使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物的制作方法

专利名称：：使用免疫球蛋白片段的促胰岛素缀合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于促胰岛素肽的长效配方的促胰岛素肽缀合物。具体地，本发明涉及一种显著提高体内功效持续时间的改良的促胰岛素肽的缀合物，该肽缀合物是通过将促胰岛素肽和非肽聚合物以及免疫球蛋白Fc共价连接产生的，以及本发明还涉及该肽缀合物的制备方法。
背景技术：
：肽由于它们的低稳定性而容易变性，由体内的蛋白水解酶降解，从而失去活性，并且肽具有相对较小，从而容易通过肾。因此，为了保持血液浓度和包括作为药物有效成分的肽的药物浓度，必须给病人频繁地服用肽类药物来保持所需要的血液浓度和药物浓度。然而，该肽类药物通常以注射剂的形式给药，而这样频繁的给药使得病人很痛苦。为解决这些问题，已经进行了许多努力。作为其中的一种努力，已经尝试通过生物膜增加肽类药物的传送以通过口咽或鼻咽吸入来运送肽类药物。然而，与注射相比，由于体内的传送效率低，这种方法仍然很难保持该肽类药物的体内活性。另一方面，已经进行了很多努力来改善肽类药物的血液稳定性，并将药物在血液中以高浓度保持长时间，从而使该药物的药效最大化。因此，这种肽类药物的长效制剂需要增加肽类药物的稳定性，并保持不会引起病人免疫反应的足够高浓度的药物浓度。作为稳定肽并抑制它通过蛋白水解酶降解的方法，已经进行了一些实验来修饰对该蛋白水解酶敏感的特定氨基酸序列。例如，由于GLP-1(7-37或7-36酰胺)通过二肽基肽酶IV(DPPIV)在第8氨基酸(Ala)和第9氨基酸(Asp)之间进行剪切而损失了GLP-1的药物浓度，因此具有减少血液中葡萄糖浓度以治疗2型糖尿病作用的GLP-1(7-37或7-36酰胺)具有4分钟或更短的生理活性的半衰期(Kreymann等，1987)。因此，已经进行了各种关于具有抗DPPIV的GLP-1类似物的研究，并且已经进行了用Gly取代Ala(Deacon等，1998;Burcelin等,1999)或用Leu或D-Ala取代Ala((Xiao等，2001))的实验，从而在保持它的活性的同时增加了对DPPIV的抗性。GLP-1的N末端氨基酸，His'对GLP-l的活性是重要的，并且作为DPPIV的目标。因此，美国专利第5，545，618号描述了用烷基或酰基修饰N末端，并且Gallwitz等描述了第7位His进行N曱基化或a甲基化，或者整个His用咪唑fl代来增加对DPPIV的抗性并保持7生理活性。除了这些修饰，从希拉毒蜥蜴的唾液腺纯化的GLP-1类似物exendin-4(美国专利第5,424，686号)具有对DPPIV的抗性并比GLP-I具有更高的生理活性。因此，它具有比GLP-1的半衰期更长的2至4小时的体内半衰期。然而，仅使用增加DPPIV抗性的方法，生理活性不能被充分地保持，并且在使用商业可获得的exendin-4(exenatide)的情况下，它需要一天两次被注射给病人，这对病人仍然是纟艮痛苦的。这些促胰岛素肽具有一个问题，通常肽的大小很小。从而，它们不能在肾中被重新获得，并且它们随后被排出体外。因此，已经使用以化学方法在肽的表面添加例如聚乙二醇(PEG)的具有高溶解度的聚合物来抑制在肾中的损失的方法。PEG非特异性地结合到特异位点或目标肽的多个位点产生了增加肽的分子量的效果，并从而抑制通过肾的损失，并防止水解，而不产生任何的副作用。例如，国际专利公开第W02006/076471号申请描述了PEG结合到B型利钠肽或BNP，BNP结合到NPR-A激活cGMP的产生，cGMP使得动脉血压降低，并因此作为充血性心力衰竭的治疗剂，从而保持生理活性。美国专利第6,924，64号描述了PEG结合到exendin-4的赖氨酸残基来增加它的体内停留时间。然而，这种方法增加了PEG的分子量，从而增加了肽类药物的体内停留时间，同时随着分子量的增加，该肽类药物的浓度显著地减少了，并且肽的反应性也降低了。因此，产量被不希望的降低了。国际专利公开第WO02/46227号申请描述了使用基因重组技术通过将GLP-1，exendin-4或其类似物与人血清白蛋白或免疫球蛋白区(Fc)结合来制备融合蛋白。美国专利第6,756,480号描述了通过将曱状旁腺激素(PTH)和其类似物与Fc区结合来制备Fc融合蛋白。这些方法可以解决如聚乙二醇化产量低和非特异性的问题，但是它们仍然具有这样一个问题，即增加血液中半衰期的效果不像期待中的那么显著，并且有时浓度也很低。为了使增加血液中半衰期的效果最大化，使用了各种类型的肽连结器，但是可能引起免疫反应。此外，如果肽具有二硫键，例如使用BNP,那么错折叠的概率很高。因此，这类肽几乎不可能被使用。此外，GLP-1衍生物即NN2211是通过取代GLP-1的氨基酸并被结合到酰基侧链以形成与白蛋白的非共伯、鍵来制备的，从而增加了它的体内停留时间。然而，它具有11至15小时的半衰期，与exendin-4相比，它没有显示出半衰期的显著增加。从而，GLP-1衍生物仍然需要一天一次地被注射(Nauck等，2004)。此外，CJC-1131是GLP-1衍生物，它具有将GLP-1和血液中的白蛋白共价结合的马来酰亚胺反应基团，并且为了达到增加体内半衰期的目的，已经努力进行实验来开发CJC-1131,但是这些努力现在已经停了下来。其后被提议的物质CJC-1134是共价结合到重組白蛋白的exendin-4,并且没有显示增加血液稳定性的显著效果，它具有17小时的血液半衰期(鼠)(Thibauoleau等，2006)。
发明内容技术问题因此，本发明人将免疫球蛋白Fc和非肽聚合物与非N末端的氨基酸残基处通过共价键连接到促胰岛素肽的特异性位点，并发现本发明的缀合物具有显著的增加体内功效和半衰期的用途。特别地，他们发现，在促胰岛素肽的缀合物中，肽的缀合物例如exendin—4，exendin—4的N末端氛基《皮敲除的去一氛基一组氛醜一exendin—4，exeiidiri—4的N末端氨基被羟基取代的P-羟基-咪唑-丙酰基-exendin-4，exendin-4的N末端氨基用两个曱基基团修饰的二曱基-组氨酰-exendin-4和第一个组氨酸的cc碳和N末端氨基均被敲除的咪唑-乙酰基-exendin-4都产生显著的增加的体内功效和半衰期的作用。技术方案本发明的一个目的是提供一种促胰岛素肽的长效制剂，它具有保持该促胰岛素肽的体内活性并增加血液半衰期的作用。附图简述图1显示了测定天然exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图2显示了测定天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图3显示了测定去-氨基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图4显示了测定(2-羟基-3-(1H-咪唑-4-基)丙酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图5显示了测定(2-(lH-咪唑-4-基)乙酰基)-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图6显示了测定Serl2突变的去-氨基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图7显示了测定Argl2突变的去-氨基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图8显示了测定去-氨基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-人血清白蛋白(HSA)缀合物纯度的反相HPLC的结果；图9显示了测定二甲基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图10显示了测定GLP-1(N)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图11显示了测定去-氨基-组氨酰-GLP-1(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图12显示了测定天然exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的反相HPLC的结果；图13显示了通过12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定(2-(lH-咪唑-4-基)乙酰基)-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物纯度的结果;图14显示了去-氨基-组氨酰-exendin-4(Lys)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物降低血液中葡萄糖浓度的作用的测定结果。优选实施方式在本发明的一个实施方案中，提供了一种长效的促胰岛素肽的缀合物，其中在其两端具有反应基团的促胰岛素肽和非肽聚合物共价地相互连接。本发明的促胰岛素肽是用于促进胰岛素在胰脏|3细胞中合成和表达的具有促胰岛素功能的肽。这些肽包括前体，激动剂，衍生物，片段和突变体，并优选GLP(胰升血糖素样肽)-l，exendin3和exendin4。GLP-1是由小肠分泌的激素，通常促进胰岛素的生物合成和分泌，抑制胰升血糖素的分泌并促进细胞中葡萄糖的吸收。在小肠中，胰升血糖素前体被分解为三种肽，它们是胰升血糖素、GLP-1和GLP-2。此处，GLP-1指GLP-1(1-37),它起初是以不具有促胰岛素功能的形式存在。但是，随后它被加工并被转化为有活性的GLP-1(7-37)的形式。GLP-1(7-37)氨基酸的序列如下GLP-1(7-37)HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEPIAWLVKGRG10GLP-1衍生物指显示与GLP-1有至少80%同源性的氨基酸序列的肽，它可以是被化学改性的并显示至少与GLP-1相等或更好的促胰岛素功能。GLP-1片段指在天然GLP-1的N末端或C末端添加或敲除了一个或多个氨基酸的形式，其中该添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。GLP-1突变体指具有促胰岛素功能的肽，其具有不同于天然GLP-1的一个或多个氨基酸序列。exendin3和exendin4是由39个氨基酸组成的促胰岛素肽，其具有与GLP-1的氨基酸序列的53%的同源性。exendin3和exendin4的氨基酸序列如下Exendin-3HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSExendin-4HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSexendin激动剂指与体内受体进行反应的化合物并具有与exendin相等的生理活性，其与exendin的结构无关。Exendin衍生物指与天然exendin相比具有至少80°/。的氨基酸序列同源性的肽，它可以在氨基酸残基上的一些基团上被化学取代(例如，a-曱基化，a-羟基化)，被敲除(例如，脱氨)或被修饰(例如N-曱基化)，并具有促胰岛素功能。exendin片段指在天然exendin的N末端或C末端添加或敲除了一个或多个氨基酸的片段，其中可以添加非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)，并具有促胰岛素功能。exendin变体指具有与天然exendin不同的至少一个氨基酸序列的肽，它具有促胰岛素功能。exendin激动剂，衍生物，片段和突体的每种制备方法可以单独或结合使用。例如，本发明包括的促胰岛素肽的氨基酸序列具有至少一个氨基酸与天然促胰岛素肽不同的氨基酸并在N末端的氨基酸残基处被脱氨。在一个特定实施方案中，本发明使用的天然促胰岛素肽和改性的促胰岛素肽可以使用固相合成方法被合成，并且包括天然促胰岛素肽的大多数天然肽可以通过重组技术产生。此外，在本发明中使用的促胰岛素肽可以结合到非肽聚合物的不同位点上。根据本发明制备的肽的缀合物可以根据被连接到促胰岛素肽的位点的改变具有不同的活性。例如，它可以分别与N末端和除了N末端的例如C末端的其它末端结合，其体外活性不同。乙醛反应基团在低pH选择性地结合到N末端，并且在例如pH9.0的高pH可以结合到赖氨酸残基来形成共价键。允许聚乙二醇化反应在不同pH中进行，并且随后位置异构体可以使用离子交换色语柱从反应混合物中分离出来。如果促胰岛素肽与非N末端的对于体内活性重要位点的位点结合，使用非肽聚合物上的马来酰亚胺连接器可以将活性琉基引入到该天然氨基酸序列中被修饰的氨基酸残基的位点以形成共《介键。如果促胰岛素肽与非N末端的对于体内活性重要位点的位点结合，使用在非肽聚合物上的乙醛连接器将活性氨基引入到该天然氨基酸序列中被修饰的氨基酸残基的位点以形成共价键。当使用非肽聚合物上的乙醛连接器时，它与N末端的氨基和赖氨酸残基反应，并且可以使用改性形式的促胰岛素肽来选择性地增加反应产量。例如，使用N末端阻断方法，赖氨酸残基取代方法，在C末端将氨基引入的方法等，可以仅将被反应的一个氨基保留在所需位点，从而增加聚乙二醇化和结合反应的产量。保护N末端的方法包括二曱基化，以及曱基化，脱氨作用，乙酰化作用等，但不限于这些烃基化方法。在一个优选实施方案中，本发明的促胰岛素肽缀合物是免疫球蛋白Fc区特异性地结合到促胰岛素肽的非N末端氨基的氨基上的促胰岛素肽的缀合物。在一个特定实施方案中，本发明人在pH9.0诱导了天然exendin-4的聚乙二醇化来选择性地将PEG结合到促胰岛素肽的赖氨酸残基上。可选地，为了在Lys残基进行聚乙二醇化，具有被敲除的或被保护的N末端的exendin-4衍生物的聚乙二醇化在pH7.5中进行。通过敲除N末端组氨酸的a氨基，或通过用羟基取代N末端氨基，或通过用两个曱基修饰N末端组氨酸的cc氨基，或通过敲除第一氨基酸(组氨酸)的ct碳并将其与N末端氨基连接起来以保留咪唑-乙酰基等来阻断N末端的聚乙二醇化。这些衍生物通过下面的化学式表示<化学式1>去-氨基-组氨酰(DA)-exendin-4桝M、临,H9—肽p-羟基-咪唑-丙酰基(HY)一exendin-4,疯人◎肽咪唑乙酰基(CA)一exendin—4，严l"IC，—肽二曱基-组氨酰(DM)-exendin-4与N末端结合不同的是,被保持在8.5%(表1)。此外当将PEG结合到赖氨酸残基而不是N末端时，体外活性即使通过敲除exendin-4的N末端氨基制备的去-氨基-纟且氛醜一exendin—4(以下称、为DA—exendin—4)，通过用轻基耳又4戈exendin—4的N末端氛基制备的P-羟基-咪唑-丙酰基-exendin-4(以下称为HY-exendin-4)，通过用两个曱基修饰exendin-4的N末端氨基制备的二甲基-组氨酰-exendin-4(以下称为DM-exendin-4)和通过敲除exendin-4的第一组氨酸的ct碳并将其与N末端氨基连接制备的。米唑乙酰基-exendin-4(以下称为CA-exendin-4)的Fc缀合物显示了与天然exendin-4缀合物可比的体外活性和血液半衰期(表1)，这些缀合物显示了出乎意料地高体内功效持续时间(图14)。根据本发明制备的DM-exendin-4-免疫球蛋白Fc缀合物，DA-exendin-4-免疫3求蛋白Fc缀合物，CA-exendin-4-免疫5求蛋白Fc缀合物和HYexendin-4-免疫球蛋白Fc缀合物显示了50小时或更长的增加的血液半衰期。通过结合到不影响肽活性的Lys残基上，最少地减少了浓度。此外，通过去除N末端的氨基或a碳观察到了出乎意料地葡萄糖降低的高活性。免疫球蛋白Fc区用作药物载体是安全的，因为它是在体内代谢的生物可降解多肽。此外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，并且因此13有利于缀合物的制备，纯化和生产。由于免疫球蛋白Fc区不包含其氨基酸序列根据抗体子类而不同并且因此是高度非同源性的Fab片段，因此可以预测免疫球蛋白Fc区可以极大地增加物质的同源性并减少抗原。本发明中使用的促胰岛素肽用载体物质和非肽聚合物连接。可以用于本发明的载体物质可以选自包括免疫球蛋白Fc区，白蛋白，转铁蛋白和PEG的组，并优选免疫球蛋白Fc区。在此使用的术语"免疫球蛋白Fc区"指免疫球蛋白的重链恒定区2(C2)和重链恒定区3(C3),而不是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，重链恒定区1(Cl)和轻链恒定区1(CJ)。它还可以包括重链恒定区的绞链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含Fc区的部分或全部，只要它具有与天然蛋白基本相似或更好的生理活性，除了重链和轻链的可变区外，Fc区包括重链恒定区1(Cl)和/或轻链恒定区1(CU)。此外，IgFc区可以是在C2和或C3的氨基酸序列的相对长的部分具有缺失的片段。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包括1)Cl结构域，C2结构域，C,,3结构域和C4结构域，2)Cul结构域和C2结构域，3)Cl结构域和C"3结构域，4)C2结构域和C3结构域，5)—个或多个结构域和免疫球蛋白绞链区(或绞链区的一部分)的结合，和6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。本发明的免疫球蛋白Fc区包括天然氨基酸序列和其序列衍生物(突变体)。由于一个或多个氨基酸残基的缺失，插入，非保守或保守取代或其结合，因此氨基酸序列衍生物是与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgGFc中，已知214至238,297至299，318至322,或327至331位置是结合中起重要作用的氨基酸残基，可以用作修饰的适合目标。其它各种衍生物也是可行的，包括可以形成二硫键的区被敲除，或者天然Fc形式的N末端的某些氨基酸残基被除去或者曱硫氨酸残基被添加在此。此外，为了去除效应子作用，缺失可以在补体结合位点进行，例如Clq-结合位点和ADCC(抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)位点。制备这些免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的方法在国际专利公开第WO97/34631和WO96/32478中公开。通常不改变分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换在现有技术中是已知的(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork,1979)。大多数通常发生的交换是双向的Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser，Ala/Gly,Ala/Thr，Ser/Asn,Ala/Val，Ser/Gly,Thy/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile,Leu/VaLAla/Glu,和Asp/Gly交换。如果需要，Fc区可以通过磷酸化，硫酸盐化，丙烯酸酯化，糖基化，甲基化，法尼基化，乙酰化，酰胺化等进行修饰。上述Fc衍生物是与本发明的Fc区具有相同生理活性或例如对于耐热，pH等具有改善的结构稳定性的衍生物。此外，这些Fc区可以是从人或其它动物中分离得到的天然形式，动物包括牛，羊，猪，小白鼠，兔，仓鼠，鼠和豚鼠，Fc区可以是从转换的动物细胞或微生物中获得的重组体或其衍生物。在此，它们可以由天然免疫球蛋白通过从人或动物有机体分离全部免疫球蛋白并用蛋白水解酶处理它们获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化为Fab和Fc区，并且胃蛋白酶的处理使得产生pF'c和F(ab)2片段。例如，这些片段可以进行分子筛色谱来分离Fc或pF'c。优选地，人源Fc区是从微生物获得的重组体免疫球蛋白Fc区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链的形式，与天然形式相比增加的糖链或与天然形式相比降低的糖链，或可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加，降低或去除可以通过现有技术中已知的方法实现，例如化学方法，酶法和使用微生物的基因工程方法。从Fc区去除糖链导致第一补体成分C1的Clq部分的亲和力明显降低和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或补体依赖性细胞毒性反应的降低或损失，因此在体内不诱导不需要的免疫反应。在这点上，去糖基化或无糖基化"glycosylated)形式的免疫球蛋白Fc更适合本发明的用作药物载体的目的。在此使用的术语"去糖基化"指从Fc区酶法去除含糖部分，而术语"无糖基化"指通过原核生物，优选大肠杆菌来产生的不含糖基化形式的Fc区。另一方面，免疫球蛋白Fc区可以从人或包括牛，羊，猪，小白鼠，兔，仓鼠，鼠和豚鼠的其它动物，并优选人中获得。此外，免疫球蛋白Fc区可以是从IgG,IgA,IgD,IgE和IgM,或通过其结合或其杂交体获得的Fc区。优选地，它源自人血中的丰富蛋白中的IgG或IgM,并且最优选已知的能提高配体结合蛋白的半衰期的IgG。另一方面，在此使用的术语"结合"指相同来源的编码单链免疫球蛋白Fc区的多肽被连接到不同来源的单链多肽来形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自包括IgGFc,IgAFc，IgMFc,IgDFc，和IgEFc片段的组的两个或多个片段形成。在此使用的术语"杂交体"指编码不同来源的两个或多个免疫球蛋白Fc区的序列均存在于单链免疫球蛋白Fc区中。在本发明中，各种类型的杂交体是可行的。即，结构域杂交体可以由选自包括IgGFc，IgMFc,IgAFc,IgEFc和IgDFc的Cnl，C2,andCH4的组的一至四个结构域组成，并且可以包括绞链区域。另一方面，IgG被分类为IgGl,IgG2，IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括其结合体和杂交体。优选的是IgG2和IgG4亚类，并且最优选的是几乎不具有例如CDC(补体依赖性细胞毒性)效应子功能的IgG4的Fc区。也就是，作为本发明的药物载体，最优的选免疫球蛋白Fc区是源于人的IgG4非糖基化的Fc区。源于人的Fc区比非源于人的Fc区更加优选，非源于人的Fc区在人体中作为抗原并51起例如针对该抗原产生新抗体的不希望的免疫反应。在此使用的术语"非肽聚合物"指通过除了肽键之外的任何共价键相互连接的包括两个或多个重复单元的生物相容的聚合物。可以用于本发明的非肽聚合物可以选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化的多元醇(polyoxyethylatedpolyol)，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，例如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-羟基乙酸)的生物可降解的聚合物，脂类聚合物，角素，透明质酸和其结合的组，并优选聚乙二醇。此外，现在技术中已知的和本领域的技术人员容易制备的它们的衍生物也包含在本发明的范围中。通过现有的框内融合方法获得的用于融合蛋白的肽连接器具有如下缺点，它在体内容易被蛋白分解酶裂解，因此不能预期的获得通过栽体充分增加活性药物的血液半衰期的效果。然而，在本发明中，可以使用对蛋白水解酶具有耐受力的聚合物将肽的血液半衰期保持到与载体相似的水平。因此，可以用于本发明的任何非肽聚合物可以没有任何限制的被使用，只要它是具有上迷功能的聚合物即可，即，对体内蛋白水解酶有耐受力的聚合物。该非肽聚合物优选具有1至100kDa的分子量，并优选1至20kDa。此外，本发明的连接到免疫球蛋白Fc区的非肽聚合物可以是一种聚合物或不同类型聚合物的结合体。本发明中使用的非肽聚合物具有能够结合到免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应基。非肽聚合物在两端具有反应基，其优选选自包括起反应的醛基，丙醛基，丁醛基，马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺书f生物的组。琥珀酰亚胺书于生物可以是琥珀酰亚胺基丙酸酯，羟基琥珀酰亚胺，琥珀酰亚胺羧曱基或琥珀酰亚胺碳酸酯。特别地，当非肽聚合物在两端具有反应醛基时，在两端与生理活性的多肽和具有最小非特异性反应的免疫球蛋白的连接是有效的。通过醛键的还原性烷基化产生的的终产物比通过酰胺键连接的更加稳定。在低pH下，眵基反应基选择性地结合到N末端，并在例如pH9.0的高pH下结合到赖氨酸残基上形成共价键。非肽聚合物两端的反应基可以是相同的或不同的。例如，非肽聚合物可以在一端具有马来酰亚胺基并在另一端具有醛基，丙醛基或丁醛基。当使用在其两端具有反应性羟基的聚乙二醇作为非肽聚合物时，可以通过已知的化学反应将羟基活化为各种反应基，或者可以使用商业上可获得的具有改性的反应基的聚乙二醇来制备本发明的促胰岛素肽的缀合物。本发明的促胰岛素肽的缀合物保持了现有的促胰岛素肽的体内活性，例如促进胰岛素的合成和分泌，控制食欲，体重损失，增加P细胞对血液中葡萄糖的敏感性，促进P细胞的增殖，延迟胃的排空和胰高血糖素抑制，此外还显著地增加了促胰岛素肽的血液半衰期和肽的体内功效的持续效果，该缀合物对治疗糖尿病，肥胖症，急性冠状综合症或多囊卵巢综合症是有用的。在另一个实施方案中，本发明提供了制备促胰岛素肽的缀合物的方法，该方法包括以下步骤(1)将具有反应基的非肽聚合物和促胰岛素肽的氨基或巯基共价地连接，其中所述的非肽聚合物的两端具有选自包括乙醛，马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物的组的反应基；(2)从(1)的反应混合物中分离出包括促胰岛素肽的缀合物，其中所述非肽聚合物与非N末端的位点共价连接；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价地连接到被分离的缀合物的非肽聚合物的另一端，产生含有免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽的肽的缀合物，其中免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽的肽分别与所述非肽聚合物的一个末端连接。在此使用的术语"缀合物"指通过将非肽聚合物和促胰岛素肽共价连接，并且随后将免疫球蛋白Fc区连接到该非肽聚合物的另一端所制备的中间产物。在一个优选实施例中，本发明提供了一种制备促胰岛素肽的缀合物的方法，该方法包括以下步骤(1)将在两端具有反应性醛基的非肽聚合物和促胰岛素肽的赖氨酸残基共价地连接；(2)从(1)的反应混合物中分离出包括促胰岛素肽的缀合物，其中所述非肽聚合物与赖氨酸残基共价连接；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价地连接到被分离的缀合物的非肽聚合物的另一端，产生含有免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽的肽的蛋白缀合物，其中免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽分别与所述非肽聚合物的一个末端连接。更优选的，(l)的非肽聚合物和促胰岛素肽的赖氨酸残基在pH7.5或更高的pH下被连接。在另一个实施方案中，本发明提供了包括本发明的促胰岛素肽的缀合物的治疗糖尿病的药物组合物。包括本发明的缀合物的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括緩沖剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonicagent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。另一方面，适合药物配方的载体，赋形剂和稀释液的例子包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钩，硅酸4丐，纤维素，曱基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯曱酸甲酯，轻苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。此外，药物配方还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。根据本发明的缀合物在治疗糖尿病，肥胖症，急性冠状综合症或多囊卵巢综合症中是有用的。因此，包括该缀合物的药物组合物可以在治疗这些疾病时被给药。在此使用的术语"给药"指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的缀合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选的，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。由于本发明的药物组合物具有优良的体内功效和浓度的持续时间，它可以显著地减少本发明的药物的给药频率和剂量。通过下面的说明性的实施例获得更好的理解本发明，但是这些实施例不能解释为限制本发明。具体实施例实施例Lexendin-4的聚乙二醇化和位置异构体的分离3.4K丙酸ALD(2)PEG(PEG具有两个丙醛基,IDBInc.,SouthKorea)和exendin-4(AP，USA)的N末端进行聚乙二醇化，使3mg/ml浓度的肽和PEG在4'C以1:15的摩尔比反应90分钟。同时，该反应在pH4.0的lOOmM浓度的NaOAc緩冲液中进行，并且20mMSCB(NaCNBH3)作为还原剂被添加到其中来进行该反应。3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的赖氨酸(Lys)残基进行聚乙二醇化，使3mg/ml浓度的肽和PEG在4。C以1:30的摩尔比反应3小时。同时，该反应在pH9.0的lOOmM浓度的磷酸钠緩沖液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中来进行该反应。单聚乙二醇化的肽使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)从每个反应溶液中被纯化，并且异构体使用SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)被分离。已经发现聚乙二醇化的N末端的峰被较早的发现，并且随后依次发现聚乙二醇化的赖氨酸残基的两个峰。洗脱峰的聚乙二醇化的区域通过肽镨法被证实。Lysl2-聚乙二醇化的缀合物被较早的洗脱，而Lys27-聚乙二醇化的缀合物在最后的部分被洗脱，并且N末端的位置异构体和Lys12的位置异构体相互被完全地分离。色谱柱SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分钟梯度A0->40%80分钟B(A:20mMTrispH8.5,B:A+0.5MNaCl)色语柱SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/min梯度A0-〉100%50minB(A:20mM柠檬酸pH3.0,B:A+0.5MKC1)实施例2exendin-4(N)-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用实施例1描述的相同的方法，3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的N末端反应，并且仅提纯N末端异构体，并且随后与免疫球蛋白Fc结合。该反应在肽免疫球19蛋白Fc1:8的比例下4'C下进行17小时，并且蛋白的总浓度是50mg/ml。该反应在100mMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。使用两个纯化柱纯化结合反应溶液。首先，使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)去除还没有参与结合反应的大量的免疫球蛋白Fc。使用20mMTris(PH7.5)和1M具有盐梯度的NaCL，具有相对较弱的结合力的免疫球蛋白Fc被较早地洗脱，并且随后exendin-4-免疫球蛋白Fc被洗脱。通过这第一步的纯化操作，一定程度上去除了免疫球蛋白Fc，但是由于免疫球蛋白Fc和exendin-4-免疫球蛋白Fc在离子交换色谱柱上具有相互类似的结合力，因此它们不能被相互完全地分离。因此，利用两种材料各自的疏水性进行二次纯化。在SOURCEISO(HR16ml,AmershamBiosciences)使用20mMTris(pH7.5)1.5M的硫酸铵，首次被纯化的样品被结合，并且该样品用梯度减少浓度的硫酸铵被洗脱。在HIC色语柱中，具有较弱结合力的免疫球蛋白Fc被较早的洗脱，并且随后具有较强结合力的exendin-4-免疫球蛋白Fc样品被洗脱。由于它们具有明显不同的疏水性，比起在离子交换色语柱中它们可以更容易地相互分离。然而，由于不同的摩尔比使用了过量的免疫球蛋白Fc,仅适用HIC色谙柱不能获得高纯度。通过反相HPLC测定的纯度是91.6%(图1)。色语柱SOURCEQ(XK16ml，AmershamBiosciences)流速2.0ml/分钟梯度A0->25%70分钟B(A:20mMTrispH7.5，B:A+1MNaCl)色i普柱SOURCEISO(HR16ml,AmershamBiosciences)流速7.0ml/分钟梯度B100->0%60分钟B(A:20mMTrispH7.5,B:A+1.5M硫酸铵)实施例3.exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用实施例1中描述的相同的方法，3.4K丙酸ALD(2)PEG和exendin-4的赖氨酸(Lys)反应，并且仅赖氨酸异构体被纯化，并且随后与免疫球蛋白Fc结合。在两个异构体的峰之间，最后的异构体的峰(Lys27的位置异构体)具有更多的反应并且它容易与N末端异构体峰区分，用于结合反应。该反应在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4。C下进行16小时，蛋白的总浓度是50mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml的两步纯化操作与实施例2相同。通过反相HPLC测定的纯度是91.7%(图2)。实施例4.去-氨基-组氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备为了使3.4KPropionALD(2)PEG与去-氨基-组氨酰基exendin-4(DA-exedin-4，AP,USA)的赖氨酸(Lys)残基发生聚乙二醇化，通过使肽和3.4KPropionALD(2)以1:30的摩尔比在4'C下反应来进行聚乙二醇化，肽的浓度是3mg/ml。反应溶液是lOOmMPH7.5的Na-磷酸緩冲液，并且20mMSCB作为还原剂;故添加到其中。聚乙二醇化的肽通过使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)和SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)的两步纯化操作进行纯化。在两个异构体的峰之间，具有更多的反应并且容易与N末端异构体的峰区分的最后的异构体的峰(Lys27的位置异构体)用于结合反应。该反应在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4'C下进行20小时，蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是95.8%(图3)。色语柱SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分梯度A0->20%70分B(A:20mMTrispH9.0,B:A+1MNaCl)色谱柱SOURCES(XK16ml,AmershamBiosciences)流速2.0ml/分梯度A0->50%50分B(A:20mM柠檬酸pH3.0,B:A+1MKC1)实施例5羟基-咪唑-丙酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用实施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和p-羟基-咪唑-丙酰基exendin-4(HY-exedin-4,AP,USA)的赖氨酸(Lys)残基反应。在两个异构体的峰之间，具有更多的反应并且容易与N末端异构体的峰区分的最后的异构体的峰(Lys27的位置异构体)用于结合反应。该反应在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4。C下进行20小时，蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是93.9%(图4)。实施例6.咪唑-乙酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用与实施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和咪唑-乙酰基exendin-4(CA-exedin-4,AP,USA)的赖氨酸(Lys)残基反应。在两个异构体的峰之间，具有更多的反应并且容易与N末端异构体的峰区分的最后的异构体的峰(Lys27的21位置异构体)用于结合反应。该反应在肽免疫球蛋白Fc1:8的比例，4'C下进行20小时，蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是95.8%(图5)。实施例7.Serl2突变的DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备3.4KPropionALD(2)PEG和Serl2突变的DAexendin-4的赖氨酸(Lys)残基进行聚乙二醇化，使所述肽和3.4KPropionALD(2)PEG以1:30摩尔比，肽的浓度为3mg/ml在25。C反应3小时。此时，反应在lOOmM浓度，pH7.5的Na-磷酸緩冲液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中进行反应。单聚乙二醇化的肽的纯化操作使用SOURCEQ(XK16ml，AmershamBiosciences)而不使用SOURCES(XK16ml,AmershamBioscience)如实施例4中描述的进行。该反应在肽免疫球蛋白Fcl:8的比例，4'C下进行20小时，蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在100mMK-P(pH6.O)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。由于Serl2突变的DAexendin-4具有更强的阴离子性质，不参与反应的过量的免疫球蛋白Fc仅使用SOURCEQ通过纯化操作被有效地去除了。因此，使用SOURCEISO的纯化操作被省略了，并且使用SOURCEQ的纯化操作的条件与实施例2中的相同。通过反相HPLC测定的纯度是92.5%(图6)。实施例8.Argl2突变的DAexendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用与实施例7中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和Argl2突变的DAexendin-4(AP,USA)的赖氨酸(Lys)残基反应并被纯化。随后，进行结合反应。该反应在肽免疫球蛋白Fcl:8的比例，4。C下进行20小时，蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是99.2%(图7)。实施例9.氨基-组氨酰基exendin-4(Lys27)-白蛋白缀合物的制备使用与实施例4中描述的相同方法，3.4KPropionALD(2)PEG和去-氨基-组氨酰基exendin-4(AP，USA)的赖氨酸(Lys)残基反应并被纯化。该反应在肽作为载体物质的源于人血的白蛋白(Greencross,SouthKorea)以1:7的比例，4。C下进行24小时，蛋白的总浓度是50mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是90.3%(图8)。实施例10.二甲基-组氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备使用二曱基-组氨酰基exendin-4(DMexendin,AP,USA)，由与实施例4中描述的相同方法制备二曱基-组氨酰基exendin-4(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物。通过反相HPLC测定的纯度是96.4%(图9)。实施例11.GLP-1(N)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备3.4KButyrALD(2)PEG(具有两个丁醛基团的PEG,Nekatar,USA)和GLP-1的N末端UP,USA)通过1:5摩尔比的肽和PEG在4。C下反应90分钟进行聚乙二醇化，肽的浓度是3m/ml。此时，该反应在lOOmMK-P(pH6.O)溶液中进行，并且20raMSCB(NaCNBH3)作为还原剂被添加到其中。随后，该反应在肽免疫球蛋白Fc以1:IO的比例，4'C下进行16小时，蛋白的总浓度是50mg/ml。该反应在lOOmMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。通过反相HPLC测定的纯度是91%(图10)。实施例12去-氨基-组氨酰基-GLP-l(Lys27)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备3.4KPropionALD(2)PEG和去-氨基-组氨酰基GLP-1的赖氨酸(Lys)残基(AP，USA)进行聚乙二醇化，使l:30摩尔比的肽和3.4KPropionALD(2)在4'C下反应4小时，肽的浓度是3m/mi。此时，该反应在pH7.5,lOOmM浓度的Na-磷酸緩冲液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中来进行反应。单聚乙二醇化的肽的纯化操作使用SOURCEQ(XK16ml,AmershamBiosciences)进行。该反应在肽免疫球蛋白Fc以1:6的比例，4'C下进行16小时,蛋白的总浓度是60mg/ml。该反应在1OOmMK-P(pH6.0)溶液中进行，并且20mMSCB作为还原剂被添加到其中。在结合反应后，使用与实施例2相同的SOURCEQ16ml和SOURCEISO16ml进行两步纯化。但是，由于GLP-1免疫球蛋白Fc缀合物和免疫球蛋白Fc之间的疏水性的差异小于exendin-4免疫球蛋白Fc和免疫球蛋白Fc之间的疏水性，所以在SOURCEISO16ml中的溶解度下降了。因此，在上述纯化操作后还要进行使用SOURCEISO16ml的纯化操作。通过反相HPLC测定的纯度是91.9%(图11)。实施例13.使用ButyrALD连接器PEG的缀合物的制备使用3.4KButyrALD(2)PEG(具有两个丁醛基团的PEG,Nektar,USA),用与实施例1中描述的相同方法制备3.4Kexendin-4。它使用实施例3中描述的相同方法与免疫球蛋白Fc结合。通过反相HPLC测定的纯度是92.3%(图12)。实施例14.exendin-4体外活性持续释放的测定为了测定exendin-4的长效制剂的功效，使用测定体外细胞活性的方法。通常，为了测定GLP-1的体外活性，分离胰岛瘤细胞或胰岛，并且测定细胞中的cAMP's是否在GLP-1治疗后增加。对于本实验中使用的测定体外活性的方法，使用已知为老鼠胰岛瘤细胞的RIN-m5F(ATCC.)细胞。这些细胞具有GLP-1受体，并且因此它们通常用于测定GLP-1家族的体外活性的方法中。用GLP-1，exendin-4处理RIN-m5F,并且实验材料是不同的浓度。细胞中的信号分子cAMP's的出现通过实验材料被测定，并且从而评价EC50，并相互比较。结果在表l中显示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>_DMexendin-4:二曱基-组氨醜基exendin-4-DAexendin-4:去-氨基-组氨酰基exendin-4_HYexendin-4:p-羟基-咪口坐-丙酰基exendin-4-CAexendin-4:咪峻-乙酰基exendin-4-Serl2DAexendin-4:DAexendin-4其中exendin-4的第12位赖氨酸残基用丝氨酸取代-DAGLP-1:去-氨基-组氨酰基-GLP-1-Exendin-4(N)-PEG-Fc:exendin-4的N末端和Fc区被连接到PEG的缀合物-Exendin-4(Lys27)-PEG-Fc:exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物-DMexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:二曱基-组氨酰基exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连j妻到PEG的缀合物-DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:去-氨基-组氨酰基exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物-HYexendin-4(Lys)-PEG-Fc:p-羟基-。米唑-丙醜基exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物-CAexendin-4ays)-PEG-Fc:咪峻-乙酰基exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物-Serl2DAexendin-4(Lys27)-PEG-Fc:Ser12去-氨基-组氨酰基exendin-4第27位的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物，其中exendin-4的第12位残基被丝氨酸取代-DAexendin—4(Lys27)—PEG-Albumin:去-氨基—组氨酰基exendin—4第27位的赖氨酸残基和白蛋白被连接到PEG的缀合物-DAGLP-l(Lys20,28)-PEG-Fc:去-氨基-组氨酰基GLP-1的赖氨酸残基和Fc区被连接到PEG的缀合物实施例15.长效exendin-4的体内功效实验为了测定长效制剂exendin-4的体内功效，使用测定糖尿病模型的db/db小鼠血液中葡萄糖浓度减少的效果的方法。100mcg/kg长效exendin-4制剂两周给药一次，并且100mcg/kg的天然exendin-4被每天给药给6至7周大的糖尿病小鼠，不限制食物。在服用实验材料后，每天收集血液，并且测定血液葡萄糖含量的变化。特别地，使用天然的exendin-4时，血液葡萄糖浓度在给药1小时后被测定(图14)。当给药一次时，Exendin-4衍生物的缀合物能维持血液葡萄糖浓度的减少达10天或更久，而天然exendin-4的缀合物的减少葡萄糖的活性在8天后消失。工业适用性本发明的促胰岛素肽的缀合物在体内维持相对高的活性，并且显著增加血液半衰期，并且因此它可以如愿地用于各种肽类药物的长效配方的开发中。权利要求1.一种促胰岛素肽缀合物，所述缀合物含有通过非肽聚合物连接的促胰岛素肽和免疫球蛋白Fc区，其中所述的非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中所述非肽聚合物的一个末端与所述促胰岛素肽的非N末端的氨基酸残基连接。2.根据权利要求1所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述促胰岛素肽选自包括GLP-1，exendin-3，exendin-4,激动剂，衍生物，片段和其变体,以及它们的组合的组。3.根据权利要求2所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述衍生物选自包括肽，和片段和其变体的组，其中所述的肽具有促胰岛素功能并且取代，敲除或修饰了天然促胰岛素肽的N末端的氨基。4.根据权利要求2所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述书f生物选自包括肽，和片段和其变体的组，其中所述的肽敲除了天然促胰岛素肽的N末端的a碳并含有其氨基。5.—种促胰岛素肽缀合物，其中exendin-4的衍生物和免疫球蛋白Fc区通过非肽聚合物被连接，其中所述exendin-4的衍生物的N末端的氨基被取代，被敲除或被修饰，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们的组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。6.根据权利要求5所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述exendin-4衍生物选自包括通过敲除N末端氨基而制备的exendin-4衍生物，通过用羟基取代N末端氨基而制备的exendin-4衍生物，通过用二曱基修饰N末端氨基而制备的exendin-4衍生物，通过敲除所述促胰岛素肽中的exendin-4的第一氨基酸即组氨酸的a碳而制备的exendin-4衍生物，通过用丝氨酸取代第12位氨基酸(赖氨酸)而制备的exendin-4书f生物和通过用精氨酸取代第12位氨基酸(赖氨酸)而制备的exendin-4衍生物的组。7.—种促胰岛素肽缀合物，其中通过敲除exendin-4的N末端氨基而制备的去-氨基-组氨酰基exendin-4与免疫球蛋白Fc通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。8.—种促胰岛素肽缀合物，其中通过敲除exendin-4的N末端氨基而制备的去-氨基-组氨酰基exendin-4与白蛋白通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。9.一种促胰岛素肽缀合物，其中通过用羟基取代exendin-4的N末端氨基而制备的exendin-4与免疫球蛋白Fc通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽的缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。10.—种促胰岛素肽的缀合物，其中通过用羟基取代exendin-4的N末端氨基而制备的exendin-4与白蛋白通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。11.一种促胰岛素肽的缀合物，其中通过敲除exendin-4的N末端组氨酸的a碳并含有N末端氨基而制备的exendin-4衍生物与免疫球蛋白Fc通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和其组合的组，并且，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。12.—种促胰岛素肽缀合物，其中通过敲除exendin-4的N末端组氨酸的cc碳并含有N末端氨基而制备的exendin-4衍生物与白蛋白通过非肽聚合物连接，其中所述非肽聚合物选自包括聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和其组合的组，其中与含有天然exendin-4的缀合物相比，所述促胰岛素肽的缀合物具有降低血液中葡萄糖浓度和增加体内功效持续时间的改善效果。13.—种促胰岛素肽的衍生物，其中所迷促胰岛素^"生物由下面的化学式1表示RrX-Y-Z-R2<化学式1>其中，R,选自包括组氨酸，去-氨基-组氨酰基，N-二曱基-组氨酰基，P-羟基-咪唑丙基和4-咪唑乙酰基的组；R2选自包括-NH2，-OH和-Lys的组；X选自包4舌Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Uu-R4-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly,和Ser-Asp-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-R3-Gin-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va卜Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-R4-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser的组；R3选自包4舌Lys,Ser和Arg的组；R4选自包括Lys,Ser和Arg的组；Y是聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇和丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯基乙醚，生物可降解的聚合物，脂类聚合物，几丁质，透明质酸和它们组合的組；和Z是免疫球蛋白Fc区。14.根据权利要求1所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述非肽聚合物的两个末端分别与所述免疫球蛋白Fc区的氨基或巯基和所述促胰岛素肽连接。15.根据权利要求1所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是去糖基化的。16.根据权利要求1所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自包括Cl，C2，C3和C4结构域的组的一个至4个结构域组成。17.根据权利要求16所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区还包括交链区域。18.根据权利要求1至5中的任何一项所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述促胰岛素肽的Fc区是来自免疫球蛋白的Fc区，其中所述的免疫球蛋白选自包括IgG，IgA，IgD,IgE和IgM的组。19.根据权利要求18所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区的每个结构域是来自免疫球蛋白的不同源的结构域杂交体，其中所述的免疫球蛋白选自包括IgG,IgA，IgD,IgE和IgM的组。20.根据权利要求18所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是由相同源的单链免疫球蛋白组成的二聚体或多聚体(即免疫球蛋白Fc的结合体)。21.根据权利要求18所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。22.根据权利要求21所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是人源去糖基化的IgG4Fc区。23.根据权利要求1所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述非肽聚合物的反应基选自包括酰基，丙醛基，丁醛基，马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物的组。24.根据权利要求23所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物选自包括琥珀酰亚胺基丙酸酯，琥珀酰亚胺基羧曱基酯，羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯的组。25.根据权利要求23所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述非肽聚合物的两个末端具有反应性眵基。26.根据权利要求25所述的促胰岛素肽缀合物，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。27.—种制备促胰岛素肽缀合物的方法，所述方法包括以下步骤(1)将两个末端具有反应基的非肽聚合物和促胰岛素肽的氨基或巯基共价地连接，其中所述的反应基选自包括乙醛，马来酰亚胺和琥珀酰亚胺衍生物的组；(2)从(1)的反应混合物中分离出含有促胰岛素肽的缀合物，其中所述非肽聚合物与除了N末端氨基酸之外的其他氨基酸共价连接；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价地连接到被分离的缀合物的非肽聚合物的另一个末端，产生含有免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽的肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽分别与所述的非肽聚合物的一个末端连接。28.—种制备促胰岛素肽缀合物的方法，所述方法包括以下步骤(1)在pH7.5或更高的pH下，将在两个末端具有反应性醛基的非肽聚合物与促胰岛素肽的赖氨酸残基共价地连接；(2)从(1)的反应混合物中分离出含有所述促胰岛素肽的缀合物，其中所述非肽聚合物与所述赖氨酸残基共价连接；和(3)将免疫球蛋白Fc区共价地连接到被分离的缀合物的非肽聚合物的另一个末端，产生含有免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽的肽缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区和促胰岛素肽分别与所述的非肽聚合物的一个末端连接。29.根据权利要求27或28所述的制备促胰岛素肽缀合物的方法，其中所述促胰岛素肽是通过敲除N末端氨基制备的去-氨基-组氨酰基exendin-4。30.根据权利要求27或28所述的制备促胰岛素肽缀合物的方法，其中所述促胰岛素肽是通过用羟基取代N末端的氨基制备的exendin-4衍生物。31.根据权利要求27或28所述的制备促胰岛素肽缀合物的方法，其中所述促胰岛素肽是通过敲除exendin-4的第一个氨基酸即组氨酸的af灰制备的exendin-4书f生物。32.根据权利要求27或28所述的制备促胰岛素肽缀合物的方法，其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。33.用于治疗糖尿病，肥胖症，急性冠状综合症或多囊卵巢综合症的药物组合物，所述组合物包括权利要求1至32中任何一项所述的肽缀合物。全文摘要本发明涉及一种具有改善体内功效和稳定性持续时间作用的促胰岛素肽缀合物，该肽缀合物包括促胰岛素肽，非肽聚合物和免疫球蛋白Fc区，它们以共价键相互连接，本发明还涉及该肽的缀合物的用途。本发明的促胰岛素肽缀合物具有相对高的体内活性，并显著增加血液半衰期，因此它可以如愿地用于各种肽类药物的长效配方的开发。文档编号A61K38/28GK101646451SQ200880001766公开日2010年2月10日申请日期2008年1月4日优先权日2007年1月5日发明者宋台宪,宋大海,崔仁荣,权世昌,李宽淳,林昌基,郑圣烨,金永勳申请人:韩美药品工业株式会社