专利名称：一种组织补片及其制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种组织补片及 其制备方法。
背景技术：
覆盖创面理想的方法是移植自体皮，但由于自体皮源常常不充足，这 样就需要皮肤替代物。而由细胞外基质构成组织补片具有其他类材料所难 以比拟的生物相容性，是当前最有应用前景的创面覆盖物，主要包括异体 和异种皮、羊膜类、动物腹膜、胶原膜等材料。
细胞外基质(extracellular matrix, ECM)为细胞的生存及活动提供适 宜的场所，不仅是细胞的机械支撑组织，而且是营养供给和免疫应答的场 所，参与调节胚胎发育进程，决定细胞的粘附与迁移，在创伤修复和纤维 化、细胞的生长、分化、代谢和肿瘤发生及转移中起重要作用，并作为组 织替代材料用于临床，在多种组织器官的修复中发挥着重要作用。其主要 成分包括胶原蛋白、非胶原糖蛋白、弹力纤维、糖胺多糖、蛋白聚糖、与 基质代谢相关的酶及细胞因子。
组织补片的促愈合作用表现在具有一定的止血促凝作用，还可诱导 多种细胞增殖分化；胶原蛋白不但可作为伤口凝血块的基底，而且是粒细 胞、巨噬细胞、纤维母细胞的趋化性物质，为各种细胞的游走、附着、增 殖提供支架。组织补片在创面最终降解为机体修复细胞所必需的氨基酸，
为创面修复提供营养物质。
小肠粘膜下层(Small intestinal submucosa, SIS)来源于小肠,是一 种天然的细胞外基质生物材料，主要由I 、 in型胶原蛋白构成，含有少量的 IV、 V型胶原蛋白，还包含有氨基葡聚糖和糖蛋白等，所含的氨基葡聚糖主 要包括透明质酸、肝素、硫酸乙酸肝素、硫酸软骨素A和硫酸皮肤素。SIS在 体内能引导和支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，具有较强的机械强度，适 用于组织工程的支架材料。然而SIS来源于动物，目前的产品在植入人体后不
可避免地会产生免疫排斥反应，影响其临床应用的效果。
羊膜是人体最厚的基膜，来源广泛，其基底膜中含有纤维粘连素、层粘 连素和I型胶原等成分。羊膜是由羊膜上皮和含有大量胶原纤维和成纤维细 胞的基质层构成，其厚度为O. 02~0. 5mm，薄而透明，无血管。羊膜具有以下 特征(l)易于获得，制备简单，容易满足临床需求；(2)为半透膜，可允许小 分子物质通过；(3)含一定量的胶原纤维，具有一定的弹性和韧性以及抗拉力， 易于铺展；(4)几乎没有免疫排斥反应。研究表明，羊膜的抗体形成及其细胞 免疫反应在各种条件下都是很低的，尚无发生严重排斥反应的报道。羊膜的 缺点是厚度和强度不足，用于创面后容易降解，是制约其临床应用的瓶颈。
因此将SIS与羊膜结合可以克服两者的缺点，形成全新的、利于临床使 用的组织补片。经检索，未见有此类产品的应用和文献报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提出一种组织补片及其制备方 法，所制备的组织补片具有良好的机械强度、较高的生物活性和生物相容性, 无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性，同时制备方法具有原料来源不受限制，脱细胞效果好，无细胞残留，去除抗原成分的优点。
本发明所提出的组织补片，其特征在于是以脱细胞小肠粘膜下层为内 层，其两面裹覆有脱细胞羊膜层所构成，各膜层分别为l-4层结构。所述的 脱细胞羊膜为人羊膜经脱细胞处理后所形成的膜状材料；所述的脱细胞小肠 粘膜下层为哺乳动物小肠粘膜下层经脱细胞处理后所形成的膜状材料。
本发明所述组织补片的制备方法，包括有脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜 下层的制备，以及组织补片的构建，具体步骤如下
步骤一，脱细胞羊膜的制备取健康产妇胎盘，在无菌操作下剥离羊膜， 用生理盐水冲洗干净，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含有l 4g/L 胰蛋白酶和O. 1-0.4 g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，消化不少于l小 时，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后，再置入含有30 50U/ml的DNA酶溶液中 浸泡25分钟以上，去除残留的DNA成分，降低免疫原性，用PBS漂洗后备用；
步骤二，脱细胞小肠粘膜下层的制备将哺乳动物的空肠用水冲洗干净， 切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小时，用 磷酸盐缓冲液漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净；再将其 置入0. 1 ~ 1M的NaOH溶液中，于2 ~ 8。C条件下浸泡8分钟以上，达到溶解 细胞、灭活病毒的目的，用PBS漂洗至中性；再置入含有DNA酶和a-半乳 糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，去除残留的DNA和a-gal天然抗原 成分，降低免疫原性，最后用PBS漂洗干净备用；其中，所述过氧乙酸的终 浓度(V/V)为0.1~0. 5%，乙醇的终浓度(V/V)为2%~10%;所述DNA酶 的终浓度为30~50U/ml， a-半乳糖苷酶的终浓度为10~25U/ml;
步骤三，组织补片的构建将制备的脱细胞羊膜铺开展平，把制备的脱
细胞小肠粘膜下层铺展于其上，再于其上覆盖所制备的脱细胞羊膜铺展，压 紧使其紧密结合，干燥后灭菌，形成多层组织补片。所述的脱细胞小肠粘膜
下层可以是l-4层叠加；任一面的脱细胞羊膜也可以是1~4层叠加；各层 之间可以使用生物胶(包括胶原蛋白、纤维蛋白胶、透明质酸、硫酸软骨素、 水凝胶、骨胶、明胶、果胶的任一种或是几种的混合)涂刷粘结，再用机械压 紧的方法使各层间紧密黏附。
本发明所制备组织补片的主要用途有U)充当组织加强物，修复机体 软组织的强度不足或缺损(疝、瘘等)；(2)修复皮肤缺损创面(烧烫伤、 溃疡、供皮区、营养不良和感染创面等)；(3)用于颜面部凹陷畸形的修复， 如颞部、颊部凹陷；(4)做为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备， 如组织工程化角膜、组织工程化耳鼓膜、组织工程化肌腱、组织工程化牙周 膜、组织工程化周围神经等。
本发明制备的组织补片，以脱细胞羊膜包裹脱细胞小肠粘膜下层可以隔
离脱细胞小肠粘膜下层的免疫毒性；而脱细胞小肠粘膜下层在内层起支撑作
用，能补偿脱细胞羊膜机械强度的不足。本发明的制备方法简单、原料来源 不受限制，不产生伦理道德问题，无细胞残留，使用强碱环境可有效地去除 病毒，无化学物质残留，提高了产品的生物相容性。本发明的组织补片，具 有较高的生物活性和生物相容性、无明显免疫排斥反应、对细胞无毒性的优
点；具有一定的机械强度和韧性，其形状大小及厚度易于改变，便于临床缝 合固定，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，满足 创面修复的需要；也可做为生物支架材料用于其他组织修补材料的制备。
具体实施例方式
以下结合实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式
。
实例一
1、 脱细胞羊膜制备羊膜取自剖宫产健康产妇胎盘，在无菌操作下剥离 羊膜，用生理盐水冲洗干净后，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含 有1.25g/L胰蛋白酶和0. 2g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，37。C条件下 振摇消化l小时，用PBS漂洗后，再将其置入含有30U/ml的DNA酶溶液中，于 37。C条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗后备用；
2、 脱细胞小肠粘膜下层的制备将猪小肠用水冲洗干净，切成片段，置 于含有0. 2%过氧乙酸和10%乙醇的水溶液中浸泡消毒2小时，用PBS漂洗； 刮除小肠粘膜层、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净；将其置入1M的NaOH溶液 中，于4。C条件下浸泡IO分钟，用PBS漂洗至中性；再将其置入含有40U/ml 的DNA酶和10U/ml的or半乳糖苷酶的混合溶液中，于37'C条件下浸泡30 分钟，用PBS漂洗干净备用；
3、 组织补片的构建将制备的脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层修剪 成同样大小，把双层脱细胞羊膜铺开展平，将单层脱细胞小肠粘膜下层铺展 于其上，再于其上覆盖双层脱细胞羊膜铺展，通过机械压紧使其紧密结合， 将其伸展自然干燥后环氧乙垸消毒灭菌，形成多层组织补片。
本实例制备的组织补片具有厚度相对较薄，降解相对较快，可用于修复 表浅的皮肤缺损创面；也可作为生物支架材料，开发其他组织工程产品。 实例二
1、脱细胞羊膜制备羊膜取自健康产妇胎盘，无菌操作下剥离羊膜，用 生理盐水冲洗干净后，分离羊膜和绒毛膜获取羊膜，将其浸泡于含有2. 5g/L
胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，37。C振摇消化1.5小 时，用PBS漂洗后，再将其置入含有40U/ml的DNA酶溶液中，于37。C条件下 浸泡30分钟，用PBS漂洗干净备用；
2、 脱细胞小肠粘膜下层的制备将牛小肠用水冲洗干净，切成片段，置 于含有0. 4%过氧乙酸和5%乙醇的水溶液中浸泡消毒4小时，用PBS漂洗；刮
除小肠粘膜层、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得小肠粘膜下层；将小肠 粘膜下层置入O. 5M的NaOH溶液中，于4。C条件下浸泡30分钟，用PBS漂 洗至中性；再将其置入含有50U/ml的DNA酶和20U/ml的a-半乳糖苷酶的 溶液中，于37。C条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗后备用；
3、 组织补片的构建将制备的脱细胞羊膜和脱细胞小肠粘膜下层修剪 成同样大小，把三层脱细胞羊膜铺开叠加展平，将二层脱细胞小肠粘膜下层 叠加铺展于其上，再于其上覆盖三层脱细胞羊膜叠加铺展，各层之间使用胶 原蛋白进行涂刷粘结，再通过机械压紧使其紧密结合，最后将其冷冻干燥后 钴60灭菌消毒，形成多层组织补片。
本实例制备的组织补片具有厚度相对较厚，机械强度较高，降解相对较 慢，可用于充当组织加强物，修复机体软组织强度不足或缺损；修复皮肤缺 损较深的创面。
权利要求
1.一种组织补片，其特征在于是以脱细胞小肠粘膜下层为内层，其两面裹覆有脱细胞羊膜层所构成，各膜层分别为1～4层结构；所述的脱细胞羊膜为人羊膜经脱细胞后所形成的膜状材料；所述的脱细胞小肠粘膜下层为哺乳动物小肠粘膜下层经脱细胞后所形成的膜状材料。
2、 制备权利要求1所述组织补片的方法，包括有脱细胞羊膜和脱细胞 小肠粘膜下层的制备，其特征在于，具体步骤如下步骤一，脱细胞羊膜制备将获取的羊膜浸泡于含有1 4 g/L胰蛋白酶 和O. 1~0. 4 g/L乙二胺四乙酸二钠的混合消化液中，消化不少于l小时，用磷 酸盐缓冲液漂洗后，再置入含有30 50U/ml的DNA酶溶液中浸泡25分钟以 上，用磷酸盐缓冲液漂洗后备用；步骤二，脱细胞小肠粘膜下层的制备将哺乳动物的空肠用水冲洗干净， 切成片段，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不少于1小时，用 磷酸盐缓冲液漂洗；刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用磷酸盐缓冲液漂洗干净； 再将其置入O. 1 1M的NaOH溶液中，于2-8。C条件下浸泡8分钟以上，用 磷酸盐缓冲液漂洗至中性；再置入含有DM酶和a-半乳糖苷酶的混合溶液 中浸泡25分钟以上，最后用磷酸盐缓冲液漂洗干净备用；步骤三，组织补片的构建把制备的脱细胞羊膜铺开展平，将制备的脱 细胞小肠粘膜下层铺展于其上，再于其上覆盖所制备的脱细胞羊膜铺展，压 紧使其紧密结合，干燥后灭菌，形成多层组织补片。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在步骤二中，所述过 氧乙酸和乙醇的最终体积浓度分别为0. 1~0. 5%和2%~10%;所述DNA酶和 a-半乳糖苷酶的终浓度分别为30~50U/ml和10~25U/ml。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在所述步骤三中的各 膜层间使用生物胶涂刷粘结，再用机械压紧的方法使各层间紧密黏附。
全文摘要
一种组织补片及其制备方法，本发明是以脱细胞小肠粘膜下层为内层，其两面包裹覆有脱细胞羊膜所构成；所制备的组织补片以脱细胞羊膜隔绝了脱细胞小肠粘膜下层的免疫毒性；而脱细胞小肠粘膜下层补偿了脱细胞羊膜机械强度的不足，与现有产品相比，具有较高的生物活性和生物相容性，无明显免疫排斥反应，对细胞无毒性；同时制备方法具有原料来源不受限制，无细胞残留，能有效灭活病毒，不产生伦理道德问题的优点。所制备的产品适用于充当组织加强物，修复机体软组织强度不足或缺损；作为组织充填材料，用于颜面部凹陷畸形的修复。
文档编号A61L27/26GK101366979SQ20081015079
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者王爱军 申请人:陕西瑞盛生物科技有限公司