养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法

专利名称：：养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法
技术领域：
：本发明属于渔用疫苗领域，具体地涉及一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法。
背景技术：
：养殖鲆鱼(包括大菱鲆和褐牙鲆)是我国海水工厂化主要养殖鱼类品种，养殖产量占到海水工厂化养殖鱼类产量的60%以上，经济效益显著。随着养殖规模的扩大，在养殖过程中出现了二种腹水病，其症状为肝、肾肿大，腹部膨胀，腹腔内充满微黄泛红色液体，肠道有积液。传统治疗方法是使用大剂量抗生素浸泡或口服，治疗效果不明显，也不稳定，患病鱼死亡率高达70%以上，经济损失巨大，严重制约了鲆鱼养殖业的健康发展。长期大剂量使用抗生素，不仅没有获得良好的治疗效果，在严重污染环境的同时，还产生了耐药性，抗生素在鱼体内的残留还产生了食品安全问题，引起人们的高度关注。随着鱼类免疫学的快速发展，免疫成为防治疾病发生和流行最有希望、最有效的途径。为此我们开展了养殖鲆鱼腹水病流行病学调査研究，应用定点调査和普査相结合、集中调査和跟踪调査相结合的方法，掌握养殖鲆鱼腹水病发生流行规律，通过分离纯化和回感实验筛选致病菌，应用生理生化和分子生物学相结合的方法鉴定致病病原菌为迟缓爱德华氏菌(^^aro^'e"3ter(/a)、溶藻弧菌(J^Woa/gZ"o/^a^)，两种菌单独或同时感染养殖鲆鱼均可导致腹水病的发生。迟缓爱德华氏菌是一种革兰氏阴性肠道病原菌，感染宿主范围广，危害大。在水产养殖生物中，该菌是鱼类(鳗、鲇、鲆等)、两栖类(蛙)、爬行类(鳖、鍔鱼)的重要致病菌。爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)是水产养殖中最常见的传染病之一，不仅影响了养殖生物的健康，并对水产养殖业危害巨大。溶藻弧菌是一种革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于海水中，海湾地区较多，在有些海湾是弧菌的优势种，其数量与海水温度、盐度和有机物质含量呈正相关。可引起多种水生动物发生疾病，南美白对虾细菌性红体病，中国对虾褐体综合症，养殖鲑点石斑鱼、点带石斑鱼、鯢状黄姑鱼、军曹鱼以及大黄鱼的溃疡病，三疣梭子蟹肌肉乳化病、养殖鲍急性死亡症等均是感染溶藻弧菌所致。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。本发明的第二个目的是提供一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法。本发明的技术方案概述如下一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，32'C37。C培养24h48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固祐培养基或液体培养基中，28。C35"培养24h48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水或pH=7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为108CFU/mL1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.13的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。所述灭活为热灭活或化学方法灭活。所述热灭活的温度为60°C~70°C，灭活时间为24h30h。所述化学方法灭活所用灭活剂为甲醛或苯酚，所述加入甲醛后的终体积百分比浓度为0.1°/。1.0%，所述加入苯酚后的质量体积百分比浓度为1.0%2.0%，温度为20°C35°C，时间为48h96h。一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，是由下述步骤组成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，32'C37'C培养24h48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，28。C35。C培养24h48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水或pH=7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为108CFU/mL1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.13的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。所述灭活为热灭活或化学方法灭活。所述热灭活的温度为6(TC70。C，灭活时间为24h30h。所述化学方法灭活所用灭活剂为甲醛或苯酚，所述加入甲醛后的终体积百分比浓度为0.1%1.0%，所述加入苯酚后的终质量体积百分比浓度为1.0%2.0%，温度为20'C35'C，时间为48h96h。本发明的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗能有效地防治养殖鲆鱼腹水病的发生和流行，避免了因大量使用抗生素而在鱼体内残留对人体造成的危害，提高养殖产品安全度，同时也不会对环境造成污染。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。，实施例1一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，制备方法为(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株(ATCC15947菌株)活化，接种在液体培养基中(液体培养基是将25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基)在32'C37'C的气浴摇床中培养36h，当迟缓爱德华氏菌生长至平台期时终止培养，收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为0.5%，温度为35'C，灭活时间为48h，期间每隔8h摇匀一次，按照《中国兽药典》无菌检验和甲醛残留量检验方法进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格，即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，保存在2'C8'C冰箱中；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株(中国农业微生物菌种保藏管理中心02676菌株)活化，接种在液体培养基中(将25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基)在28'C35'C的气浴摇床中培养36h，当溶藻弧菌生长至平台期时收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为0.5%，温度为35'C，灭活时间为48h，期间每隔8h摇匀一次，按照《中国兽药典》无菌检验和甲醛残留量检验方法进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格，即制成溶藻弧菌灭活菌苗，保存在2t:8"C冰箱中；(3)分别用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为101QCFU/mL，再将二者等体积混合均匀即配制成腹水病二联灭活菌苗，装入无菌塑料桶、三角烧瓶或无菌玻璃瓶中，4。C保存备用。该种腹水病二联灭活菌苗制剂适宜应用于口服接种免疫和浸泡接种免疫。按照《兽用生物制品试验研究技术指导原则》安全、效力试验要求，开展腹水病二联灭活菌苗安全、效力试验。分别取体长3.0cm3.5cm牙鲆、大菱鲆幼鱼400尾，各随机分成8组，每组50尾牙鲆、大菱鲆，其中2组用于安全试验，6组用于效力试验。浸泡接种方法在50L洁净的养殖用海水中，根据菌苗终浓度3Xl(fCFU/mL要求加入适量养殖鲆鱼腹水病灭活菌苗，混合均匀，放入相应试验组牙鲆或大菱鲆幼鱼，浸泡0.5h。浸泡期间连续不间断增氧，保证水中溶解氧含量充足。浸泡结束后，捞出实验鱼放养于相应组试验水槽。灭活菌苗安全试验将灭活菌苗终浓度调整为3X109CFU/mL，按上述浸泡接种方法进行处理。对照组不加菌苗进行相同处理。养殖观察2周。试验结果记录于表l。灭活菌苗效力试验按上述浸泡接种方法进行免疫接种，初免后7d15d，同样方法加强免疫一次。初免后20d，应用迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌菌悬液进行攻毒，菌液浓度为2.4X108CFU/niL，腹腔注射0.05ral，观察记录试验鱼死亡情况，并对死亡鱼进行剖检和细菌学检验，确定实验鱼是由病原菌攻击致死。试验结果记录于表l。表1养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗安全、效力试验记录表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表l可以看出养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗对牙鲆、大菱鲆无毒副作用，是安全的。迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌灭活菌苗单独浸泡免疫或养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗浸泡免疫，均获得60%以上的免疫保护率，说明腹水病二联灭活菌苗是有效的，可以组合使用。实施例2一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，制备方法为由患腹水病牙鲆肾脏分离出的迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌，经过单菌落纯化，获得迟缓爱德华氏菌和溶藻弧菌菌株，分别接种于普通营养琼脂平板(1升普通营养琼脂添加了20gNaCl制成)，在33'C35'C细菌培养箱中培养24h，用0.85%无菌生理盐水洗下菌苔，反复漩涡震荡分散粘连的菌体，加入适量甲醛，使甲醛在菌液中的终体积百分比浓度为0.5%，室温灭活48h，每隔8h摇匀一次。按照《中国兽药典》无菌检验和甲醛残留量检验方法进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格，获得迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌灭活菌苗，保存在2'C8"C冰箱中；分别测定迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌灭活菌苗浓度，按照数量比为1:1的比例将二者混合均匀，配制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。用生理盐水调整菌苗浓度为3X109CFU/mL，装入玻璃瓶，保存于4。C冰箱。该种腹水病二联灭活菌苗制剂适宜应用于注射接种免疫、口服接种免疫和浸泡接种免疫。按照《兽用生物制品试验研究技术指导原则》安全、效力试验要求，开展腹水病二联灭活菌苗安全、效力试验。，分别取体长9.5cm10.5cm牙鲆、大菱鲆鱼种400尾，各随机分成8组，每组50尾牙鲆、大菱鲆，其中2组用于安全试验，6组用于效力试验。注射接种方法将试验鱼放入含3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐(MS-222)0.05g/L2.Og/L海水溶液中麻醉后，迅速用连续注射器腹腔注射0.lml灭活菌苗。灭活菌苗安全试验按上述注射接种方法腹腔注射接种0.2ml灭活菌苗，对照组腹腔注射0.2ml无菌生理盐水。养殖观察2周。试验结果记录于表2。灭活菌苗效力试验按上述注射接种方法进行免疫接种，初免后7d加强免疫一次。初免后20d，应用迟缓爱德华氏菌、溶藻弧菌进行攻毒，菌液浓度为2.4X108CFU/mL，腹腔注射0.05ni1，观察记录试验鱼死亡情况，并对死亡鱼进行剖检和细菌学检验，确定实验鱼是由病原菌攻击致死。试验结果记录于表2。表2养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗安全、效力试验记录表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表2可以看出养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗对牙鲆、大菱鲆没有毒副作用，是安全的。迟缓爱德华氏菌菌苗、溶藻弧菌菌苗单独注射免疫或养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗注射免疫，均获得80%以上的免疫保护率，说明养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗是有效的，可以组合使用。实施例3一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基中，32。C35。C培养48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行无菌检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基中，28'C3(TC培养48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行无菌检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为108CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌溶藻弧菌数量比为1:0.1的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。本实施例中提到的灭活为热灭活，热灭活的温度为60'C，灭活时间为30h。实施例4一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基中，34。C37X:培养24h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行无菌检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为将15gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基中，30'C35'C培养24h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行无菌检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为将15gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:3的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。本实施例中提到的灭活为热灭活，热灭活的温度为70'C，灭活时间为24h。(也可以选用温度为65。C，灭活时间为26h。)实施例5一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，是用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基中，34"C37'C培养24h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时终止培养，收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为1.0%，在25。C条件下，灭活48h，进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为将25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基中，28'C33。C培养36h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时终止培养，收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为1.0%，在25'C条件下，灭活48h，进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为将25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为10WCFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:1的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。实施例6一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，是用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在液体培养基中，35'C37'C培养36h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时终止培养，收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为0.2%，温度为28'C条件下，灭活96h,进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述液体培养基是将15gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在液体培养基中，28'C32'C培养32h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时终止培养，收获，加入甲醛，使甲醛的终体积百分比浓度为0.2%，温度为28。C条件下，灭活96h，进行无菌检验和甲醛残留量检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述液体培养基是将15gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用pH-7.2、O.IM的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为101QCFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.5的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。实施例7一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，是用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在液体培养基中，32'C37。C培养36h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时终止培养，收获，加入苯酚，使苯酚的终百分比浓度为1.0%(g/100ml)，温度为28。C3(TC条件下，灭活48h，进行无菌检验和苯酚残留量检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述液体培养基是将20gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在液体培养基中，30'C35'C培养30h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时终止培养，收获，加入苯酚，使苯酚的终百分比浓度为1.0%(g/100ml)，温度为28t)3(TC条件下，灭活48h，进行无菌检验和苯酚残留量检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述液体培养基是将20gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用pH-7.2、O.IM的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:2的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的使用方法一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗可用于具有感染危险性的各阶段养殖鲆鱼。一般多在鱼苗或鱼种阶段进行接种，刺激鱼体产生有效抗体，保护养殖鲆鱼抵抗致病菌的攻击。菌苗接种方法有口服、浸泡、注射等。在鱼苗阶段适宜采用口服或浸泡方法接种，在鱼种阶段，为了获得更好的免疫保护效果，适宜采用注射方法接种。口服接种方法将一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗均匀混合在糊精、蔗糖、淀粉等混合物中，低温制成适宜粒径的颗粒饵料，空腹进行投喂，每次接种剂量为106cfu101()Cfu/gi。浸泡接种方法将一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗按终浓度107cfu109CFU/mL加入到适宜体积的洁净养殖水中，然后投入适量鱼苗或鱼种，连续浸泡10min30min。浸泡期间连续增氧，保证水中溶解氧含量在5mg/L以上。浸泡结束，将鱼苗或鱼种捞出，放入养殖池进行正常养殖。注射接种方法根据免疫鱼大小，接种剂量为lX10Scfu10X108cfb/尾鱼。应用生理盐水或中性磷酸盐缓冲液调整一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗浓度，控制注射剂量在0.1ml0.5ml。注射部位可选择皮下、背部肌肉或腹腔进行注射接种。权利要求1.一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，其特征是用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，32℃～37℃培养24h～48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将15～25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将15～25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，28℃～35℃培养24h～48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将15～25gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将15～25gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85％的生理盐水或pH＝7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为108CFU/mL～1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.1～3的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。2.根据权利要求1所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，其特征是所述灭活为热灭活或化学方法灭活。3.根据权利要求2所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，其特征是所述热灭活的温度为60。C70。C，灭活时间为24h30h。4.根据权利要求2所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗，其特征是所述化学方法灭活所用灭活剂为甲醛或苯酚，所述加入甲醛后的终体积百分比浓度为0.1%1.0%，所述加入苯酚后的终质量体积百分比浓度为1.0%2.0%，温度为20。C35。C，时间为48h96h。5.—种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，其特征是由下述步骤组成-(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗将迟缓爱德华氏菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，32'C37。C培养24h48h，当所述迟缓爱德华氏菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成迟缓爱德华氏菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗将溶藻弧菌菌株活化，接种在固体培养基或液体培养基中，28。C35。C培养24h48h，当所述溶藻弧菌生长至平台期时收获，灭活，进行检验，检验合格后即制成溶藻弧菌灭活菌苗，所述固体培养基为2216E培养基或将1525gNaCl添加到1升普通营养琼脂培养基中制成的培养基，所述液体培养基是将1525gNaCl添加到1升营养肉汤培养基中制成的培养基；(3)用质量体积百分比浓度为0.85%的生理盐水或pH=7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为108CFU/mL1012CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌:溶藻弧菌数量比为1:0.13的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。6.根据权利要求5所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，其特征是所述灭活为热灭活或化学方法灭活。7.根据权利要求6所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，其特征是所述热灭活的温度为60°C70°C，灭活时间为24h30h。8.根据权利要求6所述的一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗的制备方法，其特征是所述化学方法灭活所用灭活剂为甲醛或苯酚，所述加入甲醛后的终体积百分比浓度为0.1%1.0%,所述加入苯酚后的终质量体积百分比浓度为1.0%2.0%，温度为20。C35。C，时间为48h96h。全文摘要本发明公开了一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗及制备方法，养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗用下述方法制成(1)制备迟缓爱德华氏菌灭活菌苗；(2)制备溶藻弧菌灭活菌苗；(3)用生理盐水或pH＝7.2、0.1M的无菌磷酸盐缓冲液分别将所述迟缓爱德华氏菌灭活菌苗和所述溶藻弧菌灭活菌苗调整浓度为10⁸CFU/mL～10¹²CFU/mL，再按迟缓爱德华氏菌∶溶藻弧菌数量比为1∶0.1～3的比例混合均匀，即制成一种养殖鲆鱼腹水病二联灭活菌苗。本发明的菌苗能有效地防治养殖鲆鱼腹水病的发生和流行，避免了因大量使用抗生素而在鱼体内残留对人体造成的危害，提高养殖产品安全度，同时也不会对环境造成污染。文档编号A61K39/116GK101411873SQ20081015380公开日2009年4月22日申请日期2008年12月5日优先权日2008年12月5日发明者孙金生,翔李,王雪惠,耿绪云,董学旺,薛淑霞申请人:天津市水产养殖病害防治中心