化。
实施例14a
1H NMR(DMSO-d6)δ4.7(d，1H)，4.95(t，1H)，6.7(d，4H)，6.9(t，1H)，7.95(d，2H)，8.1(d，2H)，8.2(m，1H)，8.3(s，1H)，8.4(s，1H)，8.7(s，1H)，10.2(s，1H)，11.8(d，2H)。
实施例14b
ES MS(m-H)-1436.4，(m+H)+1438.3。
实施例14c
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.0(s，1H)，1.1(s，1H)，1.6(s，1H)，1.8(s，1H)，2.1(s，1H)，2.25(s，3H)，2.65(dd，2H)，3.7(d，1H)，4.4(t，1H)，4.55(q，2H)，4.6(d，2H)，4.95(d，1H)，5.9(t，1H)，6.15(s，1H)，6.6(d，2H)，7.85(d，2H)，7.95(d，2H)，8.6(s，1H)，8.95(d，1H)。
实施例14d
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.0(s，1H)，1.1(s，1H)，1.65(s，1H)，2.1(s，1H)，2.25(s，3H)，2.6(dd，2H)，3.25(dd，1H)，3.6(t，2H)，3.7(d，1H)，4.4(t，1H)，4.6(d，1H)，4.95(d，1H)，5.9(t，1H)，6.2(s，1H)，6.6(d，2H)，7.7(t，1H)，7.9(d，2H)，7.95(d，2H)，8.6(s，1H)，9.1(d，2H)。
实施例14e
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ10.85(d，2H)，1.05(d，2H)，1.2(d，2H)，1.7(d，2H)，3.95(d，1H)，4.05(dd，1H)，5.4(dd，1H)，5.7(dd，1H)，6.65(d，2H)，7.6(d，2H)，7.95(s，1H)，8.65(s，1H)。实施例14f
ES MS(m+H)+1487.23；1H NMR(DMSO-D6/D2O)δ0.9(t，2H)，1.3(t，2H)，2.15(t，2H)，3.2(dd，1H)，4.0(t，1H)，4.15(q，1H)，5.3(s，2H)，5.5(s，2H)，6.6(d，2H)，7.0(s，1H)，7.4(m，2H)，7.55(d，2H)，8.0(d，2H)，8.6(s，1H)。
实施例14a、14b、14c、14d、14e和14f由下述通用方法制备。在氩气存在下，向充分搅拌的相应具-OH基药物溶液(1当量的无水CH2Cl2或无水THF)中，加入6-(三氟甲基)苯并三唑基2-(2′-吡啶基二硫基乙基碳酸酯(1.3当量)和N，N-二甲基氨基吡啶(1.5当量)。反应混合物搅拌3h，吡啶基二硫基-衍生的药物通过硅胶色谱分离(＞65％，对每个实施例)。根据方案12中概述的通用方法制备的相应的肽基片段(0.5当量)，溶于DMSO中。向所得的澄清黄色溶液中加入吡啶基二硫基衍生的药物。30分钟后，反应完全，所得缀合物用HPLC纯化。就实施例14e而言，肽基片段Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Asp-Cys-OH先溶于水，再将溶液pH用0.1N HCl调至2.5，使肽基片段沉淀。所得肽基片段通过离心收集、干燥，并溶于DMSO中用于随后与吡啶基二硫基衍生的药物反应。 实施例15
SN 38(10-羟基-7-乙基喜树碱)的中间体4-(2-吡啶基二硫基)苯甲基碳酸酯根据P.Senter等，J.Org.Chem.1990，55，2875所描述的方法制备，该文献的公开内容通过引用结合到本文中。肽基片段Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Cys-OH溶于DMSO，并向所得的澄清黄色溶液中加入吡啶基-二硫基衍生的药物。30分钟后，反应完全，所得缀合物用HPLC纯化； ES MS(m+H)+1425.38；1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ0.9(t)，1.15(t)，3.9(t)，4.0(t)，4.25(t)，5.1(m)，5.2(s)，5.4(s)，6.55(d)，7.25(d)，7.35(d)，7.5(d)，7.9(d)，8.55(s)。
实施例16a
实施例16b
实施例16a和16b的化合物由肽基片段Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Asp-Cys-OH制备，该肽基片段根据方案12所述通用方法制备。该肽基片段到开环-CBI-双-吲哚的顺丁烯二酰亚胺基衍生物的迈克尔加成产生叶酸缀合物实施例16a。所得肽基片段也与硫代磺酸酯或吡啶基二硫基-活化的长春碱反应，形成实施例16b。开环-CBI-双-吲哚的顺丁烯二酰亚胺基衍生物和硫代磺酸酯和吡啶基二硫基-活化的长春碱中间体，用用于其它实施例的本文所述方法制备。 实施例17a
脱乙酰长春碱一酰肼(1当量)(参见Barnett等，J.Med.Chem.，1978，21，88，该文献的公开内容通过引用结合到本文中)在新蒸馏的THF中用1当量三氟乙酸处理。搅拌10分钟后，所得溶液用1.05当量的N-(4-乙酰基苯甲基)顺丁烯二酰亚胺处理。酰腙形成在45分钟内完成，蒸发溶剂。根据方案12概述的通用方法制备的肽基片段Pte-Glu-Asp-Arg-Asp-Asp-Cys-OH(0.85当量)，溶于水中，pH用0.1N HCl调至2.5，使肽沉淀。所得肽基片段通过离心收集、干燥，并溶于DMSO中。向所得的澄清黄色溶液中加入Hünig碱(15当量)和酰腙的迈克尔加合物。1h后，最终缀合物用HPLC纯化。 实施例17b
实施例17c
实施例17b和17c根据实施例17a所述方法，用相应的肽基片段和CBI的一酰肼衍生物制备。
实施例18-41的化合物根据实施例13所概述的通用方法制备。实施例18-41由电喷雾质谱(ES MS)和包括1D和2D NMR和UV在内的其它光谱技术表征。
实施例18
ES MS(m+H)+1071.9，(m+Na)+1093.9；1H NMR(D2O)δ2.6(t，4H)，2.7(t，4H)，4.15(s，2H)，5.45(s，2H)，7.75(d，2H)，8.15(d，2H)，8.9(s，1H)。
实施例19
UV(nm)233(max)，255，280；1H NMR(D2O，NaOD，CD3CN)δ1.15(d，3H)，2.3(s，3H)，3.6(s，1H)，3.85(s，3H)，4.9(s，1H)，5.3(s，1H)，6.5(d，2H)，7.3(m，1H)，7.5(d，2H)，7.65(d，2H)，8.4(s，1H)。
实施例20
ES MS(m-H)-935.6，(m+H)+937.4，(m+Na)+959.5。
实施例21
1H NMR(D2O，NaOD，CD3CN)δ0.1(s，1H)，1.1(s，3H)，1.2(s，3H)，1.75(s，3H)，1.9(s，3H)，2.05(s，3H)，2.35(s，3H)，3.3(dd，2H)，3.8(d，1H)，4.3(q，2H)，4.9(d，1H)，5.1(d，1H)，5.4(q，1H)，5.55(d，1H)，5.65(d，1H)，6.1(t，1H)，6.35(s，1H)，6.9(d，2H)，7.9(d，2H)，8.15(d，2H)，8.7(s，1H)。
实施例22
实施例23
ES MS(m-H)-1136.5。
实施例24
ES MS(m-H)-1136.3，(m+H)+1138.0。
实施例25
ES MS(m+H)+1382.3，(m+Na)+1405.4。
实施例26
ES MS(m-H)-1379.2，(m+H)+1381.2。
实施例27
ES MS(mH)-949.2；1H NMR(D2O)δ1.55(s，3H)，1.95(m，2H)，2.05(s，3H)，2.45(s，3H)，2.75(dd，2H)，2.95(dd，2H)，3.05(s，3H)，3.3(dd，2H)，3.35(d，2H)，3.45(t，2H)，4.85(q，2H)，6.5(d，2H)，7.45(d，2H)，8.5(s，1H)。
实施例28
1H NMR(DMSO-d6)δ1.5(s)，2.25(t)，2.75(m)，3.9(q)，4.6(d)，4.85(t)，6.6(d)，7.6(d)，7.9(d)，8.15(d)，8.25(t)，8.65(s)，8.7(m)，9.3(m)，10.2(t)。
实施例29
ES MS(m-H)-1413.5，(m+H)+1415.3。
实施例30
ES MS(m+H)+1530.2；1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.2(s，1H)，2.9(t，1H)，3.65(t，1H)，4.15(t，1H)，4.25(t，1H)，4.35(t，1H)，6.7(d，2H)，7.0(s，1H)，8.1(d，2H)，8.25(s，1H)，8.7(s，1H)。
实施例31
1H NMR(DMSO-d6)δ1.75(s，1H)，1.85(s，1H)，2.1(t，2H)，4.3(t，1H)，4.6(d，1H)，4.9(t，1H)，6.6(d，2H)，8.15(s，2H)，8.6(s，1H)。
实施例32
ES MS(m+H)+1408.4。
实施例33
ES MS(m-H)-1491.1，(m+H)+1493.1；1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ4.15(q，1H)，4.6(d，1H)，4.9(t，1H)，6.6(d，2H)，7.25(s，1H)，7.4(d，1H)，7.9(d，1H)，7.95(d，2H)，8.15(d，2H)，8.6(s，1H)。
实施例34
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ2.1(t，2H)，2.75(q，2H)，4.3(t，1H)，4.65(d，1H)，4.9(t，1H)，6.6(d，2H)，7.9(d，1H)，8.0(d，2H)，8.2(t，2H)，8.6(s，1H)。
实施例35
实施例36
ES MS(m+H)+1680.4；1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ0.3(s，3H)，0.35(s，3H)，1.05(s，9H)，2.15(t，2H)，4.15(t，1H)，4.85(t，1H)，6.6(d，2H)，7.55(t，4H)，7.9(d，1H)，8.0(s，1H)，8.05(d，1H)，8.15(s，1H)，8.6(s，1H)。
实施例37
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.1(s，3H)，1.8(s，1H)，4.55(d，1H)，4.8(t，1H)，6.6(d，2H)，7.8(d，1H)，8.1(d，1H)，8.15(s，1H)，8.6(s，1H)。
实施例38
实施例39
实施例40
实施例41
实施例42 用EC112治疗对小鼠肿瘤生长的抑制 评价实施例9b的化合物(EC111)和实施例9c的化合物(EC112)当静脉内(i.v.)给予荷瘤动物时在带有皮下M109肿瘤的Balb/c小鼠中的抗肿瘤活性，其中药物为柔红霉素。在用1×106M109细胞右腋皮下组织肿瘤接种4天后，用2-10μmol/kg的实施例9b或实施例9c的化合物，或用未缀合的柔红霉素或PBS给小鼠(5只/组)每周静脉注射2次，持续4周。每个治疗组每隔3天或4天，用测径规测量肿瘤生长。用方程V＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中″a″为肿瘤长度，″b″为宽度，单位为毫米。动物体重也每隔3天或4天秤量。
如图1和图2所示，用实施例9c的化合物的治疗有效延迟M109肿瘤的生长，而且没有明显毒性(基于动物体重)。未缀合的阿霉素也提供抗肿瘤反应，但是伴有基于体重的毒性。
实施例43 用EC105治疗对小鼠肿瘤生长的抑制 方案如实施例42所述，只是使用的是实施例10a的化合物(EC105)，其中药物为双-吲哚基-开环-CBI。实施例10a的化合物以0.3μmol/kg的剂量注射。同样，测试了两个皮下肿瘤模型，包括M109模型(叶酸受体阳性)和4T1模型(叶酸受体阴性)，在一些动物中，67倍过量的游离叶酸(20μmol/kg；FA)与所述缀合物(即实施例10a的化合物)共注射。
观察到实施例10a的化合物惊人的抗肿瘤反应，同时没有基于动物体重的明显毒性(参见图3和图4)。实施例10a化合物的抗肿瘤反应被过量游离叶酸阻断，证明该反应的特异性(参见图3)。如图5所示，在4T1模型(叶酸受体阴性)中没有观察到抗肿瘤活性，再次证明该反应的特异性。
实施例44 用EC145治疗对小鼠肿瘤生长的抑制 评价实施例16b的化合物(EC145)当静脉内(i.v.)给予荷瘤动物时在带有皮下M109肿瘤的Balb/c小鼠中的抗肿瘤活性，其中药物为脱乙酰长春碱一酰肼。在用1×106M109细胞右腋皮下组织肿瘤接种约11天后(平均肿瘤体积在to＝60mm3)，用1500nmol/kg的EC145，或用相等剂量体积的PBS(对照)给小鼠(5只/组)每周静脉注射2次(BIW)，持续3周。每个治疗组每隔2天或3天，用测径规测量肿瘤生长。用方程V＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中″a″为肿瘤长度，″b″为宽度，单位为毫米。
如图6所示，相对于用盐水治疗的动物中的M109肿瘤的生长，用EC145进行治疗有效延迟M109肿瘤的生长。
实施例45 用EC140治疗对小鼠肿瘤生长的抑制 评价实施例17a的化合物(EC140)当静脉内(i.v.)给予荷瘤动物时在带有皮下M109肿瘤的Balb/c小鼠中的抗肿瘤活性，其中药物为脱乙酰长春碱一酰肼。在用1×106M109细胞右腋皮下组织肿瘤接种约11天后(平均肿瘤体积在to＝60mm3)，用1500mol/kg的EC140，或用相等剂量体积的PBS(对照)给小鼠(5只/组)每周静脉注射3次(TIW)，持续3周。每个治疗组每隔2天或3天，用测径规测量肿瘤生长。用方程V＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中″a″为肿瘤长度，″b″为宽度，单位为毫米。
如图7所示，相对于用盐水治疗的动物中的M109肿瘤的生长，用EC140进行治疗有效延迟M109肿瘤的生长。
实施例46 用EC136治疗对小鼠肿瘤生长的抑制 评价实施例10b的化合物(EC136)当静脉内(i.v.)给予荷瘤动物时在带有皮下L1210A肿瘤的DBA小鼠中的抗肿瘤活性，其中药物为CBI。在用0.25×105 L1210A细胞右腋皮下组织肿瘤接种约5天后(平均肿瘤体积在to～50mm3；5只小鼠/组)，用400nmol/kg的EC136，或用相等剂量体积的单独的PBS(对照)给动物(5只/组)每周静脉注射3次(TIW)，持续3周。每个治疗组每隔2天或3天，用测径规测量肿瘤生长。用方程V＝a×b2/2计算肿瘤体积，其中″a″为肿瘤长度，″b″为宽度，单位为毫米。
如图8所示，相对于用盐水治疗的动物中的L1210A肿瘤的生长，用EC136进行治疗有效延迟L1210A肿瘤的生长。
实施例47 各种叶酸-药物缀合物对细胞DNA合成的抑制 实施例17b、10b、16a、10c、17a、16b、14e和15的化合物(分别为EC135、EC136、EC137、EC138、EC140、EC145、EC158和EC159)用体外细胞毒性试验进行评价，该试验预测药物抑制叶酸受体-阳性KB细胞生长的能力。这些化合物由分别连接到化疗药上的叶酸组成，并根据本文所述方案制备。在至少100倍过量的叶酸存在或不存在的情况下，将KB细胞于37℃暴露于标明浓度的叶酸-药物缀合物最高达7小时(参见图9-16所示图形的x-轴)。然后细胞用新鲜培养基漂洗一次，并在新鲜培养基中于37℃孵育72小时。细胞存活率用3H胸苷掺入试验进行评价。
如图9-16所示，剂量依赖性细胞毒性是可测量的，在大多数情况下，IC50值(减少3H-胸苷掺入新合成DNA 50％所需的药物缀合物浓度)在低纳摩尔范围内。此外，这些缀合物的细胞毒性在过量游离叶酸存在下被降低，说明观察到的细胞杀伤由结合到叶酸受体上而介导。
用EC158和包括IGROV(已知细胞系)、A549-Clone-4(用人叶酸受体cDNA转染的A549细胞)、New Line-01(体内对叶酸受体表达有选择性的Line-01细胞突变株)、M109、4T1 Clone-2(用鼠叶酸受体cDNA转染的4T1细胞)和HeLa细胞在内的细胞系，在这类型的试验中都得到类似的结果。
权利要求
1.一种维生素受体结合递药缀合物，所述缀合物包含
(a)维生素受体结合部分；
(b)二价接头；和
(c)药物；
其中所述维生素受体结合部分共价连接到所述二价接头上；
所述药物共价连接到所述二价接头上；
所述二价接头包含至少一种可释放接头和任选一种或多种间隔接头或杂原子接头；以及
所述药物选自长春花生物碱类化合物、埃博霉素和tubulysin，和上述化合物的类似物和衍生物。
2.权利要求1的递药缀合物，其中所述药物选自长春碱，长春地辛和长春新碱，和上述化合物的类似物和衍生物。
3.权利要求1的递药缀合物，其中所述二价接头含有二硫化物。
4.权利要求1的维生素受体结合递药缀合物，其中所述二价接头含有-SSCH2CH2OC(O)-。
5.权利要求1的维生素受体结合递药缀合物，其中所述二价接头含有-SSCH2CH2OC(O)NHNH-。
6.权利要求1-5中任一项的递药缀合物，其中所述二价接头含有肽。
7.权利要求6的递药缀合物，其中所述肽含有一个或多个选自天冬氨酸和精氨酸的氨基酸。
8.权利要求1-5中任一项的递药缀合物，其中所述维生素受体结合部分为叶酸或其类似物或衍生物。
9.权利要求1的维生素受体结合递药缀合物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
10.权利要求1的维生素受体结合递药缀合物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
11.一种维生素受体结合递药缀合物中间体，其具有下式
其中R8为氢或离去基团。
12.一种维生素受体结合递药缀合物中间体，其具有下式
其中R8为氢或离去基团。
全文摘要
本发明涉及维生素受体结合递药缀合物。本发明描述了维生素受体结合递药缀合物及其制备方法。该递药缀合物由维生素受体结合部分、二价接头(L)和药物组成。维生素受体结合部分为维生素或其维生素受体结合类似物或衍生物，药物包括其类似物或衍生物。维生素受体结合部分共价连接到二价接头上，药物或其类似物或衍生物共价连接到二价接头上，其中二价接头(L)包括一个或多个间隔接头、可释放接头和杂原子接头。也描述了利用该递药缀合物来消除致病细胞群体的方法和药物组合物。
文档编号A61K31/475GK101239190SQ20081008156
公开日2008年8月13日 申请日期2004年1月27日 优先权日2003年1月27日
发明者I·R·弗拉霍夫, C·P·利蒙, M·A·帕克, S·J·霍瓦德, H·K·桑塔普拉姆, A·萨特亚姆, J·A·雷迪 申请人:恩多塞特公司