专利名称：丹参总酚酸制备方法
技术领域：
本发明涉及中药领域，具体涉及一种丹参总酚酸制备方法。
背景技术：
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根茎，是我国传统医学中应用最早且最为广泛的药物之一，经过长期的临床应用和现代医学研究，对其临床效果、药理作用有了全面的认识。传统中医药理论认为丹参能活血祛瘀；调经止痛；养血安神；凉血消痈，主治妇女月经不调；痛经；经闭；产后瘀滞腹痛；心腹疼痛；癥瘕积聚；热痹肿痛；跌打损伤；热入营血；烦躁不安；心烦失眠；痈疮肿毒。现代药理学研究表明，丹参具有脑缺血保护、改善冠脉血流量及微循环、促进组织修复、抗血小板聚集、抗肿瘤、抗炎抑菌等功效，临床上主要用于冠心病冠心病、急性心肌梗塞、脑梗塞、慢性肝炎等病。近年来研究还发现，丹参对失眠、慢性肝炎、肿瘤和消化道溃疡等病症也有一定疗效。(中国专利，申请号200710111232.4，申请日2007.6.18)。
丹参中的有效成分包括脂溶性成分和水溶性成分。脂溶性成分是以丹参酮为代表的醌类化合物，具有良好的抗炎作用；水溶性成份主要有丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(A、B)，总称为总酚酸，也有报道称为丹参多酚酸盐或丹参多酚酸。丹参总酚酸具有明显的抗血栓形成、溶纤和抗脂质过氧化等作用，是治疗心肌缺血、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病的有效成分，其中丹酚酸B的含量最高，而且是其主要的活性成分。(丹参中总酚酸的分离纯化工艺研究，杨小宁等，中草药，2007，38(6)843-846)。
丹参总酚酸的提取方法多为先用水提取，再用乙醇沉淀，大孔树脂纯化的方法，醇沉效率低、损失大(王志平等，丹参提取液的树脂吸附及醇沉工艺对比研究，离子交换与吸附，2003，19(6)554-560)。杨小宁等对原有水提醇沉工艺进行了优化和改进，但因丹酚酸的稳定性差，水提取丹酚酸B的转移率低，而且总酚酸和丹酚酸B的含量均比较低，分别为51.62％和30.97％(丹参中总酚酸的分离纯化工艺研究，杨小宁等，中草药，2007，38(6)843-846)。
发明内容
为了解决上述问题，本发明在不增加成本的基础上提供了一种丹参总酚酸的制备方法，采用该方法丹酚酸B转移率高，产品中总酚酸和丹酚酸B的含量高、质量好、易于产业化。
本发明的另一目的是提供以上述方法得到的丹参总酚酸。
本发明的又一个目的是提供以丹参总酚酸为活性成分的药物组合物。
本发明的再一个目的是提供丹参总酚酸的应用。
本发明基本包括以下步骤 (a)丹参用含水低级醇提取； (b)提取液上聚酰胺或大孔树脂柱分离。
本发明进一步通过下述技术方案实现 (1)丹参去除杂质，粉碎或制成饮片，用含水低级醇提取； (2)步骤(1)所得提取液上聚酰胺柱或大孔树脂柱，用重量百分比浓度为10-60％的含水低级醇I冲洗，再用重量百分比浓度为40-95％的含水低级醇II洗脱，收集洗脱液； (3)洗脱液浓缩，干燥，即得丹参总酚酸。
步骤(1)中，低级醇为C1～C4的直链或支链饱和烷基醇，包括甲醇(CH3OH)、乙醇(CH3CH2OH)、正丙醇[CH3(CH2)OH]、异丙醇[(CH3)2CHOH]、CH3(CH2)3OH、(CH3)2CH2CHOH、CH3CH2CH(CH3)OH、(CH3)3COH；优选甲醇、乙醇、异丙醇；进一步优选甲醇、乙醇；最优选乙醇。含水低级醇重量百分比浓度为10～90％，优选为30～85％。
提取的方法包括回流提取、煎煮、浸渍、渗漉、逆流萃取等本领域常规的提取方法，但不限于此。提取的具体参数，如提取液用量、时间、温度等，本领域人员可以根据本领域的常识和现有技术确定，无需创造性劳动。有关的名词术语参见(中药提取方法研究进展，赵孟春等，猪业科学，2007，2，32-33)。
由于提取液中可能会存在有色杂质，更好的，在进行步骤(2)之前，可以将洗脱液通过离子交换树脂，以除去色素。
步骤(2)中，步骤(1)提取所得到的提取液可以直接上聚酰胺柱或大孔树脂柱进行分离，也可以先浓缩后再上聚酰胺柱或大孔树脂柱进行分离。所述含水低级醇I的重量百分比浓度优选为10-40％，最优选为20-35％；含水低级醇II重量百分比浓度优选为40-95％，最优选为50-80％；对于同一次分离过程，含水低级醇I浓度小于含水低级醇II。
步骤(2)中所述的大孔吸附树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱酸性或弱碱性等任意一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806、ZTC-1等，优选弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101、ZTC-1，最优选苯乙烯型，如AB-8型树脂；所述的聚酰胺材料为己内酰胺(尼龙-6)。采用聚酰胺柱或大孔吸附树脂柱分离时的参数，如上样量、洗脱速度、柱的径高比等，本领域人员可以根据本领域的常识和现有技术确定，无需创造性劳动。
依本发明方法制得的丹参总酚酸作为药物活性成分，可以加入药学上可接受的辅料制成任何一种药剂学上所说的药物组合物，也可以加入其他药物一起制成复合制剂。
本发明的药物组合物，是单位剂量的药物制剂形式，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。
本发明的组合物其中的有效组分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。
本发明的组合物，通过将上述有效组分和药物可接受的载体混合制备得到。
本发明的组合物，其药物制剂形式可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；和注射剂，如粉针剂、注射液、输液等。
本发明的组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本发明的组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如1-20袋或粒或片。
由于丹参总酚酸为丹参中的水溶性成分，所以本领域的技术人员多采用传统的水提醇沉方法，有效成分损失大。但是因丹酚酸的稳定性差，水提取丹酚酸B的转移率低，最高仅有35％，而且杂质含量高。本发明人通过大量的研究发现，采用一定浓度的含水C1～C4低级醇进行提取，丹酚酸B的转移率明显提高，一般可达70～90％(采用75％甲醇则高达95％以上)，同时HPLC显示提取液中丹参总酚酸的杂峰明显减少。所以采用本发明制备方法，有效成分损失少，得到的产品质量好，总酚酸含量≥80％，丹酚酸B的含量≥50％，疗效确切。同时由于聚酰胺柱层析和大孔树脂是生产中比较常用的分离手段，而且可以使产品得到有效的分离，所以相对于其他分离方法，不会增加成本。
采用本发明方法制得的丹参总酚酸，可应用于制备治疗以下疾病的药物，即心脑血管疾病、肾病、肝病、肺炎、肺心病、胰腺炎、糖尿病、颈椎病、眼底血管性疾病、眼底神经性疾病、偏头痛、慢性胃炎、眩晕、骨伤性疾病、高原疾病、老年痴呆等。
下面以按照实施例3的方法制备的丹参总酚酸为例，考察其对缺血再灌注小鼠的学习记忆功能障碍的改善作用和耐缺氧能力的影响。
试验例丹酚酸对缺血再灌注小鼠的学习记忆功能障碍的改善作用和耐缺氧能力的影响。
动物昆明种小鼠，♂，体重23±4g，共84只，中国医学科学院试验动物中心提供。合格证医动字第01-3008 实验仪器小鼠跳台实验自动记录仪，中国医学科学院仪电室制造. 试验方法小鼠随机分为七组假手术组，对照组(iv等容量生理盐水)，复方丹参注射液组(分别iv丹参注射液50mg/kg，200mg/kg，2g/kg)，丹酚酸组(分别iv总丹酚酸3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg)，每组12只，以戊巴比妥钠(60mg/kg，ig)麻醉后，仰卧位固定。颈正中切口，分离双侧颈总动脉，并穿以零号丝线。双侧颈总动脉阻断血流10min，然后恢复血流10min，如此重复三次，缝合皮肤，术后小鼠正常饲养[1]。假手术组只分离双侧颈总动脉。缺血再灌注后10min，尾静脉注射药物，每天一次，连续三天。第二天给药半小时后进行跳台实验[2]。将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境3min，然后向底部栅板通电，观察小鼠跳上高台时间(反应时间)和5min内小鼠由高台跳下受到电击的次数(训练期错误次数)。24小时后，将小鼠放于实验仪高台上，底部栅板同时通电，记录小鼠跳下高台的时间(潜伏期)，和5min内受到电击次数(重测期错误次数)。缺血再灌注小鼠分组与给药方法同上，采用断头法完全中断全脑血液供应，观察小鼠全脑停止供血后张口呼吸持续时间。
试验结果上述结果用X±S表示，组间比较用t检验。
(1)丹酚酸iv对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 跳台试验主要是观察训练后24小时记忆获得障碍的影响，训练期的反应时间和错误次数仅供参考.如表1示，与对照组相比，丹酚酸3mg/kg可减少反应时间(P＜0.05)，延长潜伏期(P＜0.05)，减少重测期错误次数(P＜0.01)；丹酚酸6mg/kg可延长潜伏期(P＜0.01)，减少重测期错误次数(P＜0.01)；丹酚酸10mg/kg可减少反应时间(P＜0.001)，延长潜伏期(P＜0.01)，减少测试期和重测期错误次数(分别为P＜0.05，P＜0.01)。复方丹参注射液50mg/kg可减少反应时间(P＜0.05)，减少训练期错误次数(P＜0.05)，复方丹参注射液200mg/kg可延长潜伏期(P＜0.01)，减少训练期和重测期错误次数(P＜0.05，p＜0.01)，复方丹参注射液2g/kg可减少反应时间(P＜0.001)，可延长潜伏期(P＜0.001)，减少训练期和重测期错误次数(分别为p＜0.001，p＜0.01)， 表1丹酚酸和复方丹参注射液iv对小鼠脑缺血再灌注损伤引起的记忆障碍的保护作用
*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 VS.对照组 (2)丹酚酸iv对脑缺血再灌注小鼠的耐缺氧能力的影响 如表2示，与对照组相比，丹酚酸3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg和复方丹参注射液50mg/kg，200mg/kg，2g/kg皆可显著提高脑缺血再灌注小鼠的耐缺氧能力(p＜0.001). 表2丹酚酸和复方丹参注射液iv对脑缺血再灌注小鼠耐缺氧能力的影响
*P＜0.05 ***P＜0.001 VS.对照组 试验结论丹酚酸3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg可改善脑缺血再灌注小鼠的学习记忆，显著提高其耐缺氧能力，丹酚酸10mg/kg的作用与复方丹参注射液2g/kg的作用相当。
具体实施例方式 下面通过具体的实施方式对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。
丹参总酚酸和丹酚酸B的检测方法按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定。
(1)丹酚酸B用HPLC法测定，检测波长288nm，标准品丹酚酸B由天津天士力集团现代中药研究所提供，纯度98.0％。
(2)丹参总酚酸含量＝F(A-B)+B 其中A为分光光度法测定以丹酚酸B为对照计算的总酚酸含量 B为高效液相色谱法测定的丹酚酸B含量 F为校正因子0.626 实施例1 丹参饮片1000克，10000ml60％乙醇回流提取三次。合并提取液，浓缩至无醇，过滤，滤液通过500克聚酰胺柱，10000ml水冲洗，95％乙醇10000ml洗脱，浓缩洗脱液，干燥。得提取物40克，丹酚酸B含量57％、丹参总酚酸86.6％。
实施例2 丹参饮片1000克，6000m75％甲醇提取三次。合并提取液，浓缩至无醇，过滤，滤液通过2000克AB-8大孔树脂，15000ml水冲洗，80％乙醇洗脱至完全，浓缩洗脱液，喷雾干燥。得提取物45克，丹酚酸B含量64％、丹参总酚酸93.4％。
实施例3 丹参饮片1000克，15000m75％乙醇逆流萃取。合并提取液，浓缩至无醇，过滤，滤液通过2000克D101大孔树脂树脂，15000ml0％乙醇冲洗，50％乙醇10000ml洗脱，浓缩洗脱液，60度真空干燥。得提取物37克，丹酚酸B含量64％、丹参总酚酸89.5％。
实施例4 丹参饮片1000克，15000m75％乙醇逆流萃取。合并提取液，浓缩至无醇，过滤，滤液通过500克聚酰胺，12000ml30％乙醇冲洗，95％乙醇12000ml洗脱，浓缩洗脱液，干燥。得提取物30克，丹酚酸B含量66％、丹参总酚酸96.5％。
实施例5 丹参饮片1000克，6000m30％乙醇回流提取三次。合并提取液，过滤，滤液通过500克聚酰胺柱，12000ml50％乙醇冲洗，95％乙醇12000ml洗脱，收集洗脱液，浓缩洗脱液，干燥。得提取物45克，丹酚酸B含量58％、丹参总酚酸88.7％。
实施例6片剂 处方 丹参总酚酸提取物100g 微晶纤维素 50g 淀粉100g 羧甲基淀粉钠12g 5％PVP无水乙醇 适量 硬脂酸镁3g 制成 1000片 工艺 1制粒 原料药丹参总酚酸提取物及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量丹参总酚酸提取物与微晶纤维素、淀粉及羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量PVP无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50～60℃干燥1小时，加入处方量的硬脂酸镁用14目筛整粒。
2压片 取上述颗粒用特制菱形异型冲模压片。
实施例7胶囊 处方 丹参总酚酸提取物 100g 淀 粉200g 羧甲基淀粉钠 12g 5％PVP无水乙醇适量 硬脂酸镁 3g 制成 1000粒 工艺 1制粒 原料药丹参总酚酸提取物及处方中其它辅料分别过100目筛，称取处方量丹参总酚酸提取物与淀粉及羧甲基淀粉钠采用等量递加法混合均匀，用适量PVP无水乙醇溶液制软材，14目筛制粒，50～60℃干燥1小时，加入处方量的硬脂酸镁用14目筛整粒。
2压片 取上述颗粒装入胶囊。
实施例8冻干粉针 处方 丹参总酚酸提取物 100g 甘露醇 100g 注射用水 2000ml 制成 1000支 工艺 称取原料药丹参总酚酸提取物及处方中辅料甘露醇，加注射用水1500ml，搅拌溶解，0.5克活性碳搅拌脱色20分钟，0.45微米微孔滤膜脱碳，补水到2000毫升，除菌过滤、分装、冷冻干燥，即得。
权利要求
1.一种丹参总酚酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤
(1)丹参用含水低级醇提取；
(2)提取液上聚酰胺或大孔树脂柱分离。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述低级醇为C1～C4的直链或支链饱和烷基醇；
步骤(1)中，含水低级醇重量百分比浓度为10～90％；提取方法选自回流提取、煎煮、浸渍、渗漉和逆流萃取；
步骤(2)中，还包括提取液上聚酰胺柱或大孔树脂柱，用重量百分比浓度为10-60％的含水低级醇I冲洗，再用重量百分比浓度为40-95％的含水低级醇II洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥；对于同一次分离过程，含水低级醇I浓度小于含水低级醇II。
3.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述低级醇为甲醇、乙醇或异丙醇；
步骤(1)中，含水低级醇重量百分比浓度为30～85％；
步骤(2)中，所述含水低级醇I的重量百分比浓度为10-40％，含水低级醇II重量百分比浓度为40-95％。
4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，
所述低级醇为乙醇；
步骤(2)中，所述含水低级醇I的重量百分比浓度为20-35％，含水低级醇II重量百分比浓度为50-80％。
5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的大孔吸附树脂为苯乙烯型，聚酰胺材料为己内酰胺。
6.利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)在上柱分离前，将提取液通过离子交换树脂。
7.以权利要求1-6任意一项制备方法制备的丹参总酚酸。
8.权利要求7所述的丹参总酚酸，其特征在于，其中的总酚酸含量≥80％，其中的丹酚酸B的含量≥50％。
9.以权利要求7所述的丹参总酚酸为活性成分，加入药学上可接受的辅料制成的任何一种药剂学上所说的剂型的药物组合物。
10.权利要求7所述的丹参总酚酸在制备治疗以下疾病的药物中的应用，所述疾病包括心脑血管疾病、肾病、肝病、肺炎、肺心病、胰腺炎、糖尿病、颈椎病、眼底血管性疾病、眼底神经性疾病、偏头痛、慢性胃炎、眩晕、骨伤性疾病、高原疾病、老年痴呆。
全文摘要
本发明公开了一种丹参总酚酸的制备方法，包括如下步骤(1)丹参用含水低级醇提取；(2)提取液上聚酰胺或大孔树脂柱分离。采用本发明的制备方法丹酚酸B的转移率高，一般可达50～70％；有效成分损失少，得到的产品质量好，总酚酸含量≥80％，丹酚酸B的含量≥50％，疗效确切。本发明还公开了其药剂学上所说的制剂，及其制药用途。
文档编号A61P19/00GK101721467SQ200810152400
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者岳洪水 申请人:天津天士力之骄药业有限公司