一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物及其制备方法

专利名称：：一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物，是一种预防和治疗骨质疏松症的中药组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：骨质疏松症(osteoporosis，简称OP)，是由于全身骨质及骨组织的微细结构的改变，致使骨强度减弱、骨脆性增加，极易发生骨折的系统性多病因骨骼疾病，属于中医"骨痿"、"骨痹"、"腰痛"、"骨枯"、"骨极"、"骨折"、"绝经前后诸症"、"虚劳"等范畴。研究表明，美国、欧洲和日本大约有7500万人不同程度地患有骨质疏松症，我国也有数千万的患者，尤其是绝经后妇女发病率更高，所以现代中医学家常将此症归为"绝经前后诸症"。随着社会人口老龄化，骨质疏松的发病率在继续增加，由此给家庭和社会带来沉重的负担。因此，骨质疏松症的有效预防与治疗已引起世界医学界的广泛重视。近年来，国内外对骨质疏松症的研究均非常重视，中医药防治骨质疏松症的研究也取得了不少成果，其着重于整体调节，调动内因，作用于多个环节，最终达到纠正机体激素失衡和负钙平tf的功效，疗效得到了充分肯定。检索发现，申请号为02135700.5和200310112783.4的中国专利申请分别公开了两种治疗骨质疏松症的中药及其制备方法，前者主要由一定配比的玄驹、骨碎补、淫羊藿、续断、人参、川芎、生牡蛎、怀牛膝配制而成，后者主要由淫羊藿、骨碎补、炒杜仲、首乌、怀牛膝、土竖虫配制而成。其配药成分均较为复杂，有一定副作用，药效有待进一步提高。
发明内容本发明目的是提供一种预防和治疗骨质疏松症的中药，其副作用小，对原发性骨质疏松症具有较好的预防和治疗效果。本发明的另一个目的是提供该中药的制备方法。本发明的目的通过以下技术方案实现一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物，每份中药组合物主要由下列重量比的原药材制成骨碎补(25~40)%、淫羊藿(20~35)%、怀牛膝(10~25)%、杜仲(10~25)%和鹿角片(5~15)%。优选用量为骨碎补(25~35)%、淫羊藿(20~30)%、怀牛膝(15~25)%、杜仲(15-25)%和鹿角片(5~10)%。最佳用量为骨碎补31%、淫羊藿21%、怀牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%。本发明中各原药材来源如下骨碎补为水龙骨科植物槲蕨Drynariafort彦i(K匿e)J.Sm.的干燥才艮茎，^立丁名为RhizomaDrynariae，产i也四川。淫羊藿为小薜科植物箭叶淫羊藿Epimediumsegittatum(Sitb.etZucc.)Maxim.的i也上部分，4立丁名为HerbaEpimedii,产地陕西。怀牛膝为苋科多年生药用草本植物。别名对节草、山苋菜等，以干燥根入药，拉丁名为RadixAchyranthisBidentatae,产地河南。杜仲为杜仲科植物杜仲的树皮，拉丁名为CortexEucommiae原植物杜仲CortexEucommiaulmoidesOliv,产地湖北。鹿角別名斑龙角(《本草纲目》)，为鹿科动物;f每花鹿或马鹿已骨化的老角。处方名鹿角片，拉丁名为CorunCervi，产地吉林。本发明的另一个目的通过以下技术方案实现一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，包括以下步骤(1)称取各原药材骨碎补25~40%、淫羊藿20~35%、怀牛膝10~25%、杜仲10~25%和鹿角片5~15%备用；(2)将所述重量配比的怀牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5~3小时，过滤得滤液I和药渣，备用；(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中得到的药渣加水煎煮两次，第一次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的9~11倍量，第二次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的7~9倍量，每次煎煮0.5~3小时，过滤得滤液II,备用；(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。还可以根据需要添加以下步骤(5)所述滤液浓缩后，在809(TC下干燥，制成粉末状的中药组合物。(6)将所述活性组分与常用辅料混合，制成固体制剂。以上中药组合物还可以根据需要利用制药常规方法制成临床上适用的剂型，如液体制剂等。本发明原药材选用骨碎补和淫羊藿组合，其中骨碎补补肾活血，主治肾虛腰痛，《本草从新》云其疗"骨痿"效佳，为君药；淫羊藿补肾阳、坚筋骨，《本草备要》载其能"补命门，益精气，坚筋骨"，为臣药；怀牛膝"走而能补"，《别录》认为"牛膝益精、填骨髓，除腰脊痛。"既活血化瘀，又能补肝肾、强筋骨，善治腰膝酸痛、下肢无力等症。杜仲补肝肾、强筋骨，《本经》记载杜仲"主腰脊痛，补中，益精气，坚筋骨"。鹿角片入肝、肾经，温补肝肾、强筋骨、兼有活血之效，《本草纲目》记载鹿角"生用则散热行血，消肿辟邪；熟用则益肾补虚，强精活血"。现代药理研究表明应用"Ca同位素示踪法证明，骨碎补有促进骨对钙的吸收作用，提高血4丐与血磷水平，有利于骨钙化和骨盐形成，骨碎补提取物对小鸡骨发育生长有显著促进作用，对组织培养中的鸡胚骨原基的Ca、P沉积有明显促进作用。淫羊藿不但具有补阳药的激素样作用，而且可促进成骨细胞的生长，抑制破骨细胞的功能。怀牛膝与淫羊藿配伍，有提高维曱酸致骨质疏爭>才莫型动物骨密度作用。杜仲有促进成骨细胞增殖、调节成骨细胞代谢的作用(参考文献[i])。值得一提的是，实-险研究表明，鹿角可明显增加正常小鼠血清钾含量浓度(参考文献[ii])。将鹿角片与怀牛膝、杜仲共为佐药，可以具有显著的补益肝肾、兼有活血之效。因此本发明提供的中药组方副作用小，对原发性骨质疏松症具有更好的预防和治疗效果。具体实施方式实施例一按本发明技术方案所制得的中药组合物对去卵巢大鼠骨质疏松模型促骨形成的作用本实验拟通过建立大鼠绝经后骨质疏松症模型，借助现代病理组织学检查、双能X线骨密度测定仪、生物化学、分子生物学等方法与手段，系统观察中药组合物对绝经后骨质疏松症的作用途径及作用机理，初步探索该药防治绝经后骨质疏松症的机理(如促进骨形成等I为临床防治绝经后骨质疏松症提供科学、合理的实验依据。1.主要实验材料1.1实验动物清洁级SD大鼠，雌性，3月龄，150~200g,购于上海斯莱克实-睑动物有限责任公司，合格证号SCXK(沪)200卜0005;实验环境合才各证号SYXK(苏)2007-0026。1.2主要试剂苯甲酸雌二醇天津金耀氨基酸有限公司提供，批号0609131;血清雌二醇放射免疫分析药盒北京市福瑞生物工程公司提供，批号070920;血清骨4丐素放免药盒北京市福瑞生物工程公司提供，批号070915;》威性磷酸酶纟企测试剂盒南京建成生物工程研究所提供，批号071007;血清钩试剂盒南京建成生物工程研究所提供，批号071008;大鼠胰岛素样生长因子(IGF-I)定量酶联检测试剂盒上海森雄科技实业有限公司提供，批号0804121;其他试剂均为市售分析纯产品。1.3主要仪器DPX-NT型双能x射线骨密度仪(LUNAR,美国)；METTLERPB303-N电子天平，上海产；SN-695B型智能放免y测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂；752s型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；三洋MDF-382E超低温冰箱，日本产；隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；Axioskope2生物荧光显微图像分析系统，德国ZEISS产；XHF-1高速分散器，上海金达生化仪器厂；台式高速离心机，上海医用分析仪器厂；HH-60型快速恒温数显水箱，常州国华电器有限公司。2.实验方法2.1中药组合物的制备原料药选取如下骨碎补片产地四川，购自江苏省盱眙县中药饮片厂，批号060801;淫羊藿产地陕西，购自南京康怡中药饮片有限公司，批号070310;怀牛膝产地河南，购自南京药业股份有限公司中药饮片厂，批号070106;盐炒杜仲产地湖北，购自南京康怡中药々欠片有限^^司，批号070310;鹿角片产地吉林，购自江苏省盱眙县中药饮片厂，批号061002。按最佳的原药材配比值的制备步骤如下(1)按每份中骨碎补31%、淫羊藿21%、怀牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%的比例称取各原药材，备用；(2)将所述重量配比的怀牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次1.5小时，过滤得滤液I和药渣，备用；(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为IO倍量，第二次加水量为8倍量，每次煎煮1.5小时，过滤得滤液II,备用；(4)合并滤液I和滤液II,浓缩制成药液。2.2绝经期大鼠模型的建立参照文献方法[谢雁鸣，赵晋宁，丁会，等.强骨胶嚢抗去势大鼠骨质疏松症的实验研究[J].中国医药科技，2000，7(3):151-152.1],取体重150~200g的清洁级雌性SD大鼠50只，禁食12h(不禁水)，于腹部剪毛，形成约3x5cm的去毛区，以碘酒消毒后，用10%的水合氯醛按0.3ml/100g的剂量腹腔注射麻醉。其后沿腹中线向下做纵4亍切口，长约23cm，切开皮肤后，即可见位于两侧肾脏外下方呈粉红色的卵巢及紧密相连的子宫角，结扎并切断子9宫角，将卵巢摘除。缝合腰肌及皮肤。另取10只SD大鼠，仅从两侧卵巢旁边切除少许脂肪组织，不作卵巢摘除，作为伪手术组。术后连续肌注青霉素(40万单位/只)3d以预防感染，正常饲养3个月后，造成大鼠骨质疏松模型。2.3分组及给药方法将上述模型大鼠随机分为5组，即模型组(Model),阳性药组(EB),中药组合物高、中、低剂量组(H-JGP,M-JGP，L-JGP),每组10只。另设伪手术组(Control)10只。阳性药组采用苯曱酸雌二醇(EB)注射液，月几注给药，3日l次，每次0.276mg/kg;高、中、低剂量组均灌胃给药，剂量分别为17.6、8.8、4.4g生药/kg.d-l。模型组及伪手术组灌胃给予等量消毒饮用水，连续给药3个月。3.指标;险测3.1骨密度测定给药结束后，每组取8只大鼠，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，用双能x射线骨密度仪测量大鼠股骨和腰推的骨密度(bonemineraldensity,BMD)。3.2生化指标测定3.2.1样品采集方法上述大鼠，最后一次灌胃给药后1小时，以10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉采血，室温下静置lh后离心，3000r/m,离心10分钟，取血清，-2(TC下保存。3,2.2血清骨钙素(s-BGP)的测定本试剂盒利用放射免疫分析法进行测t用浓度分别为1、2、4、8、16ng/mL的BGP标准品作出标准曲线。取100pL样品血清，依次加入100jaL抗血清，100juL1251-BGP,摇匀，4。C下放置24h,力口10入500juL的分离剂，混勻，室温;故置15-20min,4。C3500rpm离心20min,吸弃上清液，y计数器上测定沉淀的放射性计数(cpm),由标准曲线计算样品浓度。3.2.3血清雌二醇(s-E2)的测定本试剂盒利用放射免疫分析法进行测定。在均相竟争抑制反应中采用平纟軒法，对血清样品进行直接测定。测定中，标准品、样品等中的E2与1251-E2竟争限量抗体的结合位。当^^皮测物中的E2的浓度高时，剩余的抗体结合位就少，从而与抗体结合的1251-E2就少，反之结合就多。利用免疫分离剂分离出抗原-抗体复合物，并测定复合物中的放射性技术。1251-E2的结合量与样品中E2的浓度呈函数关系，通过数据处理可求出样品中E2的含量。用浓度分别为0、5、20、50、100、250、500pg/mL的E2标准品作出标准曲线。取100luL样品血清，依次加入100|uL125I-E2,IOOiuL抗体，混匀，37。C下温育加入500jaL的分离剂，混匀，室温放置15min3500rpm离心15min,吸弃上清'氣y计数器上测定沉淀的放射性计数(cpm)，由标准曲线计算样品浓度。3.2.4血清总^喊性磷酸酶(s-ALP)的测定对硝基苯磷酸二钠法检测血清总碱性磷酸酶的含量。碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷S吏，酚在^咸性溶液中与4-氨基安替吡啉作用经铁氰化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。标准管加入50iaL的0.lmg/mL酚标准液，样品管加入50jaL样品血清，空白管加入50jaL去离子水，各管依次加入500juL緩冲液500juL基质液充分混匀，37。C水浴中放置15min加入l.5mL的显色剂，立刻混匀，采用紫外分光光度计测量，检测波长520nm，lcm光径比色，空白管调零，测定各管的吸光度值，并根据公式a计算酶含量(100mL血清在37。C与基质作用15min产生lmg酚为l个金氏单位)。测定管标准管含酚lOOmL吸光度的量_ALP^f直标准管0.005mg0.05mL(金氏单位/100mL)吸光度公式a3.2.5血清4丐(s-Ca)的测定血清中钙离子在碱性溶液中与曱基百里香酚蓝(MTB)结合，生成蓝色络合物。通过比色与同样出里的钙标准进行标准，可计算出钙的含量。标准管加入50]iL的2.5mol/L钙标准液，样品管加入50jaL样品血清，空白管加入50iaL去离子水，各管依次加入lmLMTB试剂，2mL碱性溶液，充分混匀，静置15min，采用紫外分光光度计测量，蒸馏水调零，检测波长610nm，lcm光径比色，测各管的吸光度值，根据计算公式b得出结果。血清钓测定管吸光度-空白标准品浓度(nmol/L)管吸光度标准管吸光度-空白2.5mmol/L管吸光度公式b3.2.6血清胰岛素样生长因子-I(s-IGF-I)的测定采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清中胰岛素样生长因子-1的含量。按照试剂盒操作说明书的方法，用抗大鼠IGF-I单抗包被于酶标板上，标准品中的大鼠IGF-I与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IGF-I抗体，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的12Streptavidin与生物素结合，力口入酶底物OPD，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在酶标仪492nm处测0D值，大鼠IGF-I浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中大鼠IGF-1浓度。3.2.7骨组织形态计量学的观察取尾推以上5、6节处腰推骨，放入10。/。曱醛溶液中固定24h以上，EDTA脱4丐，H-E染色，切片。在显微镜下观察骨组织形态结构的变化并测量骨小梁面机采用Image-ProPhis6.0(MediaCybernetics公司)图象分析软件计算平均骨小梁面积百分比(TS%)、平均骨小梁宽度(WAT)和单位面积(36180(^m)骨小窝数量。4.结果4.1对骨密度的影响骨密度测定结果表明与正常对照组比较，模型组腰推骨和股骨密度明显降低，表明骨质疏松模型形成。与模型组比较，苯曱酸雌二醇组腰推骨和股骨密度有显著升高(P<0.01),中药组合物高、中、低剂量组的骨密度也均有显著性升高(P〈0.05~0.01)。见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表l中药组合物对去势大鼠骨密度的影响(无±&/=8)注与才莫型组比举交，*:代O.05，**:代O.01。4.2对血清学指标的影响与正常组比较模型组的血清E2显著降低血清ALP(金氏单位/ml)显著性升高(P〈0.05~0.01)。与模型组比较，苯曱酸雌二醇组的血清E2显著升高(P<0.01),苯甲酸雌二醇组血清ALP有显著性降低(P<0.01);中药组合物各剂量组的血清E2水平比模型组明显升高(P<0.05~0.01),接近正常动物水平；而血清ALP有显著性降低。见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表2中药组合物对去势大鼠血清E2、ALP含量的影响(元±&/2=10)注与才莫型纟且比4交，*:代O.05，**:代O.01。与伪手术组比较，模型组的血清BGP显著性升高(P<0.05~0.01)，血清Ca2+有升高趋势，血清中IGF-I含量显著降低(P<0.01)。与模型组比较，苯曱酸雌二醇组的血清Ca2+有所降低，但无统计学显著性差异(P〉0.05);血清BGP有显著性降低(P〈0.01)，IGF-I含量则显著升高(P<0.05);而中药组合物中、低剂量组的血清Ca2十、BGP有显著性降低,IGF-I含量也显著升高(P〈0.05)。见表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3中药组合物对去势大鼠血清Ca、BGP和IGF-I含量的影响(元±&/7=10)注与才莫型组比4交，*:代O.05,**:代O.01。4.3骨组织形态计量学观察骨形态计量学指标表明，与伪手术组相比，模型组大鼠股骨骨小梁面积百分比(TS。/。)，骨小梁平均宽度(WAT)和骨小窝数量明显降低(P<0.01);中药组合物各剂量组骨小梁面积百分比和骨小梁平均宽度较模型组大鼠均有明显提高(P<0.05~0.01)。中药组合物各剂量组的骨小窝数与模型组比较，没有统计学差异，见表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表4中药组合物对去势大鼠骨形态学计量指标的影响(5±s，/2=10)注与才莫型组比4交，*:代O.05,**:户<0.01。5.结论中药组合物对骨质疏松模型大鼠有明显的治疗作用，而调节雌激素平衡、抑制骨钙流失或增加骨对钙的吸收、抑制ALP的活性和BGP水平，增加血清中IGF-I的含量，是其主要的作用机理，反映了中医复方多靶点、综合调理作用的优势和特色。以下为中药组合物含药血清对成骨细胞的作用研究本研究从体外培养成骨细胞观察中药组合物含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化能力的影响，并初步探讨了对成骨细胞细胞凋亡的保护作用。为中药组合物防治骨质疏松的机制研究提供实验依据。1.主要实验材料1.1实验动物出生3日内的清洁级SD大鼠乳鼠12只，购自江苏省中医药研究院动物中心。1.2药物与试剂噻唑蓝(MTT)，Sigma产品；DMEM培养基，Gibco产品；新生牛血清，Gibco产品；胰蛋白酶，Amresco，南京博全科技有限公司分装；II型胶原酶，Gibico分装，Lot200905;碱性磷酸酶检测试剂盒南京建成生物工程研究所提供，批号071007;Tris(三羟曱基氨基曱烷)，购自南京博全科技有限公司，Lot013BE504;TritonX-100,Amresco分装，Lot010T0405;(3-甘油磷酸钠，购自南京博全科技有限公司，批号200908;茜素红，购自广东光华化学厂有限公司，批号20050808;抗坏血酸，购自上海试四赫维化工有限公司，批号0611101;苯曱酸雌二醇，天津金耀氨基酸有限公司提供，批号0609131;Vybrant凋亡分析试剂盒，购自联科生物技术有限公司，Lot52398A;肿瘤坏死因子-oc，购自联科生物技术有限公司，Lot0704731.3主要仪器SW-CJ-2FD医用型净化工作台，苏净集团安泰公司生产；HJ-3数显恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司生产；BB6220三气培养箱，德国Heraeus公司生产；Axiovert200倒置显微镜，德国ZEISS公司生产;TecanSunrise酶标仪，奥地利生产；FACSCantoTMFlowCytometer(流式细胞仪)，美国BD公司生产；400R型高速冷冻离心机，Heraeus公司生产；固-1微量振荡仪，江苏泰州医疗器械厂生产；2.含药血清的制备取SD大鼠15只，随机分成5组，即空白血清组sControl(给予同体积消毒饮用水)i苯曱酸雌二醇血清组sEB和中药组合物高剂量血清组H-sJGP(32g生药/kg)、中药组合物中剂量血清组M-sJGP(16g生药/kg)、中药组合物低剂量血清组L-sJGP(8g生药/kg)，每组3只。每日两次间隔12小时，连续给药3天。末次给药后于O.5h、lh、2h眼眶后静脉丛取血，3000rpm离心10min，分离血清，将同组的血清混合，经56。C灭活30min，0.22jam滤膜过滤灭菌，-20。C保存备用[雷晓明，田松.壮骨止痛胶嚢含药血清对大鼠成骨样细胞增殖分化影响的实验研究.天津中医药，2004,21(3):237-239i]。3.观察指标3.1细胞增殖率的测定(MTT比色法)取第3代的成骨细胞，以2x105个/ml接种于96孔培养板，24h后更换不含血清的DMEM培养基每孔分别加入不同浓度的含药血清IOUl，分别继续培养48h后，每孔加入5mg/mL的MTT10jiL,于37。C、含5%C02、饱和湿度的培养箱内孵育4h后，弃去孵育液，每孔加入IOOjLiLDMSO终止反应，室温(22。C)15min，振荡混匀。待沉淀完全溶解后，在微孔振荡器震荡15min,待沉淀完全溶解后，在波长490mn处，于酶标仪上测定光密度OD值。3.2碱性磷酸酶活力的测定取第3代的成骨细胞，以4x105个/mL接种于96孔培养板，2卩h后更换不含血清的DMEM培养基，每孔分别加入不同浓度的含药血清IO继续培养48h后，去除培养液，PBS洗三次，加入O.1。/。的TritonX-100裂解液200iaL,裂解12h,轻轻吹打细胞lmin,取50nL细胞裂解液转移至另一96孔板，用PBS做空白调零。各孔加入^咸性磷酸酶试剂盒中新鲜配置的底物100iaL在三气培养箱孵育。酶标仪检测，波长18为405咖。根据公式c计算ALP值定管吸光度标准管含酚的量ALP值(金氏单位/100mL)准管吸光度公式C3.3矿化结节计数将培养第3代的成骨细胞以1x105个/mL的密度接种于6孔板上次日换液，并分别加入10。/。的不同浓度的含药血清，每2日换液1次，并加药和矿化诱导剂，每孔加入矿化诱导剂，培养20日后，形成矿化结节，倒去培养基，用PBS洗2次，然后用95。/。乙醇固定10min,0.1%茜素红染色，37。C下放置30min,水冲洗。以橘红色结节边界清晰，直径>200jam为矿化结节的计数标准。在低倍镜下对各孔作矿化结节计数(矿化结节数/视野)。3.4成骨细胞凋亡实验将培养第3代的成骨细胞以1x105个/mL的密度接种于6孔板上。次日后换液，并加入不同浓度的药液。培养3日后，加入细胞凋亡诱导剂TNF-ct，剂量为20ng/mL,诱导24h。弃去培养液，用PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化，轻轻吹打，将细胞悬液移至离心管离心。把得到的细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色緩冲液(bindingbuffer)中以lx106细胞/mL的浓度重悬、吸取100yL的细胞(1x105)至试管中。加入适量的荧光标记的annexinV试剂和PI。混勻后避光室温下孵育15分钟。孵育后加入400)nL染色緩冲液，立即上流式细胞仪分析(实验必须在一小时内完成)。4.实—险结果4.l中药组合物含药血清对成骨细胞增殖的影响与对照组比较，不同采血时间的中药组合物含药血清对成骨细胞的增殖均没有明显的作用，说明中药组合物含药血清不能够促进成骨细胞的增殖作用。结果见表5。组别0.5hlh2h空白血清组0.237±0.0190.237±0.0190.237±0.019雌二醇血清组0.228±0.0170.213±0.0210.209±0.014中药组合物高剂量组0.253±0.0290.249±0.0230.241±0.038中药组合物中剂量组0.262±0.0240.253±0.0250.237±0.013中药组合物低剂量组0.231±0.0100.247±0.0250.219±0.021表5不同采血时间的中药组合物含药血清对成骨细胞增殖的影响注与只于照纟且比4交，*:尸<0.05，**:尸<0.01。与对照组比较，不同给药浓度的中药组合物含药血清对成骨细胞的增殖均没有促进作用。给药浓度为5%时，因血清浓度较低，得到的OD值偏低。给药浓度为10%时，对成骨细胞的增殖也没有明显的作用。给药浓度为15%时，中低剂量组对成骨细胞不仅没有增殖作用，反而有明显的抑制作用(P〈0.05)。给药浓度为20%时，各剂量组对成骨细胞都没有增殖作用，而都有明显的抑制作用(P〈0.05)。结果表明，给药浓度为15%以上时，对成骨细胞有抑制作用，给药浓度以10%为宜。结果见表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表6中药组合物含药血清不同给药浓度对成骨细胞增殖的影(5±s，/=6)注与对照组比4交，*:代O.05，**:代O.01。4.2中药组合物含药血清对成骨细胞ALP活力的影响中药组合物含药血清各剂量组对成骨细胞ALP活力均有增强的作用，在各时间点，随着剂量的增加，碱性磷酸酶的含量逐渐升高；中药组合物中、低刑量组明显高于空白对照组及高剂量组(P〈0.05~0.01)。在中药组合物高、中、低剂量组中，给药后lh血清组达到药效顶点，比各剂量给药后O.5h、2h得到的含药血清，对促进ALP活力的作用更强。表明给药后lh采血比较适宜。根据实验结果，低剂量给药lh后得到的含药血清对成骨细胞ALP活力的增强作用最强(P復01)。结果见表7。组别0.5hlh2h空白血清组6.062±0.5946.062±0.5946.062±0.594雌二醇血清组6.277±0.8546.373±0.6126.134±0.946中药组合物高剂量组6.642±0.5967.014±0.9656.849±0.722中药组合物中剂量组7.174±0.974*7.344±0.843*7.179±0.996*中药组合物低剂量组7.119±0.627*7.671±0.516**7.071±0.775*表7中药组合物含药血清对成骨细胞ALP活力的影响(天±&/=6)注与只于照纟且比4交，*:代O.05,**:代O.01。4.3中药组合物含药血清对成骨细胞形成矿化结节的影响中药组合物含药血清各剂量组对成骨细胞形成矿化结节均有促进作用，但中低剂量组的促进作用与对照组比较有显著的差异(P<0.05)，说明中药组合物含药血清具有促进成骨细胞矿化结节形成的作用。结果见表8。组别结节数空白血清组2.000±0.577雌二醇血清组1.857±0.690中药组合物高剂量组2.571±0.53522<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表8中药组合物含药血清对成骨细胞形成矿化结节的影响(5±s，")注与对照纟且比4交，*:P<0.05，**:户O.Ol。4.4细胞凋亡实验在流式细胞仪上机测定的结果表明，阳性药组能稍微降低TNF-oc诱导的成骨细胞凋亡的凋亡率，但没有统计学差异。中药组合物中、低剂量对成骨细胞的凋亡率均有降低，以低剂量降低的作用比较明显(P復05)。结果见表9。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表9中药组合物含药血清对TNF-a诱导的成骨细胞凋亡的影响(元±s，/2=4)注与对照组比4交，*:PO.05,**:户O.Ol。5.上述实施例三结果表明通过对成骨细胞矿化及成骨细胞增殖分化的研究，发现中药组合物含药血清加入成骨细胞培养体系后，不能促进成骨细胞增值，但可以刺激成骨细胞4丐化和石威性磷酸酶活性，具有^f足进成骨细胞矿化和分化功能的作用。中药组合物含药血清还可部分保护TNF-cc诱导的成骨细胞凋亡，是中药组合物防治骨质疏松的机制之一。说明中药组合物含药血清促进骨形成的作用。实施例二原药材的选取与实施例一相同，按优选的原药材配比值的制备步骤如下(1)按每份中骨碎补29%、淫羊藿25%、怀牛膝19%、杜仲20°/。和鹿角片7%的比例称取各原药材，备用；(2)将所述重量配比的怀牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次l小时，过滤得滤液I和药渣，备用；(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为9倍量，第二次加水量为7倍量，每次煎煮l小时，过滤得滤液II,备用；(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。(5)将步骤(4)中含生药的药液在809(TC下干燥，制成粉末状的中药组合物。动物实验与实施例一类似，此处不再赘述。实施例三原药材的选取与实施例一相同，按可选的原药材配比值的制备步骤如下(1)按每份中骨碎补37°/。、淫羊蓑30%、怀牛膝13%、杜仲12%和鹿角片8°/。的比例称取各原药材，备用；(2)将所述重量配比的怀牛膝加70%的乙醇回流提取2次，每次2.5小时，过滤得滤液I和药渣，备用；(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)24中药渣加水煎煮两次，第一次加水量为11倍量，第二次加水量为9倍量，每次煎煮2.4小时，过滤得滤液II,备用；(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。(5)根据需要将步骤(4)中的中药组合物与固体制剂中常规辅料混合，制成固体制剂，如片剂、胶嚢剂等。动物实验与实施例一类似，此处不再赘述。参考文献'饶华，胡金家，高书亮。成骨样细胞体外培养法筛选杜仲叶防治骨质疏松症的药效成份，解剖学研究，2004,26(2):115-117."^向上，赵文静，旺建伟。鹿角的药理作用及临床应用研究进展，中医药信息，2008,25(2):23-25.除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。权利要求1.一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于主要由下列重量比的原药材制成骨碎补25～40％、淫羊藿20～35％、怀牛膝10～25％、杜仲10～25％和鹿角片5～15％。2.根据权利要求1所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于各原药材采用优选用量骨碎补25~35%、淫羊藿20~30%、怀牛膝15~25%、杜仲15~25%和鹿角片5~10°/。。3.根据权利要求1所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物，其特征在于各原药材采用最佳用量骨碎补31%、淫羊藿21%、怀牛膝21%、杜仲21%和鹿角片6%。4.一种预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，包括以下步骤(l)称取各原药材骨碎补25~40°/。、淫羊藿20~35%、怀牛膝10~25%、杜仲10~25%和鹿角片5~15%备用；(2)将所述重量配比的怀牛膝加乙醇回流提取2次，每次0.5~3小时，过滤得滤液I和药渣，备用；(3)将所述重量配比的骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片与步骤(2)中得到的药渣加水煎煮两次，第一次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的9~11倍量，第二次加水量为所述骨碎补、淫羊藿、杜仲、鹿角片以及步骤(2)中得到的药渣总重量的7~9倍量，每次煎煮0.5~3小时，过滤得滤液II,备用；(4)合并滤液I和滤液II，浓缩制成药液。5.根据权利要求4所述的一种预防和治疗骨质疏松的中药的制备方法，其特征在于还包括以下步骤(5)所述滤液浓缩后，在809(TC下干燥，制成粉末状的中药组合物。6.根据权利要求5所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，其特征在于还包括以下步骤(6)将所述活性组分与常用辅料混合，制成固体制剂。7.根据权利要求6所述的预防和治疗骨质疏松的中药的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中乙醇回流提取的时间是1.5小时；所述步骤(3)中第一次加水量为10倍量，第二次加水量为8倍量，每次煎煮1.5小时。8.根据权利要求7所述预防和治疗骨质疏松的中药组合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的乙醇浓度为70%。全文摘要本发明涉及一种药物，是一种预防和治疗骨质疏松症的中药组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法，属于医药
技术领域：
。本发明主要由骨碎补(25～40)％、淫羊藿(20～35)％、怀牛膝(10～25)％、杜仲(10～25)％和鹿角片(5～15)％制成。其制备工艺为按配方称取各原药材骨碎补、淫羊藿、怀牛膝、杜仲和鹿角片，怀牛膝醇提、过滤得滤液I和药渣，将药渣与骨碎补、淫羊藿、杜仲和鹿角片用水煎煮，过滤得滤液II，合并滤液，浓缩制成含有活性组分的药液。本发明提供的中药组方副作用小，对原发性骨质疏松症具有较好的预防和治疗效果。文档编号A61K36/185GK101455704SQ20081024324公开日2009年6月17日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者林谢申请人:林谢