专利名称：人源化异种细胞外基质材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及人源化异种细胞 外基质材料及其制备方法。
背景技术：
器官和组织中的细胞，其行为不仅取决于细胞内在的基因序列，在很 大程度上还受到外界环境因素的影响，包括细胞与细胞外基质的相互作用。 细胞外基质不仅为细胞生长提供支持和保护，更重要的是细胞与细胞外基 质的相互作用能调节细胞的形态发生过程，影响细胞生存、迁移、增殖和 功能代谢。因此，在组织工程研究中制备利于种子细胞粘附、增殖和分化 的细胞外基质材料是十分重要和迫切的。
细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是由细胞分泌到细胞外间 质中的大分子物质，构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组 织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质是由机体细胞合成并分泌到细胞 外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要是胶原蛋白、非胶原糖蛋 白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白。细胞外基质对细胞的形状、结 构、功能、存活、增殖、分化、迁移等一切生命现象具有全面的影响，因 而无论在器官形成过程中，或在维持成体结构与功能完善(包括免疫应答 及创伤修复等)的一切生理活动中均具有不可忽视的重要作用。
细胞外基质在体内能引导、支持宿主细胞生长，逐渐完全降解，适用于
组织工程的支架材料。而且细胞外基质中含有多种细胞生长因子，即使经过 脱细胞处理后仍然含有这些生长因子，在创伤愈合的早期阶段可以为组织再 生创造合适的微环境。这是其它天然材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖和 聚乳酸、聚羟基乙酸)所不能比拟的。
目前获取细胞外基质的方法主要来源于动物。然而，异种细胞外基质 的成分主要是由动物细胞分泌合成，与人体的成分存在有差异，因此植入体 内后难以与人体相融合，可能激发机体的异物反应或免疫排斥反应，使其在 使用中受到限制。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人源化异种细胞外基 质材料及其制备方法，使所制备的材料不仅具有异种细胞外基质的特征， 而且含有来自人体细胞合成分泌的细胞外基质和多种生长因子，能用于修 复软组织器官缺损并促进损伤愈合，具有生物相容性高、无毒害、显著降低 免疫排斥反应的优点。
本发明所提出的人源化异种细胞外基质材料，是在异种细胞外基质上 复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成的干燥多孔
泡沬状材料；所述的异种细胞外基质是将哺乳动物组织经脱细胞处理后所 形成的生物医用材料，可以是脱细胞真皮基质、脱细胞筋膜、脱细胞小肠粘 膜下层、脱细胞膀胱粘膜下层、脱细胞羊膜、脱细胞硬脑膜、脱细胞肌肉、 脱细胞肌腱、脱细胞血管、脱细胞神经的任一种；所述的人体细胞为成体细 胞、或是成体干细胞，包括皮肤细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、骨 髓间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充质干细胞、肌肉干细胞、 脂肪干细胞的任一种或是几种，其选择是根据所修复组织受区的需求来确定。 本发明人源化异种细胞外基质材料的制备方法，包括细胞获取、异种 细胞外基质制备以及人源化异种细胞外基质材料的制备，具体步骤如下
1) 、细胞的获取细胞来自人体组织，根据所修复组织受区的需求选择 细胞的类型，按常规的细胞培养技术进行体外培养，细胞的大规模扩增可釆
用细胞工厂、生物反应器的方法进行；
2) 、异种细胞外基质的制备将获取的动物皮肤、或筋膜、或小肠粘膜 下层、或羊膜、或肌肉、或肌腱、或血管、或神经的任一种生物材料切成小 块，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐 缓冲液(PBS)漂洗；(若是采用较厚的生物材料，如皮肤真皮层，此时需 置于-80°C冷冻半小时以上，确保材料内外温度达到 一致，取出后自然解冻， 如此反复冻融2 5次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗)；将其置 于0. 1 ~ 1M的NaOH溶液浸泡进行脱脂、脱细胞处理；用PBS溶液浸洗至pH 中性，再置于含有DNA酶和cx-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上， 去除残留的DNA和orgal天然抗原成分，降低免疫原性，用PBS漂洗；为使
种植细胞更容易贴附，经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD多肽)的任一种溶液浸泡20分钟以上；再经干
燥后形成异种细胞外基质，灭菌消毒；其中，所述的过氧乙酸和乙醇终浓度 的体积百分比分别为0.1~0. 5%和2~10%;所述DNA酶的终浓度为30 ~ 50U/ml, a-半乳糖苷酶的终浓度为10~25U/ml;
3) 、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有商用最低必需培 养液DMEM67. 5°/。、商用培养液F12 22.5%、胎牛血清5~15%,胰岛素1~
50 ^g/ml、碱性成纤维细胞生长因子1~10 ng/ml、氢化可的松10 ~ 500 ng/ml、腺嘌呤0. 2 ~ 0. 25 mM、转铁蛋白1 ~ 10 ^g/nil、维生素C 10 ~ 50pg/ml。
4) 、人源化异种细胞外基质材料的制备将体外扩增培养的细胞用细胞 培养液悬浮，按104~106个/2的密度滴加在异种细胞外基质表面，在5 。/oC02环境中37'C条件下静置贴附，置入专用培养液中培养2 3天；弃去 培养液，将异种细胞外基质未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以 104~106个/(^2的密度种植细胞(其两面种植的细胞可以是不同的)，静置 后加入专用培养液培养2 ~ 3天；再将两面复合有紐胞的异种细胞外基质置 于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养6~10天，每2天换 液，培养完成；上述的培养条件均为37。C的5。/。C02环境；
5) 、干燥将完成培养后的材料浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，经冷 冻干燥、灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生 长因子的人源化异种细胞外基质干燥多孔泡沬状材料；所述的冷冻保护液为 Hanks平衡盐溶液中加有O. 1-10°/。葡萄糖、0. 1~5%蔗糖、0. 1~5%海藻糖、 0. 1 ~ 0. 5%人血清白蛋白(均为重量比)。
本发明制备的人源化异种细胞外基质材料，是在去除细胞和天然抗原 成分的动物来源的异种细胞外基质上复合了人体细胞合成分泌的细胞外基 质成分和多种细胞生长因子,使得异种细胞外基质在经过人体细胞改造后具 有人体组织的部分特征，不仅具有异种细胞外基质良好的机械性能，同时 还提高了生物相容性、显著降低了免疫排斥反应，其应用到创面后可引导创 周细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，因此可以明显 促进创面的愈合。由于冷冻干燥过程不仅可使细胞失活，其保存期大大延长;
而且可保护材料中的蛋白质(细胞生长因子、细胞外基质等蛋白质)活性， 发挥其正常生物学功能。同时由冷冻干燥所形成的干燥多孔泡沬状结构能为 创面的细胞提供三维空间结构，利于细胞的长入、增殖，可加速组织的愈合。
本发明人源化异种细胞外基质材料的主要功能有(l)修复机体组织缺损 说、瘘等营养不良和感染创面)；(2)作为组织充填材料而使局部丰满，修复 颜面部凹陷畸形；(3)做为生物支架材料用于其他组织工程器官的制备。
具体实施例方式
以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。 实例一
1) 、成纤维细胞和表皮细胞的获取无菌获取人皮肤组织，去除脂肪层， 切成5mmx5mm大小，中性蛋白酶消化后，分离表皮和真皮组织；用300U/ml 胶原酶消化真皮组织，消化完成后将真皮组织吹散收集细胞液，离心后弃上清 获取成纤维细胞，接种入培养瓶补足成纤维细胞培养液，扩增培养至所需数量； 将分离的表皮用0.25%胰酶消化液消化后，吹散收集细胞液，离心后弃上清获 取表皮细胞，接种入培养瓶补足表皮细胞培养液，扩增培养至所需数量；
2) 、脱细胞小肠粘膜下层的制备将猪空肠用蒸馏水冲洗干净，切成10cm 片段，置于含有0.4% (v/v)过氧乙酸和8% (v/v)乙醇的水溶液中浸泡消 毒1小时；用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后沿纵向剖开，机械刮除小肠粘膜、 肌层和浆膜，用PBS漂洗后，获得粘膜下层；再置入0. 4M的NaOH溶液中4 土2。C条件下脱细胞处理1小时，用PBS漂洗至pH值中性；将其置入含有 40U/ml的DNA酶和20U/ml的a-半乳糖苷酶的混合溶液中，37"C环境下处理 半小时，去除残留的DNA和a-gal天然抗原成分，用PBS漂洗，经脱水干燥 后，使用胎牛血清浸泡30分钟，再经冷冻干燥后，环氧乙烷灭菌消毒；
3) 、专用培养液的配制，各组分按体积百分比为商用最低必需培养液 DMEM 67.5 %、商用培养液F12 22.5%、胎牛血清10%,胰岛素10吗/ml、 碱性成纤维细胞生长因子2 ng/ml、氢化可的松15 ng/ml、腺p票吟0. 2 mM、 转铁蛋白8 pg/tnl、维生素C 40蹄/ml。
4) 、人源化异种细胞外基质材料的制备将体外培养的成纤维细胞和表 皮细胞消化、离心，分别用细胞培养液悬浮，按105个/^2的密度将成纤维 细胞滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面，于5%0)2环境中37。C条件下静置30 分钟，加入专用培养液培养2天，弃去培养液，将脱细胞小肠粘膜下层未 种植细胞的一面向上，再按照上述方法以105个/cm2的密度种植表皮细胞， 静置后加入专用培养液培养3天，再将两面复合有细胞的异种细胞外基质 置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养8天，每2天换液， 即培养完成；上述的培养条件均为37。C的5%0)2环境；
5) 、干燥将完成培养后的人源化异种细胞外基质材料浸泡于冷冻保护 液中30分钟；冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有1%葡萄糖、2%蔗糖、 1%海藻糖、0. 1。/。人血清白蛋白(均为重量比)；经真空冷冻干燥后，环氧乙 烷灭菌消毒，得到冻干的人源化异种细胞外基质材料。
本实例制备的人源化异种细胞外基质材料包含有人成纤维细胞和表皮 细胞合成分泌的多种人源性细胞生长因子和细胞外基质成分，包括bFGF、 EGF、 TGF- Pl、 IL-8、胶原蛋白等，可直接用于修复软组织器官缺损并 促进损伤愈合，能抑制瘢痕形成和创面重塑。 实例二 1) 、脂肪干细胞获取无菌获取人脂肪组织，切成lrm^大小，用400U/ml 胶原酶液消化后，将脂肪组织吹散收集细胞液，离心后弃上清获取脂肪干 细胞；加入细胞培养液后吹悬细胞，接种入培养瓶，扩增培养至所需数量；
2) 、脱细胞猪皮基质的制备将去除脂肪层的猪皮肤切成5cmxl0cm薄 片状，用蒸馏水冲洗干净，置于含有0. 2%过氧乙酸和3%乙醇的水溶液中浸 泡消毒1.5小时；用磷酸盐缓冲液漂洗后，置于-8(TC冷冻40分钟，使猪皮 内外温度达到一致，取出后自然解冻，如此反复冻融3次，使细胞完全破裂 崩解；用去离子水清洗后将其置于O. 8M的NaOH溶液浸泡l小时；再用PBS 液浸洗至pH值中性，将其置干50U/ml的DNA酶和25U/ml的a-半乳糖苷酶 的混合溶液中1小时，去除残留的DNA和a-gal天然抗原成分，用PBS清洗； 经脱水干燥后在0. 1%多聚赖氨酸溶液浸泡50分钟；再经冷冻干燥即成为脱 细胞猪皮基质，钴60灭菌消毒。
3) 、专用培养液的配制，各组分按体积百分比为商用最低必需培养液 DMEM67. 5%、商用培养液F12 22。 5%、胎牛血清10°/。，胰岛素40蹄/ml、碱 性成纤维细胞生长因子5ng/mi、氢化可的松100ng/ml、腺嘌呤0. 22mM、转 铁蛋白6ug/ml、维生素C 30蹄/ml。
4) 、人源化异种细胞外基质材料的制备将体外培养的脂肪干细胞消化、 离心后，用细胞培养液重新悬浮，按106个/(^2的密度滴加在脱细胞猪皮基 质表面后，于5%(:02环境中37X:条件下静置30分钟，加入专用培养液培养 2天，弃去培养液，将脱细胞猪皮基质未种植细胞的一面向上，再按上述方 法以105个/^2的密度种植脂肪干细胞，静置后加入专用培养液培养3天， 再将其取出置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继续培养8天，培
养期间每2天换液，即完成培养；上述的培养条件均为37°C, 5%0)2环境。 5)、干燥将完成培养后的材料浸泡于冷冻保护液中50分钟；冷冻保 护液为Hanks平衡盐溶液中加5%葡萄糖、0. 5%蔗糖、4%海藻糖、0. 2%人血 清白蛋白(均为重量比)；经冷冻干燥，环氧乙烷灭菌消毒后，得到冻干的 人源化异种细胞外基质材料。
本实例制备的人源化异种细胞外基质材料含有脂肪干细胞合成分泌的生 长因子可对成纤维细胞影响来加速创面愈合，用于治疗软组织缺损的愈合。 实例三
1) 、成纤维细胞的获取同实例一；
2) 、脱细胞小肠粘膜下层的制备同实例一；
3) 、专用培养液的配制，各组分按体积百分比为商用最低必需培养液 DMEM 67.5%、商用培养液F12 22.5°/。、胎牛血清10%,胰岛素20 pg/ml、 碱性成纤维细胞生长因子10 ng/ml、氢化可的松200 ng/ml、腺嘌呤0. 25 mM、 转铁蛋白10 pg/ml、维生素C 50|ig/ml。
4) 、人源化异种细胞外基质材料的制备将成纤维细胞用细胞培养液悬 浮，按106个"1112的密度滴加在脱细胞小肠粘膜下层表面，于5%(:02环境中 37。C条件下静置30分钟，加入专用培养液培养3天，弃去培养液，将脱细 胞小肠粘膜下层未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以1()6个/cm2的密 度种植成纤维细胞，静置后加入专用培养液培养2天，再将两面复合有细 胞的脱细胞小肠粘膜下层置于培养器皿内的培养支架上，用专用培养液继 续培养10天，每2天换液，完成人源化异种细胞外基质材料的培养；上述 的培养条件均为37。C、 5%0)2环境；5)、干燥将完成培养后的人源化异种细胞外基质材料浸泡于冷冻保护
液中30分钟；冷冻保护液为Hanks平衡盐溶液中加有0. 5%葡萄糖、2%蔗 糖、1%海藻糖、0. 5%人血清白蛋白(均为重量比)；经真空冷冻干燥，钴60 灭菌消毒后，得到冻干的人源化异种细胞外基质材料。
本实例制备的冻干人源化异种细胞外基质材料经细胞失活处理、冷冻 干燥后可保存12个月，便于临床使用，其含有丰富的人成纤维细胞合成分 泌的多种人源性细胞生长因子和细胞外基质成分，如bFGF、 TGF-P1、 IL -8、胶原蛋白等，能参与肉芽组织及瘢痕形成和后期创面重塑，可用于修 复软组织器官缺损并促进损伤愈合。
权利要求
1.一种人源化异种细胞外基质材料，其特征在于，是在异种细胞外基质上复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子所构成的干燥多孔泡沫状材料；所述的异种细胞外基质是哺乳动物组织经脱细胞处理后所形成的生物医用材料；所述的人体细胞为成体细胞或是成体干细胞。
2、 制备权利要求l所述人源化异种细胞外基质材料的方法，包括有细 胞获取的步骤，其特征在于，具体步骤如下1) 、细胞的获取根据所修复组织受区的需求选择细胞的类型，按常规 的细胞培养方法进行体外培养和大规模扩增；2) 、异种细胞外基质的制备将获取的动物皮肤、或筋膜、或小肠粘膜下层、或羊膜、或肌肉、或肌腱、或血管、或神经的任一种生物材料切成小块，置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时；用磷酸盐 缓冲液漂洗；置于NaOH溶液浸泡处理后，用磷酸盐缓冲液浸洗至pH中性， 再置于含有DNA酶和a-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡25分钟以上，用磷酸盐缓冲液漂洗；经脱水干燥后使用牛血清或胶原蛋白或多聚赖氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的任一种溶液浸泡20分钟以上；再经干燥后形成异种细胞 外基质，灭菌消毒；3) 、专用培养液的配制，其组分按体积百分比包括有商用最低必需培 养液DMEM67. 5%、商用培养液F12 22.5°/。、胎牛血清5 ~ 15%，胰岛素1~ 50 |ig/ml、碱性成纤维细胞生长因子1~10 ng/ml、氩化可的松10-500 ng/ml、腺P票呤0. 2 ~ 0. 25 mM、转铁蛋白1 ~ 10 pg/ml、维生素C 10 ~ 50pg/ml;4) 、人源化异种细胞外基质材料的制备将体外扩增培养的细胞用细胞培养液悬浮，按104~106个/(^2的密度滴加在异种细胞外基质表面，在5 %(:02环境中37匸条件下静置贴附后，置入专用培养液中培养2-3天；弃去培养液，将异种细胞外基质未种植细胞的一面向上，再按照上述方法以 10" 106个/cm2的密度种植细胞，静置后加入专用培养液培养2-3天；再将两面复合有细胞的异种细胞外基质置于培养器皿内的培养支架上，用专 用培养液继续培养6~10天，每2天换液，培养完成；上述的培养条件均 为371的5%0)2环境；5)、干燥将完成培养后的材料浸泡于冷冻保护液中25分钟以上，经冷 冻干燥、灭菌消毒后，得到复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生 长因子的人源化异种细胞外基质干燥多孔泡沬状材料。
3、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述过 氧乙酸的终浓度体积比为0. 1~0.5%,乙醇的终浓度体积比为2~10%;所述 DNA酶的终浓度为30~50U/nil， a-半乳糖苷酶的终浓度为10~25U/ml。
4、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的浸泡 消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，将材料置于-8(TC冷冻半小时以上，取出后自 然解冻，如此反复冻融2 5次，用磷酸盐缓冲液清洗后再于NaOH溶液浸泡。
5、 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤5)中所述的冷 冻保护液为Hanks平衡盐溶液中按重量比加有0. 1 ~ 10%葡萄糖、0. 1 ~ 5%蔗 糖、0. 1~5%海藻糖、0. 1~0. 5%人血清白蛋白。
全文摘要
一种人源化异种细胞外基质材料，本发明是异种细胞外基质上复合有人体细胞合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子构成的干燥多孔泡沫状材料；所制备的人源化异种细胞外基质材料去除了细胞和天然抗原成分，其应用到创面后，可直接参与创面的修复，所含的细胞生长因子，能引导创周细胞的长入、血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，因此可以明显促进创面的愈合；另外，所制备的产品为干品，使保存期大大延长，不仅具有人体组织的部分特征，和异种细胞外基质良好的机械性能，同时还对人体的生物相容性高、显著降低免疫排斥反应，可覆盖创面、充填软组织缺损、促进创周细胞的生长和增殖，修复软组织器官缺损并促进损伤愈合。
文档编号A61L27/56GK101366976SQ200810150789
公开日2009年2月18日 申请日期2008年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者王爱军 申请人:陕西瑞盛生物科技有限公司