专利名称：：一种稳定的动物源凝血酶制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及凝血酶，尤其涉及一种稳定的动物源凝血酶制剂及其制备方法。
背景技术：
：现有蛋白制品的病毒灭活/去除方法有其局限性，如S/D法(有机溶剂/表面活性剂法)只对包膜病毒有效，因而导致蛋白制品的应用仍有一定的风险。湿热法(60°C，10小时)、干热法(80°C，72小时或者100°C，30分钟)能够有效地杀灭人类无脂包膜病毒，如B19病毒和甲肝病毒。但是，对于动物源的病毒，如牛细小病毒、猪细小病毒以圆环病毒，由于其为无脂包膜病毒，S/D不能有效地将其杀灭，同时，由于这类病毒对热的抵抗，常用的湿热和干热法对其基本无效。而在国内外批准的众多医用生物材料中，动物来源的产品所占比例不小。因此寻找一种能灭活所有病毒，且对蛋白制品活性影响较小、操作方便的方法，将有助于提高蛋白制品应用的安全性。
发明内容本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成本低廉、性能稳定、耐辐照的稳定的动物源凝血酶制剂及其制备方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现—种稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，该凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受IO(TC病毒灭活30分钟，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。所述的凝血酶为蛋白质，所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量如下(g/100ml)蛋白质L-氯化钠枸橼酸三钠所述的蛋白质、L-(g/100ml):蛋白质0.1-10;0.1-10;0.OHO;0.01-5。精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含0.5-5;L-精氨酸盐酸盐0.1-2;氯化钠0.3-1;枸橼酸三钠1-3。所述的凝血酶制剂还包括残留水分，该残留水分的含量为0.5-15%c优选如所述的凝血酶包括哺乳动物来源的凝血酶。所述的哺乳动物包括牛、马、猪、羊。所述的凝血酶制剂为冻干粉。—种稳定的动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括采用无菌技术获取哺乳动物全血，在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白质含量，计算蛋白质重量，加入稳定剂，搅拌混匀；封装，冻干；在IO(TC下进行30分钟病毒灭活，得到稳定的动物源凝血酶制剂。所述的哺乳动物全血为经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的哺乳动物全血；所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的灭活的条件为在IO(TC下病毒灭活30分钟。本发明采用资源广泛、价格低廉的动物血源作为凝血酶的来源，添加稳定剂提高其稳定性，采用干热进行病毒灭活，并维持良好的功能和结构。与现有技术相比，本发明的动物源凝血酶来源广泛、价格低廉，添加稳定剂保证具有优良的稳定性，10(TC30分钟病毒灭活，在有效地杀灭可能污染有膜病毒的同时，维持凝血酶的功能和结构，确保使用的安全性和有效性；此外，本发明采用的制备方法工艺合理，操作简单，具有良好的应用性。具体实施例方式下面对照具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度IOO级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质1.5g/100ml，氯化钠lg/100ml，L-精氨酸盐酸盐0.5g/100ml，枸橼酸三钠:2.4g/100ml;封装，冻干，除菌过滤；10(TC30分钟病毒灭活，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例2病毒灭活实验根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将纯化液分为两份第一份，每100毫升溶液的组成成分如下蛋白质1.5克，氯化钠l克，L-精氨酸盐酸盐0.5克，枸橼酸三钠2.4克；分装，冻干，除菌过滤；第二份，每100毫升溶液的组成成分如下蛋白质1.5克，维生素C:200mM，氯化钠1克，枸橼酸三钠2.4克，除菌过滤。将上述两部分液体各自分成3等分，每等分分别加入约107qfU/ml的猪细小病毒(PPV)，分装到西林瓶，lml/瓶，粉碎后，再次冷冻干燥，使冻干粉的水分含量《1%。IO(TC30分钟病毒灭活.采用Reed-muenchTCID5。法测定辐照前后病毒滴度降低(TotalReductionFactor,TRF)情况。结果表明，与第二组配方相比较，采用第一组配方作为保护剂，10(TC30分钟病毒灭活，PPV的TRF降低了近4.5-5.5，而抗坏血酸组仅仅降低了2_3.5，说明本发明稳定剂较抗坏血酸组更加有效地增强了病毒灭活作用。实施例3本发明凝血酶稳定性测试及效价测定根据生产工艺流程，按照实施例1方法制备凝血酶。随机抽取两组批号进行稳定性测试，测定指标为凝血酶效价。从每一批号中分别取100套置于冷冻箱中(为期3年)、80套置于37t:及75%相对湿度的烘箱中(为期6个月)、80套置于25t:空调房中(为期6个月)作为测试样本。在此之前，已进行过基线时间测试，且测试结果均合格。在为期3年的实时测试过程中，前半年内每月选取IO套样品进行检测，此后，每半年选取10套样品进行检测，检测结果记录在表1中。表l凝血酶温度实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>凝血酶效价测定将纤维蛋白原配成相当于0.2%凝固物质的纤维蛋白原生理盐水溶液，用磷酸氢二钠溶液(0.05mol/L)或磷酸二氢钠溶液(0.05mol/L)调节pH值为7.07.4，再用生理盐水稀释成0.1%的溶液，备用。标准曲线的制备取凝血酶标准品，加生理盐水溶解，分别配成每ml含5.0，6.4，8.0，10.0单位的标准品溶液。另取内径lcm，长10cm的试管4支，各精密加入纤维蛋白原生理盐水溶液各0.lml，置37t:水浴中，观察纤维蛋白的初凝时间，每种浓度测5次，求均值。以每管中标准溶液的浓度(U)为横坐标，凝结时间(秒)为纵坐标，绘制标准曲线。测定法取样品3瓶，分别精密称取其内容物的重量，按标示量分别加生理盐水配制成标准曲线浓度的溶液，精密吸取0.lml，按标准曲线的制备平行测定5次凝结时间的平均值(误差要求同标准曲线)。在标准曲线上或用直线回归方程求得单位数，按下式计算。凝血酶(单位/瓶)=UxlOxV凝血酶(单位/毫克)=UX10XVw上式中U:0.lml样品在标准曲线上读得的实际单位数V:溶解每瓶凝血酶所用的毫升数W:样品的重量(mg)10:0.lml换算成1.Oml的数实施例4—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质0.lg/100ml，L-精氨酸盐酸盐0.lg/100ml，氯化钠:0.01g/100ml，枸橼酸三钠:0.01g/100ml;封装，冻干，无菌过滤；10(TC30分钟病毒灭活，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例5—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度IOO级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质:10g/100ml，L-精氨酸盐酸盐10g/100ml，氯化钠:10g/100ml，枸橼酸三钠:5g/100ml;封装，冻干，无菌过滤；10(TC30分钟病毒灭活，实现最终灭菌灭病毒，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。实施例6—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质0.5g/100ml，L-精氨酸盐酸盐0.lg/100ml，氯化钠:0.3g/100ml，枸橼酸三钠:lg/100ml;封装，冻干；10(TC30分钟病毒灭活，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。6实施例7—种安全的冻干猪血源凝血酶制剂的制备方法，包括以下步骤根据生产标准操作流程，采用无菌技术获取经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的食用猪全血；在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白含量，计算蛋白重量，将稳定剂加入，搅拌混匀，最终溶液含有蛋白质5g/100ml，L-精氨酸盐酸盐2g/100ml，氯化钠lg/100ml，枸橼酸三钠3g/100ml;封装，冻干，无菌过滤；10(TC30分钟病毒灭活，制得安全的冻干猪血源凝血酶制剂。上述各实施例还可以采用牛、马或羊等哺乳动物的全血替代猪全血制备凝血酶制剂。权利要求一种稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，该凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受100℃病毒灭活30分钟，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。2.根据权利要求1所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶为蛋白质，所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量如下(g/100ml):蛋白质0.1-10;L-精氨酸盐酸盐0.1-10;氯化钠0.01-10;枸橼酸三钠0.01-5。3.根据权利要求2所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的蛋白质、L-精氨酸盐酸盐、氯化钠、枸橼酸三钠的含量优选如下(g/100ml):蛋白质0.5-5;L-精氨酸盐酸盐0.1-2;氯化钠0.3-1;枸橼酸三钠1-3。4.根据权利要求2或3所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶制剂还包括残留水分，该残留水分的含量为0.5-15%。5.根据权利要求4所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的残留水分的含量优选O.5-5%。6.根据权利要求1或2所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶包括哺乳动物来源的凝血酶。7.根据权利要求6所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的哺乳动物包括牛、马、猪、羊。8.根据权利要求1所述的稳定的动物源凝血酶制剂，其特征在于，所述的凝血酶制剂为冻干粉。9.一种如权利要求1所述的稳定的动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括采用无菌技术获取哺乳动物全血，在洁净度100级的生产场地内进行血浆的分离，凝血酶粗提，纯化；测定纯化后凝血酶的蛋白质含量，计算蛋白质重量，加入稳定剂，搅拌混匀；封装，冻干；在IO(TC下进行30分钟病毒灭活，得到稳定的动物源凝血酶制剂。10.根据权利要求9所述的稳定的动物源凝血酶制剂的制备方法，其特征在于，所述的哺乳动物全血为经过严格屠宰前和屠宰后检疫的定点养殖场生产的哺乳动物全血；所述的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氯化钠和枸橼酸三钠；所述的灭活的条件为在IO(TC下病毒灭活30分钟。全文摘要本发明涉及一种稳定的动物源凝血酶制剂，该凝血酶制剂包括凝血酶、稳定剂，所述的凝血酶制剂承受100℃病毒灭活30分钟，在保证有效地杀灭可能污染的病原微生物的同时，维持凝血酶的功能和结构。与现有技术相比，本发明的动物源凝血酶来源广泛、价格低廉，添加稳定剂保证具有优良的稳定性，可以承受100℃病毒灭活30分钟，在有效地杀灭可能污染的病原微生物(包括除朊病毒以外的病毒，细菌，支原体，霉菌等)的同时，维持凝血酶的功能和结构，确保使用的安全性和有效性；此外，本发明采用的制备方法工艺合理，操作简单，具有良好的应用性。文档编号A61K38/48GK101757617SQ200810202980公开日2010年6月30日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者何红兵申请人:上海松力生物技术有限公司