专利名称：能够降解淀粉样β肽的融合蛋白的制作方法
能够降解淀粉样P肽的融合蛋白
本发明涉及融合蛋白和它们在阿尔茨海默氏病患者的酶治疗中
的用途。所述融合蛋白包括切割淀粉样P ( AP)肽的成分、调节血浆 中的半衰期的另一种成分；以及任选地，连接前两种成分的第三种成
背景技术：
本发明涉及通过将淀粉样肽与特异性识别淀粉样肽，并且通过降 解或修饰来灭活它们的酶反应，来预防淀粉样斑块形成和/或生长的方 法。本发明进一步涉及通过施用具有改善的催化活性和/或选择性以及 血浆中延长的活性的优化的淀粉样肽降解酶治疗阿尔茨海默氏病的 方法。本发明还涉及医学治疗的领域，特别是涉及神经变性疾病的领 域，并提供了在患有神经变性疾病、特别是阿尔茨海默氏病的患者中 引发脑淀粉样的清除机制的方法。此外，本发明涉及在引发这种机制 中有效的蛋白质和肽的用途。
本发明描述了 A(3肽降解分子如何通过附着调节血浆中的稳定性 和半衰期的分子来成为治疗相关的试剂。本发明中描述的Ap肽降解 分子总的说来具有过短的血浆半衰期，不能用作有效的治疗试剂。然 而，通过将这些降解分子与本发明中描述和例示的调节物分子组合， 产生了功能性试剂，通过施用这些优化的淀粉样肽降解酶融合蛋白， 其可以有效地用于治疗阿尔茨海默氏病。
神经变性疾病，特别是阿尔茨海默氏病(AD)对患者的生命具有 强烈的致虛弱(debilitating)影响。此外，这些疾病构成了巨大的健 康、社会和经济负担。AD是最常见的年龄相关的神经变性状况，影 响了约10%的超过65岁的群体，以及最多达45%的超过85岁的群体 (Vickers等，尸rog"5^7Vewro6/o/og7 2000， 60:139-165 )。 当前， 这个数量在美国、欧洲和日本估计为1千2百万。这种情况将不可避 免，随着发达国家中老年人数量的人口统计的增加而恶化。患有AD
与异常纤维状结构的出现和神经纤维缠结的形:同时发生。家族 的和单个发生的病例都共有作为常见的病理标志的细胞外、纤维状卩_ 淀粉样的脑中沉积，这被认为与神经元功能的损伤和神经元丧失相关
(Younkin S. G.，肠ro/. 37， 287-288， 1995; Selkoe, D. J.，淑, 399， A23-A31 ， 1999; Borchelt D. R.等，A^wrow 17, 1005-1013， 1996 )。
卩-淀粉样沉积由几种淀粉样-P肽(Ap)组成；特别是A(342在淀粉样 斑块中逐渐地沉积。AD是进行性疾病，其与记忆形成的早期缺陷相 关并最终引起高级认知功能的完全侵蚀。AD的发病机理的特征是特 定的脑区域和神经细胞的亚群对变性过程的选择性易损性。具体地， 颞叶区域和海马在早期受影响，在疾病的发展期间更加严重。另一方 面，额皮层、枕骨皮层和小脑内的神经元基本上仍是完整的，并且被 保护免于神经变性 (Terry等，爿w"a/s o/ A^wra/ogy 1981 , 10:184-192 )。
遗传学的证据表明，在许多而不是所有的引起家族性AD的遗传 学状况中产生提高量的Ap42 (Borchelt D. R.等，A^wro" 17， 1005-1013， 1996; DuffK.等，胸,383， 710-713， 1996; Scheuner D.等，A^. 2， 864-870， 1996; Citron M.等，A^wro&o/. 5， 107-116, 1998 )，指出淀粉样形成的可能性可能是提高的APu产生 或降低的降解或这两者引起的(Glabe，C.，淑.似ec/. 6， 133-134,2000)。 然而这些是早期发作的AD的实例，其可以归因于APP、早老蛋白 (presenilin) -1和早老蛋白-2基因中的遗传缺陷，晚期发作的单个发 生的AD的主要形式具有迄今未知的发病机理起源。然而，已经鉴定 了使个体倾向于发生AD的几种风险因素，在它们之中最显著的是栽 脂蛋白E( ApoE)的e4等位基因和半胱氨酸蛋白酶抑制物C(cystatin C)的B等位基因。神经变性病症的晚期发作和复杂的发病机理构成 了对治疗试剂开发的艰难的挑战。
当前，对AD没有治愈方法，也没有以高检出率死亡前诊断AD 的方法。然而，p-淀粉样蛋白成为为降低它的形成(Vassar， R.等， S".e匿286， 735-41， 1999)，或活化加速它从脑中清除的机制而设 计的药物开发的主要靶点。
然而，Schenk等人(Nature, vol. 400, 173-177, 1999; Arch. Neurol., vol.57, 934-936, 2000 )的第一实验结果暗示了 AD的可能的新治疗 策略。过量表达突变的人类APP (其中位置717的氨基酸是苯丙氨酸而不是正常的缬氨酸)的PDAPP转基因小鼠以年龄和脑部区域依赖 性的方式逐渐发展出AD的许多神经病理标志。在AD型神经病理(在 6周龄)的发作之前或在更大的年龄(11个月)用Ap42免疫转基因动 物，此时淀粉样-P沉积和几种随后的神经病理变化被良好地证实。年 轻动物的免疫基本上防止了 p-淀粉样斑块形成、神经炎营养不良和星 形胶质增生的发生。更老的动物的治疗同样显著地降低了这些AD样
神经病理的程度和发展。显示的是，A卩42免疫引起了抗A卩抗体的产
生，Af3免疫反应性单核细胞/小胶质细胞在残存斑块的区域中出现。 然而，主动免疫方法可能在人类受试者中产生严重的副作用和迄今未 知的并发症。
Bard等人(Nature Medicine, Vol.6, Number 8, 916-919， 2000) 它们相对中度的血清水平，被动施用e的抗体能够跨越血脑屏l^并:4入
中枢神经系统，修饰斑块并诱导先存的淀粉样的清除。然而，即使是 针对p-肽的被动免疫也可能在人类患者中引起不希望的副作用。
本发明涉及使用重组蛋白质来治疗阿尔茨海默氏病患者。A卩肽
当多的工作集中于A|3肽的产生，直到最近，显著地更少的关注;给 予这些肽的清除。细胞外的AP肽的去除看起来通过两种一般机制进 行细胞的内在化和细胞外的降解。本发明描述了新的方法，其将补 充淀粉样(3肽的天然的分解代谢过程。
DeMattos ( PNAS 98: 8850-8855. 2001 )描述了沉没(sink)假说， 其声称A(3肽可以通过降低血浆中肽的浓度间接地从CNS中除去。他 们在血浆中使用了结合AP肽的抗体，从而从CNS中隔离Ap。因为 抗体阻止AP从血浆流入CNS,和/或由于血浆中游离A卩浓度的降低 改变了血浆和CNS之间的平衡，实现了这一点。与抗体不相关的淀 粉样结合试剂也已经显示了通过血浆中的结合在从CNS中除去淀粉 样(3-肽方面是有效的。Matsuoka等人(J. Neuroscience, Vol. 23: 29-33, 2003 )呈现了利用两种淀粉样(3-肽结合试剂，凝溶胶蛋白(gelsolin) 和GM1的数据，其隔离血浆AP并从而降低或防止脑部淀粉样变性。
除去或消除AP肽的另一种方法是使用降解酶，其将淀粉样P肽 降解成没有或具有更低毒理学效应的更小的片段，其更易于清除。A|3
7肽的这种酶消化还通过降低血浆中淀粉样(3肽的游离浓度的沉没假说 机制起作用。然而，还可能的是CNS和/或CSF中淀粉样(3肽的直接 清除。这种方法将不仅降低A|3的游离浓度，还直接清除来自全长肽 的环境。这种方法是有益的，因为它将不会提高血浆中A|3的总(游 离的和结合的)浓度，如同在利用淀粉样[3肽结合试剂如抗体时的情 况中所见的。文献中描述了酶，它们在多个位点降解Ap肽，例如NEP (Leissring等，JBC. 278: 37314-37320， 2003 )。在多个位点的A卩 肽降解将产生容易从血流中清除的小片段。
附图的简要描述 附
图1
淀粉样P1-40肽(终浓度300nM )在緩沖液中被商售的中性溶酶 (2.4nig/ml)或Fc-中性溶酶融合蛋白(2.4fig/ml)降解。
附图2
在豚鼠血浆中His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D Systems)的A卩40降解。使用两种浓度的His-Fc-Nep，在4小时后测 量A(340水平。商售的中性溶酶用作阳性对照，膦酰二肽用作中性溶 酶特异性抑制物。
附图3
豚鼠血浆中 His-Fc-Nep (SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems)的A卩42降解。使用两种浓度的His-Fc-Nep， 4小时之后测 量AP42水平。商售的中性溶酶用作阳性对照，膦酰二肽用作中性溶 酶特异性抑制物。
附图4
人血浆中His-Fc-Nep ( SPL061128 )和中性溶酶(R&D systems ) 的A(340降解。使用两种浓度的His-Fc-Nep, 4小时后测量A(340水平。 商售的中性溶酶用作阳性对照，膦酰二肽用作中性溶酶特异性抑制物。附图5
与商售的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布图(随着时间 的过去的血浆浓度)。小鼠施用1 mg/kg商售的中性溶酶，或l或5 mg/kg内部生产的Fc-Nep。
附图6
与中性溶酶-Fc(Fc的C-末端融合物)相比较，细胞培养基中来 自Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的表达的酶活性。说明 PCEP4GW-Nep-Fc : 从pCEP4质粒表达的中性溶酶-Fc ; PEAK10GW-Nep-Fc:从pEAK10质粒表达的中性溶酶-Fc; com.Nep: 阳性对照，商业上可获得的中性溶酶；PCEP4GW-Fc-Nep:从pCEP4 质粒表达的Fc-中性溶酶；PEAK10GW-Fc-Nep:从pEAK10质粒表 达的Fc-中性溶酶。
附图7
雌性APPSWE-tg小鼠血浆中在用Fc-Nep急性治疗以及阳性对照、 y-分泌酶抑制物M550426的治疗之后的可溶Ap40水平。
附图8
雌性APPSWE-tg小鼠血浆中在用Fc-Nep急性治疗以及阳性对照、 分泌酶抑制物M550426的治疗之后的可溶AP42水平。
附图9
与中性溶酶-Fc ( Fc的C-末端融合物)相比较，纯化的蛋白质Fc-中性溶酶(Fc的N-末端融合物)的酶活性。
说明Nep-Fc:在中性溶酶的C-末端部分融合到Fc的中性溶酶； Fc-Nep:在中性溶酶的N-末端部分融合到Fc的中性溶酶。
附图10
在雌性C57BL/6小鼠的血浆中用hFc-Nep急性治疗以及用阳性对 照Y-分泌酶抑制物M550426治疗之后的小鼠Ap40水平。
9附图11
在对雌性C57BL6小鼠的hFc-Nep单次注射后不同时点的血浆中 A(340水平。百分比显示了与栽体相比的降低。hFc-Nep的暴露在图表 中每个治疗柱条上显示。用阳性对照Y分泌酶抑制物M550426治疗的 效果以红色显示。LOQ线显示了分析中的定量限。
附图12
在对雌性APPswE转基因小鼠的mFc-Nep单次注射后的不同时点 (从1.5直到336小时)血浆中平均A卩40 ( A)和A卩42 ( B)水平。 百分比显示了与栽体相比的降低。表(C)显示了相应组的血浆暴露。 用阳性对照Y分泌酶抑制物M550426治疗的效果以红色显示。LOQ 柱条显示了分析中的定量限。利用ANOVA模型中的双側t-检验、时 间和剂量作为固定因素来分析数据(* p<0.05; ** pO,Ol以及*** pO.001和n.s,不显著)。
附图13
药物动力学和药效学图表分别显示了 A(340和A(342的血浆效力效 果，作为所有时点(1.5-336小时)栽体的百分比，以及相应的mFc-Nep 血浆暴露。相应图表中的线显示了预测的暴露和效果。
在C57BL/6小鼠中，mFc-Nep在所有时点(1.5、 168和336小时) 在5和25mg/kg下显著地降低了血浆中小鼠A(340 (附图14)。在168 和336小时时，分析了 5和25 mg/kg, A(340效果显示是剂量依赖性 的。在2周后，25 mg/kg mFc-Nep的单次注射(336小时)，与栽体 相比，显著地降低血浆中小鼠A(340水平73%。在这个时点的血浆暴 露是48jag/ml，从而mFc-Nep显示了具有长的血浆半衰期。
附图14
在mFc-Nep向雌性C57BL6小鼠的单次静脉内注射之后的不同时 点(1.5、 168和336小时)血浆中的平均A|340水平。百分比显示了 与栽体相比的降低。表右側显示了相应组的血浆暴露。用阳性对照Y 分泌酶抑制物M550426治疗的效果以红色显示。LOQ柱条显示了分 析中的定量限。利用ANOVA模型中的双侧t-检验、时间和剂量作为
10固定因素来分析数据(* p<0.05; **p<0.01, *** pO.001和n.s.不显 著).
附图15
与内部生产的中性溶酶相比Fc-Nep融合蛋白的PK分布图(随着 时间的过去的血浆浓度)。向小鼠施用单次i.v.剂量的10或50 nmol 酶/kg体重中性溶酶(Nep )或Fc-Nep ( 1和5 mg/kg )。
附图16
表格描述了通过人类或小鼠Fc-中性溶酶在人血浆或APPswe-tg小 鼠血浆中淀粉样卩肽1-40或1-42的降解。降解的ECso ( nM)和最高 (lOOpg/mL)浓度的人类或小鼠Fc-中性溶酶下的降解。/。。结果基于 2-3个独立实验。
发明内容
本发明的目的是提供能够降解A(3肽的融合蛋白。因而，本发明 提供了具有式M-A的融合蛋白，能够在淀粉样|3肽氨基酸序列中一 个或更多个切割位点降解所述淀粉样(3肽，其中M是延长所述融合蛋 白的半衰期的蛋白质成分，A是切割淀粉样p肽的蛋白质成分，其中 所述M蛋白质成分共价地连接到A蛋白质成分的N-末端部分。
在本发明的一个方面，提供了融合蛋白，其中A是蛋白酶。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是人类中性溶 酶(Neprilysin )。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是人类中性溶 酶，其中所述中性溶酶是细胞外的中性溶酶。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是细胞外的中 性溶酶，包含根据SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一个的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是胰岛素降解
酶o
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是内皮素 (endothelin)转化酶1
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中A是支架蛋白质。在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是抗体的Fc 部分。在这个方面的一个实施方式中，所述抗体是IgG抗体。在这个 方面的另一个实施方式中，所述抗体是IgG2抗体。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是来自IgG2 抗体的Fc部分，A是细胞外的中性溶酶。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，包含根据SEQIDNO: 11的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是来自IgG2 抗体的Fc部分，A是胰岛素降解酶。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，包含根据SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是来自IgG2 抗体的Fc部分，A是内皮素转化酶l。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，包含根据SEQIDNO: 13的氨基酸序列。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M选自PEG化 和糖基化。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA。 在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M是HSA结合 结构域。
在本发明的另一个方面，，提供了融合蛋白，其中M是抗体结合结构域。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中M和A用接头L 连接在一起。
在本发明的另一个方面，提供了融合蛋白，其中L选自肽和化学 接头。
在本发明的另一个方面，提供了降低淀粉样P肽浓度的方法，所 述方法包括施用根据本发明的融合蛋白。在这个方面的一个实施方式 中，在血浆中实现所述淀粉样(3肽的降低。在这个方面的另一个实施 方式中，在CSF中实现所述淀粉样|3肽的降低。在这个方面的又一个 实施方式中，在CNS中实现所述淀粉样(5肽的降低。
在本发明的另一个方面，提供了能够降解淀粉样(3肽的药物组合物，包括药学上可接受量的根据本发明的融合蛋白和药学上可接受的 栽体或赋形剂。
在本发明的另一个方面，提供了预防和/或治疗状况的方法，在所 述状况中淀粉样P肽的降解是有益的，包括向需要这样的预防和/或治 疗的哺乳动物，包括人类施用治疗有效量的根据本发明的融合蛋白。
在本发明的另 一 个方面，提供了预防和/或治疗阿尔茨海默氏病、 系统性淀粉样变性或脑淀粉样血管病的方法，包括向需要这样的预防 和/或治疗的哺乳动物，包括人类施用治疗有效量的根据本发明的融合 蛋白。
在本发明的另 一个方面，提供了用于在医学治疗中的根据本发明 的融合蛋白。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的融合蛋白在药物的制造
中的用途，所述药物用于预防和/或治疗其中淀粉样|3肽的降解是有益 的的状况。
在本发明的另一个方面，提供了本发明的融合蛋白在药物的制造 中的用途，所述药物用于阿尔茨海默氏病，系统性淀粉样变性或脑淀 粉样血管病的预防和/或治疗。在这个方面的一个实施方式中，所述药 物降低淀粉样(3肽浓度。在血浆、CSF和/或CNS中实现所述淀粉样 (3肽的降低。
在整个说明书中使用的术语如下定义，除非在特定的情况中另外 限定了。
术语"调节物"是指防止降解和/或提高血浆半衰期、降低毒性、降 低免疫原性、或提高治疗蛋白质的生物学活性的分子。示范性的调节 物包括Fc结构域以及线型聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)、聚赖氨 酸、葡聚糖，等等)；支链的聚合物(参见，例如，美国专利NO. 4，289，872,美国专利NO. 5,229,490; W093/21259);脂质；胆固醇 基团(例如类固醇)；碳水化物或低聚糖；或结合补救受体(salvage receptor)的任何天然的或合成的蛋白质、多肽或肽。糖基化也是调节 物的实例，其通过融合蛋白的大小的提高可以延长血浆半衰期，主要 是由于清除机制方面的改变。调节物还可以包括人血清白蛋白(HSA) 结合成分，从而其延长融合蛋白的血浆半衰期。
术语"蛋白质"或"蛋白质成分"是指具有催化活性的分子，其通过在氨基酸序列中任何可能的位点蛋白水解切割来降解淀粉样(3肽。蛋
化性抗体也可以用作蛋白质部分。蛋白质可以是来自任何物种(例如， 人类、猴、小鼠)的天然存在的变体，或利用合理设计或分子进化技 术设计的变体。蛋白质分子还可以是不同的多态性或剪接变体。蛋白
是，蛋白;可以是中性;i酶的改进的变体，其通过氨基酸替换在结构 中被修饰来获得改进的性质，例如提高的活性、改进的针对淀粉样p
长的活性。
术语"融合物"是指由调节物分子和蛋白质分子组成的分子。调节 物可以共价连接到蛋白质部分来产生融合蛋白。非共价的方法也可以 用于将蛋白质连接到调节物部分。
术语"降解(degrade) 、 (degrading)或(degradation)，，是指一 种起始分子被分成两个或更多个分子的过程。更具体地，淀粉样(3肽 (从氨基酸1 -43到更小的任何大小)被切割来产生与起始分子相比更 小的片段。切割可以通过肽键的水解作用或其他类型的反应来实现，
其将分子切割成更小的部分。
术语"天然Fc"是指包含产自完整抗体消化的非抗原结合片段的 序列的分子或序列，无论是单体还是多聚体形式。天然Fc的原始的 免疫球蛋白来源可以是人类来源，并且可以是任何免疫球蛋白，而 IgGl和1gG2是优选的。天然Fc's由通过共价(即，二硫鍵)和非共 价締合连接成二聚或多聚形式的单体多肽构成。天然Fc分子的单体 亚基之间分子间二硫键的数量取决于类(例如，IgG、 IgA、 IgE)或 亚类(例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgAl、 IgGA2) 乂人1到4个。天然 Fc的一个实例是产自IgG的木瓜蛋白酶消化的二疏键键合的二聚体 (参见Ellison等(1982 ) ， M/c/e!c ^c/心10:4071-9)。在此使 用的术语"天然Fc"对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。
术语"Fc变体"是指从天然Fc修饰但仍然包含补救受体FcRn的结 合位点的分子或序列。公开文献WO 97/34631和WO 96/32478描述了 示范性的Fc变体，以及与补救受体的相互作用，通过引用合并在此。 因而，术语"Fc变体"包含从非人类天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以被移除的位点，因为它们提供本发明的融合物 分子不需要的结构特征或生物学活性。因而，术语"Fc变体"包括缺少 一个或更多个天然Fc位点或残基的分子或序列，所述位点或残基影 响或涉及(1 ) 二硫键形成，(2)与选定宿主细胞的不相容性，(3) 在选定宿主细胞中表达时的N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补 体的相互作用，(6)结合除补救受体外的Fc受体，或(7)抗体依 赖性细胞的细胞毒性(ADCC) 。 Fc变体在下文中进一步详细描述了 。
术语"Fc结构域"包含上文定义的天然Fc和Fc变体分子和序列。 对于Fc变体和天然Fc，术语"Fc结构域"包括单体或多聚体形式的分 子，不论是从完整抗体消化的还是通过其他方式产生的。
术语"药理学活性"是指这样描述的物质被测定具有影响医药参数 (例如，血压、血细胞计数、胆固醇水平)或疾病状态(例如，癌症、 自体免疫病症、痴呆)的活性。
术语"淀粉样P肽"、"A卩肽"或"淀粉样(3肽"是指与人类A卩A4蛋白
质[前体]中相应于序列中氨基酸672-714(氨基酸1-43 )的氨基酸序列(单
字母编码)DAEFRHDSG YEVHHQKLVF FAEDVGSNKG AIIGLMVGGV VIAT相
关的任何形式的肽。它还包括这个肽的任何较短的形式，例如1-38、
1_40和1-42，但不限于这些形式。此外，淀粉样|3肽具有几种天然存
在的形式。人类形式的淀粉样(3肽被称为Ap39、 AP40、 AP41、 A|342
和A(343。这些肽的序列和它们与APP前体的关系由Hardy等，TINS
20, 155-158 ( 1997 )的附图1说明了 。例如，A卩42具有序列: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His國His-Gln-Lys-Leu-Val-
Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-
Val-Val-Ile-Ala-OH 。 A卩41、 A卩40和A卩39不同于A卩42在分别从C-末 端省略了 Ala、 Ala-lle和Ala-Ile-Val。 A卩43不同于A卩42在于C-末
端的苏氨酸残基的存在。总的说来，淀粉样P肽是指涉及引起阿尔茨 海默氏病的斑块形成的肽形式。
术语"半衰期"被定义为从血浆中去除融合蛋白的一半初始浓度所 需的时间。本发明描迷了调节血浆中的半衰期的途径。这样的修饰可 以产生具有改进的药物动力学性质(例如，体内血清半衰期提高)的 融合蛋白。延长半衰期是指需要更长的时间来从血浆中除去或清除一 半的初始浓度的融合蛋白。药物或化学化合物的半衰期是本领域明确定义的和已知的。
术语"连接"是指两个或更多个部分之间共价的或可逆的连接。共 价连接可以是例如肽键、二硫键、碳-碳偶联或任何类型的基于原子之 间的共价连接的连接。可逆的连接可以是例如生物素-链霉抗生物素蛋 白、抗体-抗原或被分类为本领域已知的可逆连接的连接。例如，当融 合蛋白的蛋白质部分和调节物部分以重组形式从同一质粒产生时，直
接获得共价连接，因而连接是在DNA水平上设计的。
术语"共价连接"的是指之间共有电子的两个原子之间的化学连 接。共价连接的键的实例有肽键、二疏鍵、碳-碳偶联。融合蛋白可以 通过多肽键连接在一起，其中连接可以在产生融合蛋白时核糖体上的 翻译加工期间实现。其他类型的共价连接的成分可以用PEG化试剂修 饰，所述PEG化试剂共价连接到蛋白质的氨基残基(例如，赖氨酸) 上。例如，化学偶联反应可以是酰化或将两个成分连接成融合蛋白的 其他适合的偶联反应。共价连接也可以是指调节物与蛋白质部分连接 在一起的两个位点处接头的连接。
术语"切割位点"是指肽序列中可以被蛋白质或酶切割的特定位置 /位点。切割通常通过连接两个氨基酸的肽键的水解作用产生。切割也 可以利用单一的或组合的蛋白质或酶在相同肽的多个位点产生。切割
位点也可以是肽键以外的其他位点。本发明详细描述了淀粉样P肽的 切割。
术语"结合结构域"是指以治疗相关的亲和力结合淀粉样p肽的分 子。这些分子以大于或等于约106、 107、 108、 109或101Q M"的结合 亲和力结合淀粉样P肽。典型的结合结构域是，但不限于，抗体(例 如，Fab、 scFv、单结构域，都包括CDR区域)、本发明中和文献中 描述的支架蛋白、以及合成产生的具有对淀粉样|3肽的亲和力的分子。
术语"蛋白酶"是作用于肽键的水解作用的任何蛋白质分子。它包 括天然存在的蛋白水解酶，以及通过定点或随机诱变或任何其他蛋白 质工程方法获得的其变体，蛋白水解酶的任何片段，或包含前述蛋白 质之一的任何分子复合物或融合蛋白。蛋白酶可以是丝氨酸、半胱氨 酸、天冬氨酸或金属蛋白酶。
术语"底物"或"肽底物"是指任何氨基酸组成、序列或长度、含有 可被蛋白酶催化水解的肽键的任何肽、寡肽或蛋白质分子。被水解的
16肽键称为"切割位点"。底物内位置的编号根据Schlechter & Berger (Biochem. Biophys. Res. Commun. 27 (1967 ) 157-162)介绍的系统 进行。邻近切割位点的N-末端的氨基酸残基被编号为Pl、 P2、 P3等 等，而邻近切割位点C-末端的残基被编号为Pl'、 P2'、 P3'，等等。本 发明的底物或肽底物是淀粉样(3肽。
术语"特异性"是指蛋白质或蛋白酶有选择地识别和水解某些肽底 物而其他保持不被切割的能力。特异性可以定性地和定量地表示。"定 性的特异性"是指在肽底物的某些位置处蛋白酶接受的氨基酸残基的 种类。仅接受所有可能的肽底物的小部分的蛋白酶具有"高特异性"。 接受几乎任何肽底物的蛋白酶具有"低特异性"。具有非常低特异性的 蛋白酶还被称为"非特异性蛋白酶"。
术语"演化的(evolved)蛋白酶"描述了利用随机PCR、 DNA改 组或在DNA/RNA水平上产生多样性的其他类型的方法获得的任何蛋 白酶。描述这些方法的文献例如D,A. Drummond, B.L. Iverson， G. Georgiou and F.H. Arnold, Journal of Molecular Biology 350: 806—816 (2005 )和S. McQ and D.S， Tawfik， Biochemistry 44: 5444-5452 (2005 )。在产生的多样性之中进行筛选和选择的各种方法也在文献 中描述了 (例如，Directed Enzyme Evolution: Screening and Selection Methods ( Methods in Molecular Biology ) Editors: Frances H Arnold and George Georgiou. Volume 230， 2003及其参考文献)。各种策略可以 用于选择性质如提高的稳定性、提高的活性、改善的选择性、以及被 已知和未知抑制物降低的抑制作用。
术语"改进的蛋白酶"描述了如果需要、具有更高催化活性的任何 蛋白酶变体。然而，在某些情况下更低的催化活性可能是优选的。改 进的蛋白酶还可以指与原始蛋白酶相比，相较于另一种底物，更有效 地切割某种底物的变体。改进的是指更优选的性质，例如催化活性和 /或选择性，来获得更优化的药物化合物。改进的蛋白酶还可以指具有 在例如血浆(体内或体外或两者)中提高的稳定性的变体。改进的蛋 白酶还可以指具有在例如血浆(体内或体外或两者)中降低的失活的 变体。降低的失活可以通过降低蛋白酶的蛋白水解降解而完成，这是 由于改变的氨基酸序列较不易于被切割。降低的蛋白水解降解还可以 通过用例如PEG化和/或糖基化修饰蛋白质表面来保护蛋白质免于切割而完成。降低的失活还可以通过降低已知或未知抑制物的蛋白酶抑 制作用而完成。未知的血浆抑制物的降低的抑制作用可以通过直接筛 选具有在血浆中蛋白酶活性的抑制作用降低的变体而完成。
术语"人类中性溶酶"是指任何天然形式的人类中性溶酶。这包括 人类群体中天然存在的所有剪接和多态性变体。本发明中描述了人类
中性溶酶的许多形式(SEQIDNO: l到4)。该术语还包括人类中性 溶酶的片段或延长的变体，以及人类中性溶酶的改进的变体，如"改 进的蛋白酶"中所描述的。
术语"支架蛋白质"描述了结合淀粉样(3肽的任何蛋白质。支架蛋 白质的实例有淀粉酶抑肽(tendamistat) 、 affibody、 anticalin和锚蛋 白(ankyrin)。这些支架蛋白质一般被设计并基于刚性的核心结构， 以及可以被随机化用于结合物的鉴定的部分、环、表面或腔。这些支
架蛋白质是文献中很好地描述的。
本发明表明了使用优化的重组Ap降解酶通过降低A(3的脑水平抑 制淀粉样斑块形成的可能性。结果，淀粉样斑块相关的星形胶质增生 也将被降低。
在本发明的一个方面，治疗化合物是完全人类来源的。融合蛋白 全部由人类蛋白质组成，其利用具有最低可能的免疫原性活性的接头 来连接在一起。
相对于结合分子如抗体，利用降解酶的优点是
与结合方法相比，使用淀粉样|3肽的酶的降解将直接除 去毒性效应，结合方法中淀粉样p肽的浓度可能潜在地提高，如 果与淀粉样卩肽复合的结合分子没有被足够快速地清除。如果淀 粉样P肽浓度在外周提高这可能是特别有害的，。
淀粉样P肽的催化降解将比结合更有效地除去肽。仅仅 催化量的降解酶是除去足够淀粉样P肽所必需的，而结合分子如 抗体为了治疗效果需要化学计量的量。这将对治疗处理所需的量 有很大影响。
如果结合分子是抗体并且穿越BBB容许结合斑块中的淀 粉样P肽，有害的潜在免疫学反应是有可能的。另一方面，催化 性的融合蛋白将不结合斑块和利用Fc反应性，而仅仅降低淀粉 样f3肽的游离浓度。因而，催化酶将仅降解淀粉样P肽的游离库。结合试剂如抗体可能潜在地进入CNS，并通过Fc活性溶解斑块。 如果大量的淀粉样p肽被释放到斑块的附近这可能是不利的，并 且它们对细胞是有毒的。
在A卩分解代谢中的一种重要的酶是中性溶酶，也称为中性内肽 酶画24.11或NEP。 Iwata等人(Nature Medicine, 6: 143-149， 2000) 显示了， APM2肽通过由生物化学分析相似或相同于中性溶酶的NEP 介导的有限的蛋白水解作用经历完全的降解。 一致地，NEP抑制物输
注引起了脑中内源A(342的生物化学的和病理学的沉积。发现的是，这
种NEP催化的蛋白水解作用因而限制了 AP42分解代谢的速率。
NEP是涉及几种生物学活性肽包括脑啡肽、速激肽、舒緩激肽、 内皮素和心房钠尿肽的灭活的94kD， 二型膜结合Zn金属肽酶。NEP 存在于CNS的肽能神经元中，它在脑中的表达以细胞特异性的方式 被调节(Roques B. P.等，尸/mrwflco/. / ev, 45， 87-146， 1993; Lu B.等， ￡^/7, A/e《181， 2271-2275， 1995; Lu B,等，^"". Mr.780, 156-163， 1996 )。虽然2型NEP转录产物不存在于CNS中，1型和 3型转录产物分别定位于神经元中和胼胝体的少突胶质细胞中(Li C. 等，丄5/o/. CTiew. 270， 5723-5728， 1995 )。蛋白酶和内肽酶的中性 溶酶家族包括NEP的结构上或功能上同源的成员，例如近来描述的 NEP II基因和它的同种型(Ouimet T.等，肌oc/iew. 'o; ^s. Co画w". 271:565-570， 2000),其以与NEP互补的模式在CNS中表 达。这个家族的另一成员是NL-1 (中性溶酶样1 )， 一种被NEP抑 制物膦酰二肽有效地抑制的可溶蛋白质(GhaddarG.等，丄 347: 419-429， 2000)。
还已经描述了已知分解代谢AP的其他酶。锌金属肽酶胰岛素降 解酶(IDE, EC. 3.4.22.11 )将A(3mo和ApM2切割成看起来无害的产 物。IDE是真正的肽酶；它不水解蛋白质。该酶在体外切割有限数量 的肽，包括胰岛素和胰岛素相关肽、卩内啡肽和A卩肽。IDE被暗示是 生理学的Ap代谢酶之一 (W. Q. Qui等(1998 ) 5/o/. CViem. 273， 32730-32738 ) 。 Kurichkin和Goto ( I. V. Kurochkin and S. Gato ( 1994 ) 345， 33-37 )首先报道了胰岛素降解酶可以水解A(3mo。这 个发现在两个独立的研究中被证实(W. Q. Qui等(1998 U S/o/. C/ie/n. 273, 32730-32738; and J， R. McDermott and A. M. Gibson ( 1997 )A^wrocAew./ 仏22， 49-56)。此外， 一种近来被鉴定为A卩降解酶的 金属蛋白酶24.15 ( Yamin R.等，/ CTiew. 274, 18777-18784， 1999 )也不响应于A卩注射而改变。血管紧张肽转化酶(ACE)， 一 种不相关的神经元Zn金属内肽酶也被提及作为可能的A(3肽降解酶 (Barnes N. M.等，尸Aarm"co/. 200， 289-292,1991; Alvarez R. 等,《/. jVewro/. jVewroi^rg.尸57c/j/a^y 67, 733-736， 1999; Amouyel P.等， A^Uca乂 <SW. 903， 437-441， 2000),具有对A(3的未知的亲和 力(McDermott J. R. and Gibson A. M,， A^歸cA亂22， 49-56, 1997 )。组织蛋白酶B ( CatB )也显示了降解A卩肽(Neuron. 2006 Sep 21; 51 ( 6 ) :703-14 )。
来自中性溶酶的使用的序列可以是蛋白质的细胞外部分。细胞外 的部分被定义为被确定为膜区域之外的中性溶酶的部分。本发明还包 括中性溶酶的完整序列作为淀粉样|3肽降解成分的用途。本发明还包 括中性溶酶的较小的片段，只要相对于淀粉样(3肽的催化活性被保留。 本发明还包括中性溶酶的任何多态性变体和剪接变体。本发明还包括 中性溶酶的任何改进的变体。
本发明描述了新的和可选择的策略来在它们形成淀粉样斑块之 前水解A(3肽，或至少防止现有斑块的进一步发展。还可能的是通过 水解与游离A(3肽平衡的任何斑块衍生的AP肽来除去现有的斑块。
本发明的另一个实施方式涉及由以高亲和力结合淀粉样P肽的部 分组成的分子。这种亲和力在结合结合亲和力上低于微摩尔。对淀粉 样P肽的结合亲和力优选的在结合亲和力上是处在纳摩尔的。涉及与
一个或更
多个位点切割淀粉样|3肽的活性成分。将都识别淀粉样p肽的催化活 性部分与结合部分组合在一起的原因是，结合部分结合淀粉样(3肽， 从而提高局部浓度(结合部分和催化部分)，结合到淀粉样p肽的解 离的形式。某一些特异性地结合解离的形式而不结合聚集的形式。某 一些结合聚集和解离的形式。某些这样的抗体结合淀粉样(3肽的天然 存在的A(3短形式(即，共价地或以其他方式连接在一起)以被活性 部分切割，所述活性部分由于双官能分子中工程化的连接而在局部附
过有或者没有接头成分的血浆半衰期调节物成分来介导。、 '在本发明的某些实施方式中，治疗试剂包括特异性结合淀粉样P 肽或淀粉样斑块的其他成分的融合蛋白。这样的化合物可以是单克隆
的或多克隆的或任何其他淀粉样(3肽结合试剂的部分。这些化合物以 大于或等于约106、 107、 108、 109或101Q M"的结合亲和力结合淀粉 样(3肽。这些结合成分优选的与淀粉样卩肽降解成分连接。
本发明的一个方面涉及抗体的"Fc"结构域与融合蛋白中淀粉样|3 肽降解成分的组合。抗体包含两个功能上独立的部分，称为"Fab"的可 变区，其结合抗原，称为"Fc"的恒定区，其涉及效应物功能如补体激 活和吞噬细胞的攻击。Fc具有长血清半衰期，而Fab是短寿的(C叩on 等(1989) , Nature 337: 525-31 )。当与治疗蛋白质构建在一起时， Fc结构域可以提供更长的半衰期，或包括这些功能如Fc受体结合、 蛋白A结合、补体固定和可能甚至胎盘的转移。
根据本发明的优选的分子是Fc连接的淀粉样p肽降解蛋白质， 例如NEP-相关蛋白质。
在标题为"Modified Peptides as Therapeutic Agents"( WO99/25044 ) 的公开文献中详细讨论了通过与抗体的Fc结构域融合的蛋白质治疗 试剂的有用的修饰。该公开文献讨论了连接到"栽体"例如PEG、葡聚 糖或Fc结构域。已经在文献中描述了连接到Fc结构域的C-末端部分 作为可能的方法(Protein Eng. 1998 11:495-500)。这容许融合蛋白的 蛋白质部分上N-末端连接。本发明描述了利用这种策略获得具有体内 效力的优化性质的融合蛋白的这种方法和有益效果。
IgG分子与特异于抗体的IgG类的三类Fc受体(FcR)相互作用， 即，FcyRI、 FcyRII和Fc丫RIII。在优选的实施方式中，融合蛋白的免 疫球蛋白(Ig)成分具有IgG的恒定区的至少一部分，其具有对FcyRI、 FcyRII或FcyRIII的至少一种的低结合亲和力。在本发明的一个方面， Fc受体的融合蛋白的结合亲和力通过使用重链同种型作为融合物配 偶体来降低，所述重链同种型具有对细胞上Fc受体的降低的结合亲 和力。例如，人类IgGl和IgG3已经被报道以高亲和力结合FcRyI， 而IgG4的结合性是十分之一，IgG2根本不结合。对于IgG与Fc受体 的结合的重要序列已经被报道位于CH2结构域中。因而，在优选的实 施方式中，具有增强的体内循环半衰期的、基于抗体的融合蛋白通过 将IgG2或IgG4的至少CH2结构域连接到第二非免疫球蛋白蛋白质来获得。例如，在四种已知的IgG同种型中，IgGl(Cyl )和IgG3(Cy3) 已知以高亲和力结合FcRyI，而IgG4 ( Cy4 )的结合亲和力是十分之 一，IgG2 (Cy2)不结合FcR丫I。
在一个实施方式中，融合蛋白的Aj3肽降解成分是酶。术语"酶" 在此使用来描述蛋白质、其类似物、和其片段，其作为蛋白酶或肽酶 是有活性的。优选的，酶包括丝氨酸、天冬氨酸、金属和半胱氨酸蛋 白酶。优选的，本发明的融合蛋白显示酶的生物学活性。
在另一个实施方式中，免疫球蛋白结构域选自IgG的Fc结构域、 IgG的重链以及IgG的轻链。在另一个实施方式中，融合蛋白中抗体 的恒定区将是人类来源的，属于来自免疫球蛋白的IgG类的免疫球蛋 白家族，特别是来自类IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4，优选的来自类IgG2 或IgG4。做为选择还可能的是使用属于来自其他哺乳动物的IgG类的 免疫球蛋白的恒定区，特别是来自啮齿动物或灵长类；然而还可能的 是，根椐本发明的，使用免疫球蛋白类IgD、 IgM、 IgA或IgE的恒定 区。 一般地，存在于根据本发明的构建体中的抗体片段将包含Fc结 构域CH3或其部分，以及Fc结构域CH2的至少一个部分片段。做为 选择，还可能的是设想根椐本发明的融合构建体，其含有CH3结构域 和绞链区作为成分(A)用于二聚化。
然而，还可能的是使用在天然状态下发现的免疫球蛋白序列的衍 生物，特别是含有至少一个替换、缺失和/或插入的那些变体(在此组 合到术语"变体"下)。一般地，这样的变体具有与天然序列的至少90%、 优选的至少95%、更优选的至少98%的序列同一性。在这种情境中特 别优选的变体是替换变体，其一般含有与相应的天然序列相比低于10 个、优选的低于5个、非常特别优选的低于3个的替换。注意的是以 下的替换可能性是优选的用Met、 Val、 Leu、 Ile、 Phe、 His或Tyr 替换Trp,或反之亦然；用Ser、 Thr、 Gly、 Val、 lie或Leu替换Ala， 或反之亦然；用Gln、 Asp或Asn替换Glu，或反之亦然；用Glu、 Gln 或Asn替换Asp，或反之亦然；用Lys替换Arg，或反之亦然；用Thr、 Ala、 Val或Cys替换Ser,或反之亦然；用His、 Phe或Trp替换Tyr, 或反之亦然；用其他19个天然氨基酸之一替换Gly或Pro,或反之亦 然。
可溶的受体-IgG融合蛋白是常见的免疫学试剂，它们的构建方法
22是本领域已知的(参见，例如美国专利NO. 5，225，538 )。功能性淀粉 样卩肽降解结构域可以融合到来自免疫球蛋白类或亚类的免疫球蛋白 Fc结构域。属于不同Ig类或亚类的抗体的Fc结构域可以活化各种二 级效应物功能。当Fc结构域被相关的Fc受体结合时发生活化。二级 效应物功能包括活化补体系统、跨越胎盘、以及结合各种微生物蛋白 质的能力。不同类和亚类的免疫球蛋白的性质在Roitt等， Immunology, p. 4.8 ( Mosby-Year Book Europe Ltd., 3d ed. 1993 )中 描述了。抗原结合IgGl、 IgG3和IgM抗体的Fc结构域可以活化补体 酶级联。IgG2的Fc结构域看起来是较低效果的，IgG4、 IgA、 IgD和 IgE的Fc结构域在活化补体方面无效。因而人们可以根据它们相关的 二级效应物功能对于特定的免疫反应或用所述淀粉样|3肽降解-Fc融 合蛋白治疗的疾病是否是希望的来选择Fc结构域。如果损害或杀伤 目标细胞是有益的，人们可以选择特别活性的Fc结构域UgGl )来 制造淀粉样p肽降解-Fc融合蛋白。做为选择，如果希望的是产生不 触发补体系统的淀粉样(3肽降解-Fc融合物，可以选择无活性的IgG4 Fc结构域。本发明描述了融合蛋白，其具有与Fc部分而不是直接结 合成分连接的催化成分。这意味着来自Fc的效果和活性将是有限的， 因为许多Fc效应是通过结合介导的。例如，补体激活取决于结合和 网络的形成。
免疫球蛋白片段，根椐本发明的融合物构建体的C-末端一般地、 而不是必然地含有催化和调节部分之间的过渡区域，所述过渡区域可 以再含有接头序列，该接头序列优选的是肽序列。这种肽序列可以具
有1直到70个氨基酸之间的长度，在合适时甚至更多的氨基酸，优 选的10到50个氨基酸，特别优逸的12到30个氨基酸之间。过渡序 列的接头区域可以侧翼是另外的短肽序列，其可以例如，相应于DNA 限制性切割位点。分子生物学的熟练技术人员熟悉的任何限制性切割 位点可以用于这种连接中。适合的接头序列优选的是人工序列，其含 有高数量的脯氨酸残基(例如，在接头区域中每两个位置上)，除此 之外，优选的具有总体上的亲水性特征。由至少30%脯氨酸残基组成 的接头序列是优选的。亲水性特性可以优选的通过具有正电荷的至少 一种氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸，或具有负电荷的例如天冬氨酸或 谷氨酸来实现。总的说来，因而接头区域还优选地含有高数量的甘氨酸和/或脯氨酸残基，以赋予所述接头区域需要的柔性和/或刚性。
然而，天然的序列，例如位于细胞外、但直接作用细胞膜，即，
在细胞膜之前的，属于NEP家族的配体的那些片段，也适合于用作接 头，当适当时也在天然片段的替换、缺失或插入之后。这些片段优选 的是细胞外跨膜区域之后的50 AA，或这前50AA的子片段。然而， 偏爱的是在于与相应的天然人类序列具有至少85%序列同 一性的这 些片段，特别偏爱的是至少95%序列同一性，特别偏爱的是至少99% 序列同 一 性，以限制在根椐本发明的融合蛋白中的这些接头区域的免 疫原性，并且不引发任何先天的体液防御反应。在本发明的情境中， 接头区域应当优选的不具有任何免疫原性。
然而，作为对通过酰胺样鍵连接到淀粉样P肽降解成分和血浆半 衰期调节物成分的肽序列的替代，还可能的是使用具有非肽或伪肽 (pseudopeptide )特征的或基于非共价键的化合物。就此而论可以提 及的实例有，特别是，N-羟基琥珀酰亚胺酯和异双功能接头，例如 >1-琥珀酰亚胺基-3- ( 2-吡咬二疏代)丙酸酯(SPDP )或类似的交联剂。
调节血浆半衰期的其他途径是使用PEG化或提高分子量的其他 类型的修饰，例如糖基化。
如上所述，也可以使用聚合物调节物。附着作为调节物有用的化 学部分的各种方式是当前可获得的，参见，例如，标题"N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods"的专利申请 W096/11953,通过引用完全合并在此。该PCT公开文献公开了水溶 性聚合物对蛋白质的N-末端的选择性附着，等等。
优选的聚合物调节物是聚乙二醇(PEG) 。 PEG基团可以是任何 方便的分子量，可以是线型或分支的。PEG的平均分子量优选的从约 2千道尔顿("kD")到约100 kDa，更优选的从约5 kDa到约50kDa， 最优选的从约5 kDa到约10 kDa。 PEG基团一般经由通过PEG部分 上的反应基团(例如，醛、氨基、硫醇或酯基)与化合物上的反应基 团(例如，醛、氨基或酯基)的酰化或还原性烷基化附着于本发明的 化合物。
蛋白质的PEG化的有用的策略由通过在溶液中形成共轭键来组 合蛋白质和PEG部分组成，其各自具有针对对方相互反应性的特定官 能度。蛋白质可以用常规的重组表达技术制备。蛋白质是在特定位点用合适的官能团"预先活化的"。在与PEG部分反应之前，纯化前体并 完全表征。蛋白质与PEG的连接通常在水相中发生，可以通过反相分 析HPLC容易地监测。PEG化的蛋白质可以通过制备型HPLC容易地 纯化，通过分析性HPLC、氨基酸分析和激光解吸质语法来表征。
多糖聚合物是可以用于蛋白质修饰的另 一种水溶性聚合物。葡聚 糖是多糖聚合物，由主要通过al-6键连接的葡萄糖的各个亚基组成。 葡聚糖本身可以以多种分子量范围获得，在约1 kD到约70 kD的分 子量中是易于获得的。作为单独的调节物或与其他调节物(例如，Fc) 组合，葡聚糖是本发明中使用的适合的水溶性聚合物，参见，例如 WO 96/1 1953和WO 96/05309。已经报道了共轭到治疗性或诊断性免 疫球蛋白的葡聚糖的用途；参见，例如，欧洲专利公开EP 0 315 456, 通过引用合并在此。约l kD到约20 kD的葡聚糖是优选的，此时葡 聚糖用作根据本发明的栽体。
碳水化物(低聚糖)基团可以方便地附着到蛋白质中已知为糖基 化位点的位点。 一般地，O-连接的低聚糖被附着于丝氨酸(Ser)或苏 氨酸(Thr)残基，而N-连接的低聚糖附着于天冬酰胺(Asn)残基， 此时它们是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除脯氨酸外 的任何氨基酸。X优选的是除脯氨酸外的19种天然存在的氨基酸之 一 。N-连接的和O-连接的低聚糖的结构和每种类型中发现的糖残基是 不同的。通常在两种中都发现的 一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(称 为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接的和O-连接的低聚糖的末端残基， 凭借它的负电荷，可以为糖基化的化合物赋予酸性性质。这样的位点 可以掺入本发明的化合物的接头中，优选的在多肽化合物的重组生产 期间被细胞糖基化(例如，在哺乳动物细胞如CHO、 BHK、 COS中)。 然而，这些位点可以进一步通过本领域已知的合成或半合成操作被糖 基化。适合于糖基化的氨基酸可以掺入调节物和蛋白质部分中的特定 位点。用于工程化这些特定氨基酸的优选的技术是定点诱变或可比较 的方法。其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏 氨酰残基的羟基基团的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，赖氨酸、精氨 酸和组氨酸侧链的a-氨基的曱基化。Creighton, /Vo,ei7rr 5Vrw"w" 飾/ecw/e尸，eW^ ( W. H. Freeman & Co., San Francisco ) ， pp. 79-86 (1983 )。因而，淀粉样p肽降解成分中的糖基化位点可以被工程化。例如，优选地在中性溶酶结构的表面上的残基被修饰以容许糖基化。
中性溶酶的3D结构是已知的，可以用于选择适合的氨基酸替换，用 于导入糖基化和PEG化位点。糖基化位点利用例如Asn-X-Ser/Thr序 列导入。对于PEG化，适合的表面暴露的氨基酸例如被替换为胱氨酸 残基，用于PEG化成分的特异性和有效偶联。
本发明的化合物也可以在DNA水平被改变。化合物的任何部分 的DNA序列可以改变成与选定宿主细胞更相容的密码子。对于优选 的宿主细胞大肠杆菌(E.co//)，优化的密码子是本领域已知的。密码 子可以被替换以消除限制性位点，或包括沉默的限制性位点，其可以 帮助DNA在选定的宿主细胞中的加工。栽体、接头和肽DNA序列可 以被修饰以包括任何上述序列改变。
接头任何"接头"基团是可选的。当存在时，它的化学结构不是 关键的，因为它主要充当间隔区。接头优选的由通过肽键连接在一起 的氨基酸组成。因而，在优选的实施方式中，接头由通过肽键连接的 1到20个氨基酸组成，其中所述氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。 这些氨基酸的某些可以被糖基化，这是本领域技术人员很好地理解 的。在更优选的实施方式中，所述1到20个氨基酸选自甘氨酸、丙 氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。再更优选的，接头大 部分由空间上无阻碍的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸组成。因而，优选 的接头是聚甘氨酸(特别是(Gly) 4、 (Giy) 5)、聚(Gly-Ala )和 聚丙氨基酸。
蛋白酶的定量的特异性在大的范围上变动。存在着非常非特异性 的已知蛋白酶，例如木瓜蛋白酶，其切割含有苯丙氨酸、缬氨酸或亮 氨酸残基的所有多肽，或胰蛋白酶，其切割含有精氨酸或赖氨酸残基 的所有多肽。另一方面，存在着已知的高度特异性蛋白酶，例如组织 型纤溶酶原激活物(t-PA),其仅在单个特异性序列处切割纤溶酶原。 具有高度底物特异性的蛋白酶在活生物体中蛋白质功能的调节方面 起到重要作用。例如，多肽底物的特异性切割活化了前体蛋白质或钝 化活性的蛋白质或酶，从而调节它们的功能。具有高度底物特异性的 几种蛋白酶被用于医药应用中。通过特异性多肽底物的切割活化或钝 化的药物的实例有，t-PA在急性心肌梗塞中的应用，其活化纤溶酶原 来溶解纤维蛋白凝块，或安克洛酶(Ancrod)在中风中的应用，其钝
26化纤维蛋白原，从而降低血液粘度并增强它的输送能力。t-PA是具有 人类血液调节中的必需活性的人类蛋白酶，安克洛酶是非人类蛋白 酶。它是从毒蛇红口蝮蛇(JgA^&odo" Wiof/oWow")分离的，包含蛇 毒的主要成分。因而，存在着几种具有治疗可用性的非人类蛋白酶。 然而，它们的鉴定通常是高度偶然的。通过施用药物治疗疾病一般基 于所述药物引发的分子机制，其活化或灭活患者身体中的特定蛋白质 功能，所述蛋白质是内源蛋白质或感染性微生物或病毒的蛋白质。虽 然化学药物对这些耙点的作用仍然难以理解或预测，蛋白质药物能够 特异性识别数百万其他蛋白质中的这些目标蛋白质。具有识别其他蛋
白质的固有可能性的蛋白质的突出的实例是抗体、受体和蛋白酶。虽 然存在着巨大数量的潜在目标蛋白质，当今仅非常少数的蛋白酶可用
于指向这些目标蛋白质。由于它们的蛋白质分解活性，蛋白酶特别适 合于蛋白质或肽目标的灭活。当仅考虑人类蛋白质时，潜在目标蛋白 质的数量仍是巨大的。估计人类基因组包含30,000到100，000个基因， 每一个编码不同的蛋白质。这些蛋白质或肽的许多涉及人类疾病，因 而是潜在的药物靶点。不大可能的是通过筛选天然分离物来找到具有 特定的定性特异性的蛋白酶。因而，需要优化已知蛋白酶或其它支架 蛋白质包括催化性抗体的催化选择性。
用于已知特异性的蛋白酶的选择系统是本领域已知的，例如，来 自Smith等，Proc. Natl. Acad. SciUSA， Vol. 88 ( 1991 )。作为举例， 所述系统包含酵母转录因子GAL4作为可选择标记，插入到GAL4中 的预定的和可切割的目标序列，以及TEV蛋白酶。切割将DNA结合 结构域从转录活化结构域上分离，因而使得转录因子无活性。产生的 细胞代谢半乳糖的表型失能可以通过量热分析或通过在自杀底物2-脱氧半乳糖上选择来检测。
进一步的，选择可以通过使用具有修饰的肽底物来进行，所述修 饰例如基于如ACC的基团的焚光部分，由Harris等人早先描述(US 2002/022243 )。
可以使用相同的或类似的方法来鉴定或产生本发明中描述的有 效的淀粉样(3肽降解成分。工程化这种淀粉样P肽降解成分的出发点 可以是具有对淀粉样P肽的某些活性或根本没有活性的酶。其他成分 可以是支架蛋白质，其中特异性区域被随机化来具有针对淀粉样卩肽的活性。在文献中描述了各种支架蛋白质，其中支架结构的一个部分 是核心结构，其在相对固定的位置具有随机化的部分来产生结合或活
性位点。具有针对淀粉样(3肽的某些活性的酶可以是被描述降解淀粉 样(3肽的天然的蛋白酶。例如，中性溶酶可以通过理论设计或更为随 机的方法被工程化来变得作为淀粉样|3肽降解成分更有效。
产生具有改变的序列特异性的蛋白水解酶的实验室技术是原理 上已知的。它们可以通过它们的表达和选择系统来分类。遗传选择是 指在生物体内产生蛋白酶或任何其他蛋白质，所述蛋白酶或任何其他 蛋白质能够切割前体蛋白质，其转而引起生产生物体的生长特性的改
性的^些。这种;i由Davis等人所报道(美国专利NO. 5258289)。 噬菌体系统的生产取决于噬菌体蛋白质的切割，其在存在蛋白水解 酶，或能够切割噬菌体蛋白质的抗体的情况下被活化。选定的蛋白水 解酶、支架或抗体将具有切割氨基酸序列的能力，用于噬菌体生产的 活化。
解酶的系统。Iverson等人(WO 98/49286 )描述了用于在细胞的表面 上展示的膜结合蛋白酶的表达系统。实验设计的关键元素是催化反应 必须在细胞表面进行，即，底物和产物必须与在表面上表达酶的细菌 保持相连。选择系统的另一个实例是利用在细胞表面表达活性蛋白质 并且分选含有具有改善的性质的变体的细胞的FACS分选 (Varadarajan等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 102, 6855( 2005 ))。 它们显示了对蛋白酶切割位点的特异性方面三百万倍的改变。
使用自分泌性蛋白酶产生具有改变的序列特异性的蛋白水解酶 的系统也是已知的。Duff等人(WO 98/11237 )描述了自分泌蛋白酶 的表达系统。实验设计的关键元素是通过膜结合前体分子的自我蛋白 水解加工，催化反应作用于蛋白酶本身，来从细胞膜将成熟蛋白酶释 放到细胞外环境中。
Broad等人(WO 99/11801 )公开了适合于改变蛋白酶的特异性的 异源细胞系统。所述系统包含转录因子前体，其中所述转录因子与膜 锚定结构域经由蛋白酶切割位点连接。在蛋白酶切割位点处通过蛋白 酶的切割释放所述转录因子，其转而启动相应启动子控制下的目标基因表达。改变特异性的实验设计由蛋白酶切割位点插入修饰的序列， 以及使蛋白酶经历诱变组成。
根据本发明，任何蛋白质或肽可以直接使用或作为出发点来产生 适合的淀粉样P肽降解成分。例如，根据本发明，任何蛋白酶可以用 作第一蛋白酶。优选的，使用人类来源的任何蛋白质或肽。如果使用 通常存在于人体中的天然蛋白质或肽，最小可能性的改变是优选的。 在某些方法中，具有不同的结合特异性和/或降解活性的两种或更多融 合蛋白同时地施用，在这种情况下，施用的每种融合蛋白的剂量落入 所标明的范围内。融合蛋白通常在多个时机施用。单次给药之间的间 隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不规 则的，通过测量患者的血浆中融合蛋白的血液水平来指示。在某些方
法中，剂量被调节来实现1-1000 ng/ml的血浆融合蛋白浓度，在某些 方法中25-300 pg/ml。同样在某些方法中，剂量被调节以实现 l-1000ng/ml的血浆融合蛋白浓度，在某些方法中25-300 ng/ml。做为 选择，融合蛋白可以施用作为持续释放制剂，在这种情况下需要较低 频率的施用。剂量和频率取决于患者中融合蛋白的半衰期而变化。一 般地，具有Fc部分的融合蛋白显示了长半衰期。施用的剂量和频率 可以取决于治疗是预防性的还是治疗性的来变化。在预防性的应用 中，在长期的时间段上以相对低频率的间隔施用相对低的剂量。某些 患者在他们生命的剩余时间持续接受治疗。在治疗应用中，相对短间 隔的相对高剂量有时是需要的，直到疾病的进展被降低或终止，优选 的直到患者显示了疾病的症状的部分或完全改善。此后，本专利可以 施用预防性的方案。预计的是，催化活性淀粉样p肽降解融合蛋白可 以以比结合试剂例如抗体更低的剂量施用。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际的剂量水平可以变化， 以获得活性成分的量，所述量对实现特定患者、组合物和施用方式的 希望的治疗反应是有效的，而对于患者没有毒性。选定的剂量水平将 取决于多种药物动力学因素，包括采用的本发明的特定组合物或其 酯，盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、采用的特定化合物的排 出速率、治疗的持续时间、与采用的特定组合物联合使用的其他药物、 化合物和/或材料、要治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、 一般健 康情况和先前的病史，以及医药领域中公知的类似因素。引用完全合并在此，它们显 示了本发明之时的本领域的状态，和/或提供了本发明的描述和实现。 公开文献是指任何科学或专利的公开文献，或以任何媒介形式可获得 的任何其他信息，包括所有记录的、电子的或打印的形式。以下参考
文献通过引用完全合并在此Ausubel，等，ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y， ( 1987-2001 ); Sambrook, 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y. ( 1989 ) ; Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. ( 1989); Colligan，等， eds,， Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001 ); Colligan等，Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY， N.Y., ( 1997-2001 )。
本发明的一个方面是修饰天然的野生型蛋白质以在降解淀粉样P 肽方面变得更有选择性的可能性。定点诱变可以用于在野生型序列中 引入/替换氨基酸。 一种方法是通过研究降解酶的活性位点来运用合理 的设计。将潜在地改变选择性分布(与其他肽/蛋白质相比淀粉样p 肽的降解)的氨基酸可以用其他氨基酸替换，可以在本领域已知的切 割分析中测试新的变体。优选的，与其他相关肽相比，具有对淀粉样 (3肽的更高催化降解活性的变体是有用的。其他相关肽包括但不限于 脑啡肽、神经肽Y、 P物质、somastatin和胆嚢收缩素。
中性溶酶的三维结构是已知的(Oefner等(2000) J. Mol. Biol. 296:341-9; Sahli等(2005 ) Helv.Chim.Acta. 88:731 )。这种结构可 以指导在结构中引入改变的途径，以及哪一部分是最有效来改变的， 以产生用于筛选或选择的库。中性溶酶的活性部位非常深地包埋在结 构中，表明该酶偏爱小的底物，如具有低于约5000 Da分子量的肽片 段。活性位点残基包括N542、 H583、 H587、 E646和R717。靠近活 性位点的氨基酸残基还包括V580、 F563、 F564、 M579、 F716、 1718、 F106、 1558、 F563、 F579、 V580、 H583、 V692、 W693和A543 ( Voisin 等(2004 ) JBC 279:46172-81 )。这些和其他残基可以通过研究三维 结构的理论设计来改变，或在各种库中随机地改变来获得中性溶酶的 改进的变体。
本发明的目的是提供方法和材料，其适合于开发神经变性疾病的治疗以及这样的疾病中的治疗介入有用的化合物的鉴定。基于卩淀粉 样蛋白可以通过优化的酶介导的机制清除的发现，本发明致力于提供 这样的方法和材料，如在权利要求小节中列出的和下文中描述的。
本发明提供了预防和治疗神经变性病症的方法，包括向哺乳动 物的外周系统施用有效量的优化的酶活性化合物。特别是，所述酶活 性化合物是融合蛋白，其中一个部分具有酶活性，另一个部分调节血 浆中的半衰期。所述方法适合于预防和治疗脑淀粉样变性，例如阿尔 茨海默氏病。本发明还提供了不同的分析原理——生物化学的和特别 是细胞学的分析，用于测试优化的酶化合物，优选的筛选调节活性和 血浆半衰期的复数的化合物。在进一步的实施方式中，所述分析包括 在检测所述酶活性之前添加中性溶酶家族成员的已知的抑制物。适合
的抑制物是例如膦酰二肽、thiorphan、 spinorphin或上述物质的功能 衍生物。
一般意义上，根据本发明的分析体内和体外地测量血浆中的酶活 性和半衰期。
在另一个方面，本发明提供了产生药物的方法，包括步骤(i)鉴 定降解AP肽的化合物，优选的高度特异性并具有高Ap肽降解活性 的化合物，(ii)将这种A(3肽降解化合物连接到决定血浆中的半衰期 的调节化合物。
本发明的化合物可以利用重组DNA技术在转化的宿主细胞中产 生。为了这样做，制备编码融合蛋白的重组DNA分子。制备这种DNA 分子的方法是本领域公知的。例如，编码调节物和蛋白质的序列可以 利用适合的限制性内切酶从DNA上切下。做为选择，DNA分子可以 利用化学合成技术，例如氨基磷酸酯方法来合成。同样，可以使用这 些技术的组合。
本发明还包括能够在合适的宿主中表达调节物、蛋白质或融合 物的栽体。所述栽体包含编码所述调节物、蛋白质和/或融合物、可 操作地连接到合适的表达控制序列的DNA分子。在DNA分子被插入 栽体之前或之后产生这种可操作的连接的方法是公知的。表达控制 序列包括启动子、活化子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起 始信号、终止信号、cap信号、多腺苷酸化信号、和涉及转录或翻译 的控制的其他信号。产生的其上具有DNA分子的栽体被用于转化合适的宿主。这种 转化可以使用本领域公知的方法进行。在本发明的实践中可以使用大 量可用的和公知的宿主细胞的任一种。特定宿主的选择取决于本领域 公认的许多因素。这些包括，例如，与所选表达栽体的兼容性、DNA 分子编码的融合物的毒性、转化率、融合物回收的容易、表达特征、 生物安全性和成本。这些因素的平衡必须理解，不是所有的宿主可以 同样有效地表达特定的DNA序列。在这些一般准则之内，有用的微 生物宿主包括培养中的细菌(例如，大肠杆菌属(￡.co//^.))、酵 母(例如，酵母属(5^cc/mrow7cw ))和其他真菌、昆虫、植物、 哺乳动物(包括人类)细胞，或其他本领域已知的宿主。
然后，培养转化的宿主并纯化。宿主细胞可以在常规的发酵条件 下培养从而表达希望的化合物。这样的发酵条件是本领域公知的。最 后，通过本领域公知的方法从培养物纯化融合物。当使用Fc部分作 为调节物时， 一种优选的方法是使用蛋白A或类似的技术来纯化融合 蛋白。调节物、蛋白质和融合物也可以通过合成方法制成。例如，可 以使用固相合成技术。适合的技术是本领域公知的，包括在Merrifield
(1973 ) ， C7i线尸o(y/ e/7"fi^， pp. 335-61 ( Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield( 1963 )， /.叙C/im. Soc. 85: 2149; Davis等(1985 ), ^/oc/ em. /"A 10: 394-414; Stewart and Young ( 1969 ) ， <So"W尸A(^e S声/^/r，美国专利No. 3,941,763; Finn等(1976 ) ， 77ie /Vo/e/"s ( 3rd ed.) 2: 105-253;以及Erickson等(1976 ) ， /Vo&/"s
(3rd ed.) 2: 257-527中描述的那些。固相合成是制造单独的肽或蛋 白质的优选的技术，因为它是产生小肽或蛋白质的最有成本效率的方 法。
一般地，本发明的化合物具有药理学活性，其产自它们体内降解 淀粉样(3肽的能力。这些化合物的活性可以通过本领域已知的分析来 测量。对于Fc-Nep化合物，在此处的实施例小节进一步描述了体内 分析。
一般地，本发明还提供了利用本发明化合物的药物組合物的可能 性。这样的药物组合物可以是注射施用、或口服、肺部、鼻部、经皮 的或其他形式的施用。 一般地，本发明包括药物组合物，其包含有效 量的本发明的化合物和药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳
32化剂、佐剂和/或栽体。这样的组合物包括各种緩沖剂内容(例如，
Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH值和离子强度的稀释剂；添加剂例 如洗涤剂和增溶剂(例如，Tween80、聚山梨酯80)、抗氧化剂(例 如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(例如，Thimersol、苯曱醇) 和填充物质(例如，乳糖、甘露醇)；所迷材料掺入到聚合化合物如 聚乳酸、聚乙醇酸等等的颗粒制品中，或掺入脂质体中。也可以使用 透明质酸，这可能具有促进循环中的维持持续时间的效果。这种组合 物可以影响当前蛋白质和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率 和体内清除速率。参见，例^(口， Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. ( 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042 ) 1435-1712 页，通过引用将其合并在此。组合物可以以液态形式制备，或可以是 干粉，例如冻千形式。可植入的持续释放制剂也是期待的，经皮制剂 也是期待的。这些施用选择是本领域公知的。
治疗上述状况的方法中涉及的给药方案可以由主治医师确定，考 虑到改变药物作用的各种因素，例如，患者的年龄、状况、体重、性 别和膳食，任何感染的严重度，施用的时间和其他临床因素。 一般地， 每天的方案应当在每公斤体重O.卜IOOO微克本发明化合物的范围内， 优选的每公斤0.1-150微克。
本发明清楚地描述了淀粉样p降解蛋白质可以以特定方式修饰来 维持显著的降解活性并变得适合于体内使用。公开了支持本发明的实 验证据。
在某些实施方式中，本发明提供了治疗A卩相关病理的方法，例 如唐氏综合征(Downs syndrome )和P-淀粉样血管病，例如但不限于 脑淀粉样血管病、系统性淀粉样变性、遗传脑出血、与认知损伤相关 的病症，例如但不限于MCI ("中度认知损伤")、阿尔茨海默氏病、 失忆、与阿尔茨海默氏病相关的注意力缺陷症状、与疾病如阿尔茨海 默氏病相关的神经变性，或痴呆，包括混合的血管和变性起源的痴呆、 早老性痴呆、老年痴呆和与帕金森氏病相关的痴呆、渐进性的核上麻 痹或皮层基底变性，包括向哺乳动物(包括人类)施用治疗有效量根 据本发明的融合蛋白。
实施例在此通过以下非限制性的实施例进 一 步描述本发明实施例1
蛋白质结构域的描述
中性溶酶的细胞外结构域被定义为氨基酸51-749 (排除第一曱疏氨酸)(SEQIDNO:卜4 )。存在着两个多态性导致该结构域中鉴定的氨基酸差异，不同变体的氨基酸序列在SEQIDNO: 1-4中描述。
IDE(胰岛素降解酶)是1018个氨基酸长度的蛋白质(SEQ ID NO:5)。描述了 IDE的剪接变体和多态性变体。在一种剪接变体中，一个外显子被替换为同样大小的另一个外显子，其编码类似于"wt"外显子的肽序列(在SEQ ID NO: 6中描述)。这个变体已经被描述为在降解胰岛素和A|3方面较低效率。在描述的IDE基因中存在着几种多态性，其引起这个结构域中鉴定的氨基酸差异D947N、 E612K、 L298F和E408G (根据SEQ ID NO: 5的编号)。这些多态性的所有组合也是可能的。
ECE1 (内皮素转化酶1)的细胞外结构域(SEQ ID NO: 7)是681氨基酸长度的蛋白质，定义为全长的膜结合ECE1蛋白质的氨基酸90-770。 ECE1基因含有几种引起氨基酸差异的可能的多态性R665C、 W541R、 L494Q和T252L这些多态性的所有组合也是可能的。
中性溶酶、IDE和ECE1的细胞外结构域融合到人类IgG2 Fc结构域(包括绞链区)。信号序列(SEQIDNO: 8)被导入以允许蛋白质在表达期间分泌到培养基中。绞链区的序列在SEQIDNO: 9中显示，IgG2 Fc结构域在SEQ ID NO: 10中显示。具有相应于SEQ ID NO:1的人类中性溶酶变体、相应于SEQ IDNO:5的IDE以及相应于SEQID NO: 7的ECE1的完整融合蛋白(排除信号序列)在SEQ ID NO:H-13中描述。最终的融合蛋白(排除信号序列)具有预测分子量211kDa ( Fc-Nep作为二聚体)、294 kDa ( Fc-IDE作为二聚体)和206 kDa(Fc-ECEl作为二聚体)。
实施例2
构建编码融合蛋白Fc-中性溶酶的基因的^L明合成地产生融合到编码IgG2的Fc结构域的基因的、编码中性溶酶的细胞外结构域的基因(GeneArt)。包括信号序列的完整基因(编码Fc-中性溶酶)从GeneArt栽体(pCR-Script, pGA4或pUC-Kana )转移到Gateway供体栽体。Gateway供体栽体被用于将完整基因导入几个表达栽体中。通过使用Gateway系统，从供体栽体到表达栽体的转移可以通过利用重组而不是限制性内切酶来进行。所研究的哺乳动物表达栽体主要是pCEP4 、 pEAK10、 pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway适应的)。所有这些是基于CMV启动子(pCEP4 、 pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或 EF-la启动子(pEF5/FRT/V5-DEST )的标准哺乳动物表达栽体。在所有克隆步骤之后基因被测序来证实DNA序列。
实施例3
构建编码融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1的基因的说明合成地产生融合到编码IgG2的Fc结构域的基因的、编码酶IDE和ECE1的基因。完整的基因(编码包括信号序列的Fc-IDE和Fc-ECEl融合蛋白)从起始克隆栽体(pCR-Script、 pGA4或pUC-Kana )转移到Gateway供体栽体。Gateway供体栽体被用于将完整基因导入几个表达栽体中。所研究的哺乳动物表达栽体主要是pCEP4、 pEAK10、pEF5/FRT/V5-DEST和pcDNA5/FRT/TO ( Gateway适应的)。所有这些是基于CMV启动子(pCEP4、pEAK10和pcDNA5/FRT/TO )或EF-la启动子(pEF5/FRT/V5-DEST )的标准哺乳动物表达栽体。在所有克隆步骤之后基因被测序来证实DNA效率。
实施例4
中性溶酶的细胞外结构域和融合蛋白Fc-中性溶酶在HEK293细胞中的表达
蛋白质中性溶酶(仅细胞外结构域)和Fc-中性溶酶(Fc-Nep)在悬浮适应的哺乳动物细胞中短暂地表达。用于生产实验的细胞系是来自 HEK293 的细胞系，包括HEK293S 、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA细胞。测试了来自编码感兴趣蛋白质的质粒pCEP4和pEAK10的表达。用浓度范围0.3-0.8pg/ml细胞悬液(终浓度)的质粒DNA在大约0.5-lxl(^的细胞密度下进行转染。测试的转染试剂是2(ig/ml细月包悬液(终浓度)的Polyethylenimine ( Polyscience)。表达在30 ml到1000 ml的细胞培养体积(摇动烧瓶)和5L到10L的Wave生物反应器中进行。表达继之以在不同的天数从培养物上清液采集样品，分析细胞密度、细胞生存力、蛋白质表达和酶活性。通过离心在4到14天后收获细胞培养物。细胞培养基被用于蛋白质纯化实验。所有的质粒浓度和栽体都是成功的，得到不同的生产水平，一般在l-3mg/L的范围内。
实施例5
融合蛋白Fc-IDE和FcECEl在HEK293细胞中的表达蛋白质Fc-IDE和Fc-ECE1在悬浮适应的哺乳动物细胞中短暂地表达。用于生产实验的细胞系是来自HEK293的细胞系，包括HEK293S、 HEK293S-T和HEK293S-EBNA细胞。测试了来自编码感兴趣蛋白质的质粒pCEP4和pEAK10的表达。用浓度范围0.3-0.8ng/ml细胞悬液(终浓度)的质粒DNA在大约0.5-^106的细胞密度下进行转染。测试的转染试剂是2ng/ml细胞悬液(终浓度)的Polyethylenimine(Polyscience )。表达在30 ml到1000 ml的细胞培养体积(摇动烧瓶)和5L到10L的Wave生物反应器中进行。表达继之以在不同的天数从培养物上清液采集样品，分析细胞密度、细胞生存力、蛋白质表达和酶活性。通过离心在4到14天后收获细胞培养物。细胞培养基被用于蛋白质純化实验。
实施例6
中性溶酶的细胞外结构域和融合蛋白Fc-中性溶酶在CHO-S细胞中的表达
蛋白质中性溶酶(仅细胞外结构域)和Fc-Nep在悬浮适应的哺乳动物细胞中稳定地表达。生产实验中使用的宿主细胞是Flpln CHO细胞(Invitrogen)，其已经适应于悬浮生长。测试了从编码感兴趣蛋白质的质粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表达。表达由CMV启动子或EF1 cc启动子驱动。转染在F12培养基中利用约0.1ng/ml (终浓度)浓度的质粒DNA在大约lxl0"田胞/ml的细胞
36密度下进行。编码重组酶的辅助质粒pOG44在0.8 )^g/ml的终浓度下共转染。2jag/ml细月包悬液(终浓度)6勺Polyethylenimine ( Polyscience )用作转染试剂。表达在摇动烧瓶中30 ml到1000 ml的细胞培养体积中进行。来自培养物上清液的样品在不同的天数采集，分析细胞密度、细胞生存力、蛋白质表达和酶活性。通过离心在4到11天后收获细胞培养物。最后，细胞培养基被用于蛋白质纯化实验。使用的两种表达栽体在生产期望的蛋白质的方面都是成功的。生产水平一般在10-50 mg/L的范围内。
实施例7
融合蛋白Fc-IDE和Fc-ECE1在CHO-S细胞中的表达蛋白质Fc-IDE和Fc-ECE1在悬浮适应的哺乳动物细胞中稳定地表达。生产实验中使用的宿主细胞是FlpInCHO细胞(Invitrogen),其已经适应于悬浮生长。测试了从编码感兴趣蛋白质的质粒pcDNA5/FRT/TO-DEST30和pEF5/FRT/V5-DEST的表达。表达由CMV启动子或EF1 oc启动子驱动。转染在F12培养基中利用约0.1pg/ml(终浓度)浓度的质粒DNA在大约lxl0M田胞/ml的细胞密度下进行。编码重组酶的辅助质粒pOG44在0.8 ng/ml的终浓度下共转染。2pg/ml纟田月包悬液(纟冬f农度)的Polyethylenimine ( Polyscience )用作專争染^式齐'J 。表达在摇动烧瓶中30 ml到1000 ml的细胞培养体积中进行。来自培养物上清液的样品在不同的天数采集，分析细胞密度、细胞生存力、蛋白质表达和酶活性。通过离心在4到11天后收获细胞培养物。
实施例8
表达的Fc-中性溶酶蛋白质通过亲和层析纯化
进行。纯化通过亲和层析(蛋白A)进行，随后是低pH值洗脱，在AKTA层析系统(Explorer或Purifier, GE Healthcare )上进行。XK26柱(GE Healthcare )中的rProtein A Sepharose FF ( GE Healthcare )用IO倍柱体积(CV )的PBS( 2.7 mM KC1,138 mM NaCl， 1.5 mM KH2P04,8 mM Na2HP04-7H20, pH 6.7-7.0, Invitrogen)平衡。具有表达的融合蛋白(Fc-中性溶酶)的细胞培养基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗涂，之后结合的蛋白质用洗脱緩沖液(O.l M甘氨酸，pH3.0)洗脱。纯化的部份立刻通过向lml洗脱的蛋白质中添加50pl的lMTris碱来中和。集中纯化的部份，緩沖液利用PD10柱(GE Healthcare)交换成50 mM Tris-HCl、pH 7.5、 150 mM NaCl。纯化的蛋白质在SDS-PAGE上分析，发现是大约90%純度。
实施例9
表达的Fc-IDE和Fc-ECE1通过亲和层析纯化
融合蛋白的纯化利用来自哺乳动物细胞中的表达的细胞培养基进行。XK26柱(GE Healthcare)中的rProtein A Sepharose FF ( GEHealthcare )用10倍柱体积(CV )的PBS( 2.7 mM KC1， 138mMNaCl，1.5mMKH2P04， 8 mM Na2HP04-7H20， pH 6.7-7.0, Invitrogen )平衡。具有表达的融合蛋白(Fc-IDE或Fc-ECEl )的细胞培养基施加到柱上。柱用20 CV PBS洗涤，之后结合的蛋白质用洗脱緩沖液(0.1 M甘氨酸，pH3.0)洗脱。纯化的部分立即通过向lml洗脱的蛋白质中添加50|iil 1MTris碱来中和。集中纯化的部份，緩沖液利用PD10柱(GEHealthcare)交换成50 mM Tris-HCl、 pH7.5、 150mMNaCl。
实施例10
Fc-中性溶酶的表达的SDS-PAGE和Western印迹分析来自哺乳动物细胞中表达的细胞培养基利用Western印迹来分析。20 pi细胞培养基在包含样品还原剂(Invitrogen)的4xLDS样品緩沖液(Invitrogen)中稀释。样品加热到95。C 5分钟，加栽到SDS-PAGE凝胶上(4-12%梯度凝胶，10孑L (1mm) ， invitrogen)。MES緩沖液用作运行緩沖液。凝胶在200V电泳(run) 35分钟。在30 V进行电印迹1小时，来将蛋白质转移到PVDF膜上。膜在包括5% BSA的TBST ( TBS ( 20 mM Tris、 500 mM NaCl， pH 7.5 ( BioRad )加0.05% Tween-20)中封闭过夜，之后它们与30 pi —抗(生物素化的山羊抗人类中性溶酶抗体，50pg/ml (R&D Systems))在15 mLTBST中孵育。膜在室温下孵育两个小时，用TBST洗涤三次，与链霉抗生物素蛋白辣根过氧化酶缀合物(GE Healthcare, 1:10 000稀释(15ml TBST中1.5pl)孵育1小时。膜用TBST洗涤三次用水洗涤三说明书第35/56页
次，之后利用ECL plus试剂(GE Healthcare)和ECL胶片(GE Healthcare )显现。SDS-PAGE显示了纯化的蛋白质具有正确大小和大 约90%纯度。Western印迹证实了中性溶酶结构域的身份。
实施例11
中性溶酶酶活性FRET分析
中性溶酶酶活性在焚光共振能量转移(FRET)分析中测定。重组 人类中性溶酶(R & D Systems)、来自中性溶酶或Fc-中性溶酶生产 细胞(AZ S6dertaije )的培养基、或纯化的中性溶酶或Fc-中性溶酶添 加到含有iO)tiM荧光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys
(Dnp) -OH (R&D Systems)的96孔平板中。对照的重组人类中性 溶酶的终浓度是0.1或0.25 pg/ml。 10 的中性溶酶抑制物膦酰二肽
(phosphoramidone ) ( BIOMOL )添加到一些孔中，以控制分析中信 号的特异性和证实特异性中性溶酶活性。在向反应孔添加所有的成分 之后，平板立即置入荧光板读取器(Ascent)中，在激发340 nm和发 射405 nm处每分钟记录信号持续20分钟。酶活性通过计算反应速度 一斜率系数-S ARFU/At来评估。为了比较商售的重组中性溶酶和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我们引入了比活性系数，其根据这个公 式计算比活性=斜率系数/分析中中性溶酶或Fc-中性溶酶单体的 pmol。
实施例12
IDE和CEC1酶活性FRET分析
酶活性在焚光共振能量转移(FRET)分析中测定。没有Fc结构 域的重组酶(商售的或内部生产的)、培养基(来自Fc-IDE或Fc-ECEl 生产细胞)或纯化的蛋白质(Fc-IDE或Fc-ECEl )添加到含有lO^M 荧光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys( D叩)-OH( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入荧光板读取器(Ascent)中，在激发340 nm和发射405 nm处每分 钟记录信号持续20分钟。酶活性通过计算反应速度-斜率系数- S ARFU/At来评估。为了比较对照(商售的重组酶)的比活性，比活性 系数根据这个公式来计算比活性=斜率系数/分析中酶结构域的pmol。
实施例13
细胞培养上清液中中性溶酶和Fc-中性溶酶浓度的测定 细胞培养上清液中的中性溶酶浓度利用GyrosTM BioaffyTM CD微 实验室方法和Gyrolab Workstation LIF设备(Gyros AB, Sweden )测 量。来自不同细胞培养物的样品在标准稀释剂(Gyros AB)中稀释， 置入Thermo-Fas t 96孔PCR平板(Abgene， UK )中。单克隆小鼠 生物素化抗人类中性溶酶抗体(Serotec)用作捕获试剂(终浓度0.05 mg/ml)，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )标记的多克隆 山羊抗人类中性溶酶抗体(R&D systems)充当检测抗体(终浓度 100nM)，用于中性溶酶浓度的测量。商售的重组中性溶酶(R&D systems)用作标准物，浓度范围从10 ng/ml到10000ng/ml以构建标 准曲线。多克隆生物素化的抗人类中性溶酶抗体(R&Dsystems)用 作捕获抗体，而用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )标记的多 克隆山羊抗人类IgG抗体(Molecular Probes)用作检测抗体用于Fc-中性溶酶构建体检测。内部生产的和純化的Fc-中性溶酶融合蛋白充 当标准物，浓度范围从10ng/ml到10000ng/ml。标准物、捕获和检测 抗体置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene )中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF仪器，使用Gyrolab BioaffyTM软件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐厂家方案进行浓度测量。
实施例14
细胞培养上清液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECEl浓度的测量 细胞培养上清液中的蛋白质浓度利用Gyros BioaffyTM CD微实 验室方法和Gyrolab Workstation LIF设备(Gyros AB, Sweden )测量。 来自不同细胞培养条件的样品在标准稀释剂(Gyros AB)中稀释，置 入Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK )中。生物素化的IDE 或ECEl特异性抗体用作捕荻试剂，Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes)标记的IDE或ECEl特异性抗体用作检测抗体。商售的或内 部生产重组IDE和ECEl被用于构建标准曲线。当测量Fc-IDE或 Fc-ECEl浓度时，差别是用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )标记的多克隆山羊抗人类IgG抗体(Molecular Probes )用作检测抗体。 标准物、捕获和检测抗体置于Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene) 中。平板以及Gyrolab Bioaffy CD都放入Gyrolab Workstation LIF 仪器，使用Gyrolab BioaffyTM软件包版本1.8 ( Gyros AB )根据厂家方
案进行浓度测量。
实施例15
在緩沖液中Fc-中性溶酶和中性溶酶对淀粉样P肽的降解 这个实验的目的是证实Fc-中性溶酶能够降解淀粉样pi-40肽。该 分析是在有或者没有中性溶酶抑制物、存在中性溶酶(R&D Systems ) 或Fc-中性溶酶的情况下孵育后测量残余的淀粉样(31-40肽(Bachem) 浓度。含有淀粉样pi-40肽(终浓度，300、 30或3 nM)和/或中性溶 酶(2.4pg/ml)和/或Fc-中性溶酶构建体(2.4pg/ml)和/或磷酰二肽 (10pM)的100 pl反应混合物在圆底96孔聚丙烯平板中在37°。孵育 2.5小时。在孵育之后，10 ^tl的反应混合物转移到含有10 标准稀 释剂(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene ， UK ) 中。淀粉样卩1-40浓度利用Gyrolab Workstation LIF系统测定。生物 素化的抗淀粉样P抗体(6E10;终浓度50pg/ml; Signet)用作捕获抗 体，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )标记的多克隆抗人类 淀粉样p抗体(44-348; Biosource)用作检测抗体。淀粉样pi-40肽 浓度测量使用Gyrolab BioaffyTM软件包版本1.8 ( Gyros AB )根椐厂家 方案进行。中性溶酶的淀粉样)31-40肽降解被计算为在存在中性溶酶 的情况下孵育后留下的淀粉样P1-40肽、与不存在中性溶酶的情况下 的淀粉样pi-40肽浓度相比较的百分比。
在2.4jag/ml的浓度下重组人类中性溶酶在37°C 2.5小时的孵育后 降解了 64%的淀粉样|31-40肽(300 nM)。内部生产的Fc-中性溶酶 构建体在大约相同的浓度(2.4pg/ml)下降解50% (批次1)和42% (批次2 )的淀粉样pl-40肽(300 nM )。在存在10 膦酰二肽的
情况下特异性中性溶酶活性几乎完全地消除(附图1)。这个实施例 显示了 Fc-中性溶酶有效地降解淀粉样卩l-40肽。
实施例16
41在緩冲液中IDE、 ECE1、 Fc-IDE和Fc-ECE1的淀粉样卩肽降解 这个实验的目的是证实Fc-IDE和Fc-ECEl能够降解淀粉样卩1-40 肽。该分析测量在存在酶(Fc-IDE或Fc-ECE1 )的情况下孵育后残余 淀粉样(31-40肽(Bachem)的浓度。含有淀粉样(31-40肽(终浓度， 300、 30或3 nM ) 、 Fc-IDE或Fc-ECE1的100 pl反应混合物在37°C 孵育2.5小时。在孵育之后，10 pl的反应混合物转移到含有10 标 准稀释剂(Gyros AB )的Thermo-Fast 96孔PCR平板(Abgene, UK ) 中。淀粉样卩1-40浓度使用Gyrolab Workstation LIF系统测量。生物 素化的抗淀粉样P抗体(6E10;终浓度5(Vg/ml; Signet)用作捕获抗 体，用Alexa Fluor 647染料(Molecular Probes )标记的多克隆抗人类 淀粉样(3抗体(44-348; Biosource )用作^r测抗体。中性溶酶的淀粉 样pi-40肽降解被计算为在存在酶的情况下孵育之后留下的淀粉样 pi-40肽、相比不存在酶的情况下的淀粉样pi-40肽浓度的百分比。
实施例17
在豚鼠血浆中Fc-中性溶酶对淀粉样(3肽l-40和淀粉样(3肽1-42 的降解
中性溶酶对淀粉样卩肽1-40 ( A卩40 )和淀粉样|3肽1-42 ( A卩42 ) 的降解利用来自体重250-300g的雄性Dimkin Hartley豚鼠 (HBLidk6ping ka )的肝素化血浆来研究。通过心脏穿刺从麻醉的豚 鼠抽取血液。在采样的20分钟内，血液采集到预冷的肝素-血浆试管 中，在4°C 3000xg离心10分钟。血浆样品转移到预冷的聚丙烯试管 中，立即在干水上冷冻，使用前保持在-70。C。实验在来自七只豚鼠的 血浆库上进行。His-Fc-Nep ( 6ng/ml或208ng/ml)或5 |ag/ml重组人 类中性溶酶(R&D systems )和相应的栽体(50 mM Tris-HCl、 150mM NaCl pH 7,5或25mM Tris-HCl、 0掘NaCl pH 8.0)在存在或缺少 10pM膦酰二肽(BIOMOL)的情况下与血浆的库在37。C孵育0和4 小时。终浓度4.7mM的EDTA添加到试管中，之后A卩40和Ap42的 量利用获自Biosource( A卩卜40)或Innogenetics( A(31-42 )的商售ELISA 试剂盒来分析。
与栽体相比较，在37。C用豚鼠血浆和6pg/ml或208pg/ml His-Fc-Nep的4小时离体(e;c-v/vo )孵育分别产生了 A(340的26%和51%的降低。与栽体相比，商售的人类重组中性溶酶(5 pg/ml)降解 了 AP40 49%。在添加10^M膦酰二肽之后A(340水平不受影响(附图 2)。
当用208 |ng/ml His-Fc-Nep或5ng/ml中性溶酶(R&D systems ) 孵育时，与栽体相比，豚鼠血浆中的A|342水平降低超过57%。当与 208ng/ml的His-Fc-Nep组合时，A卩42的降低不受膦酰二肽的抑制。 低浓度的His-Fc-Nep没有Ap42中的降解(附图3 )。
实施例18
在人血浆中Fc-中性溶酶的淀粉样卩肽l-40降解 在两个不同的时间点在医疗中心(AstraZeneca )将来自八位个体 (5男性和3女性)的血液采集到预冷却的肝素-血浆试管中。在采样 的30分钟内，血浆通过在4。C在2500xg离心20分钟来制备。血浆样 品转移到预冷却的聚丙烯试管，立即冷冻，在使用前保存在-70。C。 His-Fc-Nep ( 6pg/ml)或5^g/ml重组人类中性溶酶(R&D systems ) 和相应的栽体(50 mM Tris-HCl、150 mMNaCl pH7.5或25mM Tris-HCl 0.1 M NaCl pH 8.0)在存在或缺少10nM膦酰二肽的情况下 与血浆库在37。C孵育0和4小时。终浓度4.7mM的EDTA添加到试 管中，之后使用获自Biosource的商售的ELISA试剂盒分析Ap40的 量。与栽体相比在37。C孵育4小时之后，His-Fc-Nep ( 6(ig/ml)和商 售的人类重組中性溶酶(5pg/ml)分别降解A卩40 33%和70%。 A(340 水平在添加10pM膦酰二肽后不受影响(附图4)。
实施例19
在豚鼠血浆中内部生产的Fc-N印的淀粉样(3肽1-40和淀粉样P 肽1-42的降解(体内研究)
进行豚鼠中的体内研究以测试内部生产的Fc-Nep的体内效力。 读数是血浆AP水平和血浆药物浓度。Y-分泌酶抑制物AZ10420130 (M550426 )被用作参考(血浆A|3水平降低的阳性对照)。
豚鼠(雄性Dunkin Hartley豚鼠，250-300 g )被称重，i.v.施用单 剂量。目的是，剂量在结束时应得到O、 5和20pg/ml的血浆暴露。在 整个实验期间进行动物健康状态的观察。在每个时点包括8只动物，每个时点具有其自身的栽体组。动物用异氟烷麻醉，通过心脏穿刺采
集血液。对关于血液样品的信息，处理并分析Api-40或Api-42 (参 见实施例23)。所有血浆样品将进行PK研究来测定药物暴露(方法 描述参见实施例20)。
实施例20
Fc-Nep和仅中性溶酶的药物动力学
开发Fc-Nep融合蛋白来改善中性溶酶药物动力学实质，特别地 针对降低清除和改善半衰期。为了测试这一点，我们向小鼠i.v.施用 了 1 mg/kg商售的中性溶酶或1或5 mg/kg内部生产的Fc-Nep的单次 剂量。在给药后设定的时间，在最后从尾部静脉或通过心脏穿剌抽取 血液样品。在采样到含有EDTA的试管中时，将等分量置于冰上。通 过在采样的15分钟内离心来制备血浆(一般1500g 4°C IO分钟)并 立即冷冻。对商售中性溶酶使用抗-Nep、或对Fc-Nep使用抗人类IgG 作为捕获抗体，而两种物质都通过抗Nep抗体检测，通过免疫分析测 定Fc-Nep和中性溶酶的血浆浓度。使用软件包(WinNonlin, Pharsight Corporation, USA )计算药物动力学参数，在这个实施例实验中，计 算的半衰期从对于N印的约5分钟提高到对于Fc-Nep约20小时。结 果在附图5中显示。
实施例21
利用酶活性FRET分析在细胞培养基中中性溶酶-Fc和Fc-中性 溶酶的酶活性的比较
为了比较Fc的C-末端与中性溶酶的融合物和Fc的N-末端与中 性溶酶的融合物，根椐实施例4产生两种蛋白质(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如实施例8描述的纯化。细胞培养基中蛋白质的酶活性在 荧光共振能量转移(FRET)分析中测试。重组人类中性溶酶(R&D systems)、来自Fc-中性溶酶生产细胞的培养基、以及来自中性溶酶 -Fc生产细胞的培养基添加到含有 10 nM 荧光肽底物 V曙Mca-Arg曙Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems ) 的96孔平板中。对照重组人类中性溶酶的终浓度是0,1或0.25pg/ml。 在向孔添加所有的成分之后，平板立即置入焚光板读取器(Ascent)
44中，在激发340 nm和发射405 nm处每分钟记录信号持续20分钟。 通过计算反应速度-斜率系数-SARFU/厶t来评估酶活性。为了比较商 售的重组中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋白和Fc-中性溶酶融合蛋白的 比活性，我们引入了比活性系数，其根据这个公式计算比活性=斜 率系数/分析中中性溶酶或融合蛋白单体的pmol。结果(附图6中所 示)显示了 Nep-Fc的表达产生了非常低的比活性(对于用pCEP4栽 体表达为O.l，用pEAK 10栽体表达为0.55 ),但是Fc-Nep的表达产 生了高得多的比活性(用pCEP4栽体表达为13.4，用pEAK10栽体表 达为15.2)。
实施例22
利用酶活性FRET分析比较純化的中性溶酶-Fc和Fc-中性溶酶的 酶活性
为了比较Fc的C-末端与中性溶酶的融合物和Fc的N-末端与中 性溶酶的融合物，根据实施例4产生两种蛋白质(Fc-中性溶酶和中性 溶酶-Fc)并如实施例8描述的纯化。中性溶酶酶活性在荧光共振能量 转移(FRET)分析中测定。重组人类中性溶酶(R&D systems)、 純化的中性溶酶-Fc蛋白质和纯化的Fc-中性溶酶添加到含有10|iM荧 光肽底物V-Mca-Arg-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys ( Dnp ) -OH ( R&D Systems)的96孔平板中。在向孔添加所有的成分之后，平板立即置 入荧光板读取器(Ascent)中，在激发340 nm和发射405 nm处每分 钟记录信号持续20分钟。通过计算反应速度-斜率系数- S厶RFU/At 来评估酶活性。为了比较商售的重组中性溶酶、中性溶酶-Fc融合蛋 白和Fc-中性溶酶融合蛋白的比活性，我们引入了比活性系数，其根 据这个公式计算比活性=斜率系数/分析中中性溶酶或中性溶酶-Fc 单体的pmol。结果(附图9中显示)显示了纯化的融合蛋白Nep-Fc 的比活性是非常低的(0.001)，但是纯化的融合蛋白Fc-Nep的比活 性高得多(14.1 )。
实施例23
在APPswE-转基因小鼠中血浆中用Fc-中性溶酶对可溶的A卩水平 的处理这项研究的目的是评估在急性的静脉内处理之后在雌性
APPSWE-tg小鼠的血浆中Fc-Nep的时间和剂量-反应效果。特定目的是 发现对血浆A(34o和A^2的效果。？分泌酶抑制物M-550426被包括作 为参考化合物。
25-31周龄雌性APPswE-转基因小鼠(10只小鼠/组)以l或5mg/kg 单次静脉内注射接受栽体或Fc-Nep。作为参考化合物，使用300 pmol/kg的Y-分泌酶抑制物M-550426,这些动物在3小时内处理(4 只小鼠)。空白组(4只未处理的小鼠)还被包括在研究中。在给药 后1.5和3小时从栽体和化合物处理的动物采集血液。通过心脏穿剌 从麻醉的小鼠抽出血液到预冷却的含EDTA的微试管中。离心之前， 血液样品立即置于冰上。在采样的20分钟内，血浆通过在大约3000xg 在+4。C离心10分钟来制备。在血液采集之后，小鼠被终结。血浆中 AP40和A卩42水平通过分别获自Biosource和Innogenetics的商售 ELISA试剂盒来分析。
根椐实施例20中描述的操作，分析血浆中和制剂中Fc-Nep的浓 度。在来自未处理的动物的样品(空白)和来自用M550426处理的动 物的样品中，分析血浆的暴露。
结果
在APP面转基因小鼠中在1或5 mg/kg i.v注射给药之后1.5小时 而非给药之后3小时的血浆中，与栽体相比，Fc-Nep显著地降低可溶 的A卩40的水平大约20%( P<0,05 )。在1和5 mg/kg在1.5小时，Fc-Nep 的平均血浆暴露分别是9.8和33细/ml。 3小时后没有见到A卩40的 显著的变化，而1和5 mg/kg的Fc-Nep血浆暴露分别是7.6和 27.3|ig/ml。如所预计的，在用阳性对照，y-分泌酶抑制物M550426处 理后的血浆中观察到A|340的降低的水平。在给药后3小时M550426 的平均血浆暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是33.5 (附图7)。
在用5 mg/kg Fc-Nep处理1.5小后血浆中的A(342水平与栽体相 比降低了约20% (P<0.05)。在1 mg/kg施用1.5小后没有见到显著 的变化。在3小时后任何剂量中没有见到AP42的显著的变化，而在 1和5 mg/kg的Fc-Nep血浆暴露分别是7.6和27.3ng/ml。在用阳性对 照，？分泌酶抑制物M550426处理后的血浆中》见察到AP42的降低的水平。在给药后3小时M550426的平均血浆暴露在接受300 pmol/kg 的小鼠中是33.5nM (附图8)。
实施例24
在C57BL/6小鼠的用hFc-Nep处理和对血浆中可溶的A(3水平的 影响(时间和剂量反应研究1.5和3小时)
这项研究的目的是评估在急性处理之后在雌性C57BL/6小鼠的 血浆中hFc-Nep的时间和剂量-反应效果。特定目的是找到对血浆A(340 的效果和将效果与血浆中hFc-Nep的暴露程度相关。？分泌酶抑制物 M-550426被包括作为阳性对照。
13周龄雌性C57BL/6小鼠(10只小鼠/组)以1或5 mg/kg单次 静脉内注射接受栽体或hFc-Nep。在终止前3小时以300 pmol/kg 口服 地施用M-550426。空白组也被包括在研究中。在给药后1.5和3小时 从栽体和化合物处理的动物采集血液。通过心脏穿刺从麻醉的小鼠抽 出血液到预冷却的含EDTA的微试管中。离心之前，血液样品立即置 于冰上。在采样的20分钟内通过在+4。C大约3000xg离心10分钟制 备血浆。在血液采集之后，小鼠被终结。在整个实验期间进行动物健 康状态的观察，显示了没有明显的副作用。血浆中的小鼠A|340水平 通过获自Biosource的商售ELISA试剂盒分析。根据实施例27中描述 的操作，分析血浆中和制剂中Fc-Nep的浓度。
结果
结果显示了在C57BL/6小鼠中1.5和3小时后通过用hFc-Nep处 理小鼠AP40以剂量依赖性方式显著地降低。在1.5小时之后，与栽 体相比，在1 mg/kg刑量见到A卩40的17。/。降低(p- 0.1638 )，在5mg/kg 剂量76%降低(pO.0001 )。在1.5小时1和5 mg/kg下hFc-Nep的 平均血浆暴露分别是14和89ng/ml。在3小时后，与栽体相比，在l mg/kg剂量A卩40被显著降低36% ( p<0.005 )，在5mg/kg剂量降低 72%。在3小时在1和5 mg/kg下hFc-N印的平均血浆暴露分别是17 和78pg/ml。如所预计的，在用阳性对照，Y分泌酶抑制物M-550426 处理后在血浆中也观察到AP40的降低的水平。在给药后3小时 M-550426的平均血浆暴露在接受300 pmol/kg的小鼠中是42 pM (附图10)。
实施例25
利用作为单剂量经由静脉内注射给予C57BL/6小鼠的hFc-Nep的 时间-反应关系
这项研究的目的是评估在单剂量之后在雌性C57BL/6小鼠的血 浆中hFc-Nep的时间-反应关系。特定目的是发现hFc-Nep的降低效果 在血浆中保持多久，以及将效果与血浆中测试化合物暴露水平相关。 Y-分泌酶抑制物M-550426被包括作为阳性化合物。
20-12周龄雌性C57BL/6小鼠(8只小鼠/组)接受5 mg/kg的栽 体或hFc-Nep的单次静脉内注射，在注射后不同的时点分析A(340 (1.5-168小时之间，即，直到1周)。y-分泌酶抑制物M-550426 口 服地给药，动物被处理3小时。空白组也被包括在研究中。在整个实 验期间进行动物健康状态的观察，显示了没有明显的副作用。血液采 集、血浆加工和血浆中小鼠A(340水平的测量基本上如实施例27所描 述的。
结果
结果(附图11)显示，当作为对C57BL/6小鼠的单次静脉内注 射，在hFc-Nep的1.5-168小时处理之后血浆AP40被显著地降低。在 所有的时间点(1.5、 6、 12、 24、 36、 72和168小时)A卩40降低是 持续的(与栽体相比67-80%之间)。在1.5小时在5 mg/kg下hFc-Nep 的平均血浆暴露是87Mg/ml，在l周后(168小时)慢慢地降低到38pg/ml 的水平。这些数据显示了在小鼠中Fc-Nep的半衰期是显著地长的。 如所预计的，在用阳性对照，，分泌酶抑制物M550426处理后的血浆 中观察到AP40的降低的水平。在给药后3小时M-550426的平均血 浆暴露在接受300 |amol/kg的小鼠中是34 pM (附图11 )。
实施例26
利用作为单剂量经由静脉内注射给予APPSWE-tg小鼠和C57BL/6 的小鼠Fc-Nep的时间-反应关系
这项研究的目的是评估在单剂量之后在雌性APPSWE-tg小鼠和
48平相关。" 分泌酶抑制物M-550426被包括作为阳性化合物。21-23周龄雌性APP匿-tg小鼠和24周龄雌性C57BL/6小鼠(6 只小鼠/组)接受单次静脉内注射的5或25 mg/kg的栽体或mFc-Nep， 在注射后不同时点分析A卩40 ( 1.5-336小时之间，即，直至2周)。 在终止之前3小时M-550426以300 pmol/kg 口服地施用。对于两种小 鼠模型，包括了 APPSWE-tg和C57BL/6、阳性对照和空白组。对于 APPswE-tg小鼠包括了以下的组25 me/kg: 1.5、 72、 168和336小时； 5 mg/kg: 336小时(2周)。对于C57BL/6小鼠25 mg/kg: 168和 336小时；5 mg/kg: 1.5、 168和336小时。在整个实验期间进行动物 健康状态的观察，显示了没有明显的副作用。血液采集和血浆加工基 本上如实施例25描述的进行。C57BL6小鼠血浆中小鼠AP40水平的 分析如实施例25描述的进行。APPSWE-tg小鼠血浆中人类A|340和 A卩42水平的分析如实施例25中描述的进行(如在最后的APP-tg研究 中描述的)。结果在APPswE-转基因小鼠中，在单次施用25mg/kg后，在所有时间 点，mFc-Nep显著地降低血浆中的人AJ340和A(342(附图12， a和b )。 在1.5小时之后，当与栽体相比时，AP40和AP42的A卩水平分别是 91%和87%，当暴露被降低时A(3水平逐渐地提高。在两周(336小时) 后，与栽体相比，A(340和A(342的八(3水平分别是58%和44%。在两 周后，在25 mg/ml mFc-Nep的单次静脉内注射后的暴露从299pg/ml (1.5小时)降低到60pg/ml ( 336小时)(附图12， c)。对于168 和336小时，使用了给予5 mg/kg的其他组的动物。如附图12， a和 b中所示，对于A(340和Ap42两者，在那些时间点A卩以剂量依赖性 方式降解。A(340和AP42的血浆效力效果与mFc-Nep的血浆暴露是反 相关的(附图13)。这些结果表明，mFc-Nep的A卩降解效果对A卩40 比对AP42更大。在C57BL/6小鼠中，在所有时间点(1.5、 168和336小时)在5和25mg/kg下mFc-Nep显著地降低血浆中的小鼠A卩40 (附图14)。 在168和336小时，分析了 5和25 mg/kg两者，Ap40效果显示是剂 量依赖性的。在2周后，与栽体相比，25mg/kgmFc-Nep的单次注射 (336小时)显著地降低血浆中小鼠A(340水平73%。这个时点的血 浆暴露是48ng/ml，因而mFc-Nep显示了具有长血浆半衰期。实施例27Fc-Nep和内部生产的中性溶酶的药物动力学利用Fc-Nepa和Nep的不同批次重复药物动力学研究，获得不同 的PK分布图。最重要的是包括IgG的Fc部分的化合物的血浆半衰期 的显著延长。开发Fc-Nep融合蛋白来改善中性溶酶药物动力学实质，特别地 针对降低清除和改善半衰期。为了测试这一点，我们向小鼠i.v.施用 了单次的10或50 nmol酶/kg体重的中性溶酶(Nep )或Fc-N印(1 和5 mg/kg)。在设定的时间，在最后从尾部静脉或通过心脏穿刺抽 取血液样品。在采样到含有EDTA的试管中时，将等分量置于冰上。 在采样的15分钟内通过离心制备血浆(一般1500g 4°C IO分钟)并 立即冷冻。对Nep使用抗-N印、或对Fc-Nep 4吏用抗人类IgG作为捕 获抗体，而两种物质都通过抗Nep抗体^r测，通过免疫分析测定Nep 和Fc-Nep的血浆浓度。使用软件包(WinNonlin, Pharsight Co卬oration， USA)计算药物动力学参数，在这个实施例实验中，计算的半衰期从 对于Nep的约1天提高到对于Fc-Nep的约2.5周。结果在附图15中 示出。实施例28在人类和APPSWE-tg小鼠血浆中人类或小鼠Fc-中性溶酶的淀粉 样|3肽1-40、 1-42的降解在三不同的时间点在医疗中心(AstraZeneca )将来自十二位个体 (6男性和6女性)的血液采集到预冷却的肝素-血浆试管中。通过在 4。C在2500xg离心20分钟制备血浆。采集血浆样品并转移到预先冷 却的聚丙烯试管中，立即冷冻，在使用前-70。C保存。就在实验前将来 自12位个体的血浆解冻并集中。血浆库中的Api-40和1-42通过具有相应栽体(50mMTris-HCl， 150 mM NaCl pH 7.5 )的人类Fc-Nep或 小鼠Fc-Nep降解。使用以下终浓度的Fc-Nep构建体，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml，在室温下在定轨摇动器上摇动进行降解 l小时。通过添加膦酰二肽(10 ^M终浓度)来停止酶反应。人血浆 库中的淀粉样(31-40的浓度利用ELISA试剂盒(Biosource; KHB3481 ) 根据厂家说明书测量。终浓度4.7 mM EDTA添加到试管，之后使用ELISA试剂盒 Innotest P-AmyloidM2 (I,genetics， lot# 177462, ref弁80177 )根据 厂家说明书分析AP42的浓度。与没有Fc-N印处理的血浆相比，最高浓度(100pg/ml)的人类 Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分别降解人血浆淀粉样(31-40 66%和71%，分 别降解A卩1-42 28%和19。/。。人类Fc-Nep和小鼠Fc-Nep的降解的EC50 值对于人类Api-40分别是0.58piM和0.40|iiM,对于A(31-42分別是 0.25jliM和0.18pM。结果在附图16中概述。采集自9只动物的小鼠血浆保存在-70。C。就在实验前将血浆解冻 并集中。血浆库中的A卩1-40和1-42由具有相应栽体(50 mM Tris-HCl， 150mMNaClpH7.5)的人类Fc-N印或小鼠Fc-Nep降解。使用以下 终浓度的Fc-Nep构建体，100、 32、 10、 3.2、 1、 0.3、 0.1和0pg/ml， 在室温下在定轨摇动器上摇动进行降解1小时。酶反应通过添加膦酰 二肽(10 终浓度)来停止。在降解之后，在使用ELISA试剂盒(Biosource; KHB3481 )测量 tg-小鼠血浆库中的淀粉样(31-40的浓度之前，根据厂家说明书将血浆 样品在标准稀释剂緩沖液中稀释2 0倍。在降解之后，终浓度4.7 mM EDTA添加到tg-小鼠血浆试管中， 血浆样品在样品稀释剂中稀释3倍，之后使用ELISA试剂盒Innotest P-AmyloidM2 ( Innogenetics， lot# 177462, re併80177 )根据厂家说明 书分析AP42的浓度。与没有Fc-Nep处理的血浆相比，最高浓度(IOO fag/ml)的人类Fc-Nep和小鼠Fc-Nep分别降解人血浆淀粉样pi-40 71% 和77%,分别降解A(3 1-42 34%和53%。人类Fc-Nep和小鼠Fc-N印 的降解的ECso值对于人类A|3l-40分别是0.47nM和0,34 ^M，对于 A|31-42分别是1.3pM和0,82(_tM。结果在附图16中概述。SE(3 ID NO 1中性溶酶的细胞外结构域的氨基酸序列，形式lYDDGICKSSDCIKSAARLIQ画DATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTE匿AVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVIHIDC PRLGLPSRDYYECTG1YKEACTAYVDFMISVARLIR卿RLPIDEN(5LALE顧KVMELEKE腦ATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMST雨SITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLGNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIC TLDDLTWMDAE丁KXRAEEKALAIKERIGYPDDIVSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFEN11QNLKFSQSKQLKXLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGLQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRJIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 2中性溶酶的细胞外结构域的氨基酸序列，形式2YDDGICKSSDCIKSAARUQ雇DATTEPCRDFFKYACGGWUCRNVIPETSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDIYGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQ10NNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVN1SITNEEDVVVYAPEYLTKLKP1LTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIGTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDD1VSNDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGRNQ1VFPAG1LQPPFFSAQQSNSLNYGG1GMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKJCNGEEKXLPGLDLNHKQLFF匿AQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVWSEQ ID NO 3
中性溶酶的细胞外结构域的氨基酸序列，形式3
YDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNF
DILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDI
YGWPVATENWEQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDD画VNHVI
HIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIR卿RLPIDENQLALEMN
KVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEI
MSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRT
YKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG廳ENAVGRLYVEAAFAGESKHV
VEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDDIVSNDNKLNN
EYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGR
NQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDW
WTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAY
RAYQNYHCKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSP
GNFRIIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
SEQ ID NO 4
中性溶酶的细胞外结构域的氨基酸序列，形式4
YDDGICKSSDCIKSAARUQNMDATTEPCRDFFKYACGGWLKRNVIPETSSRYGNF
DILRDELEVVLKDVLQEPKTED1VAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEPLLKLLPDI
YGWPVATE丽EQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVLINLFVGTDDKNSVNHVI
HIDQPRLGLPSRDYYECTGIYKJEACTAYVDFMISVARUR卿RLPIDENQLALEMN
KVMELEKEIANATAICPEDRNDPMLLYNKMRLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEI
MST雨SITNEEDVVVYAPEYLTiaKPILTKYSARDLONLMSWRFIMDLVSSLSRT
YKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHV
VEDLIAQIREVF1QTLDDLTWMDAETKKRAEEKALAIKERJGYPDDIVSNDNKLNN
EYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVNAFYSSGR
NQIVFPAG1LQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKDGDLVDW
WTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNGGLGQAY
RAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSP
GNFRJIGTLQNSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
53SEQ ID NO 5
IDE (胰岛素降解酶)的氨基酸序列
MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITK
SPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEH
MLFLGTKKYPKENEYS()FLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQ
FFLCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTG
NKYTLETRPNQEG1DVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFS
EVENKNVPLPEFPEHPF卿HLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHY
LGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFI譜DLTEEGLLHVED
IILHMFQYIQKXRAEGPQEWYFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSK1AGILHYYP
LEEVLTAEYLLEEFRPDL固VLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYK
QEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSK
LWFKQDDKJCKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAE
LAGLSYDLQNT1YGMYLSVKGYNDKQPILLKK11EKMATFE1DEKRFEIIKEAYMRS
LNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFPQLLSRL
HIEALLHGNITKQAALG1MQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFV
YQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQI1SEPCFNTLRTKEQLGYIVFS
GPRRANGIQSLRFHQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRR
LDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEMLAVDA
PRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPL
FPLVKP訓FMAAKLSEQ ID NO 6
IDE (胰岛素降解酶)的氨基酸序列(剪接变体) MRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITK
SPEDKREYRGLELANGIKVLLISDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHM
LFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFF
LCPLFDESCKDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNK
YTLETRPNQEGIDV,LLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEV
ENKNVPLPEFPEHPF(JEEHLK(3LYKJVPIKDIRNLYVTFPIPDLC KYYKSNPGHYLG
HLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFHNVDLTEEGLLHVEDIIL
HMFQYIQKLRAEGPQGWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSK1AGILHYYPLE
EVLTAEYLLEEFRPDL麵VLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQE
AIPDEVIKKWQNADLNGKFKXPTKNEFIPTNFE1LPLEKEATPYPALIKDTAMSKLW
FKC DDKFFLPKACLNFEFFSRYIYADPLHCNMTYLFIRLLKDDLKEYTYAARLSGL
SYGIASGMNAILLSVKGYNDKQPILLKKJIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFR
AEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALL
HGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLPDRGWFVYQQRNE
VHNNCGIEIYYQTDMQSTSE丽FLELFCQHSEPCFNTLRTKEQLGYIVFSGPRRAN
GIQGLRF1IQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQALAIRRLDFCPKK
LSAECAKYWGEI1SQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKJYKEMLAVDAPRRHKV
SVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQNMTEFKRGLPLFPLV1CP
画FMAAKL
SEQ ID NO 7
ECE1 (内皮素转化酶1 )的氨基酸序列
QYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGW1KANPVPDGHSR
WGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEELRAKPLM
ELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNSNSNVIQV
DQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQMQQILD
FETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVEINESEPIV
VYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMI糊LVRKTSSFLDQRFQDADEKFMEVMYG
TKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATEIILEIKKAFEESLS
TLKWMDEETRKSAKEKADAIVNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPDLYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGILQAPFYT
RSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEAFKRQTE
CMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGE隐DNGGLKAAYRAYQNWVKKNGAEHSLP
TLGLTNT^LFFLGFAC VWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKEFSEHFR
CPPGSP訓PPHKCEVW
SE()IDN0 8
表达构建体中使用的信号肽的氨基酸序列METDTIXLWVLLXWVPGSTGD
SEQ ID NO 9
铰链区域的氨基酸序列(来自IgG2)ERKCCVECPPCP
SEQ ID NO 10
Fc结构域的氨基酸序列(来自IgG2)
APPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKMQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKXTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 11
完整融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQF
NWYVDGVEVKNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKYDDGICKSSDC1KSAARLIQNMDATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPE
TSSRYGNFDILRDELEVVLKDVLQEPKTEDIVAVQKAKALYRSCINESAIDSRGGEP
LUCLLPDIYGWPVATE丽EQKYGASWTAEKAIAQLNSKYGKKVL亂FVGTDDKNSVNHVIHID(5PRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVD图SVARLIR卿RLPIDEN
QLALE讓KVMELEKEIANATAKPEDRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFS
WLNFTNEIMSTVNISITNEEDVVVYAPEYLTKLKPILTKYSARDL()NLMSWRFIMD
LVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNGNMENAVGRLYVEAAF
AGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKRAEEKALA1KERIGYPDDIVS
NDNKLNNEYLELNYKEDEYFENIIQNLKFSQSKQLKKLREKVDKDEWISGAAVVN
AFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGHEITHGFDDNGRNFNKD
GDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGINTLGENIADNG
GLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQVWCGTYRPEYAVNSI
KTDVHSPGNFRIIGTLC NSAEFSEAFHCRKNSYMNPEKKCRVW
SE(5 ID NO 12
完整融合蛋白Fc-IDE的氨基酸序列ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ簡TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEKNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMRYRLAWLLHPALPSTFRSVLGARLPPPERLCGFQKKTYSKMNNPAIKRIGNHITKSPEDKREYRGLELANGIKVLLMSDPTTDKSSAALDVHIGSLSDPPNIAGLSHFCEHMLFLGTKKYPKENEYSQFLSEHAGSSNAFTSGEHTNYYFDVSHEHLEGALDRFAQFFLCPLFDESCKJDREVNAVDSEHEKNVMNDAWRLFQLEKATGNPKHPFSKFGTGNKYTLETRPNQEGIDVRQELLKFHSAYYSSNLMAVCVLGRESLDDLTNLVVKLFSEVENKNVPLPEFPEHPF卿HLKQLYKIVPIKDIRNLYVTFPIPDLQKYYKSNPGHYLGHLIGHEGPGSLLSELKSKGWVNTLVGGQKEGARGFMFFI雨DLTEEGLLHVEDIILHMFQYIQKLRAEGPQEWVFQECKDLNAVAFRFKDKERPRGYTSKJAGILHYYPLEEVLTAEYLLEEFRPDLIEMVLDKLRPENVRVAIVSKSFEGKTDRTEEWYGTQYKQEAIPDEVIKKWQNADLNGKFKLPTKNEFIPTNFEILPLEKEATPYPALIKDTVMSKLWFKQDDKKKKPKACLNFEFFSPFAYVDPLHCNMAYLYLELLKDSLNEYAYAAELAGLSYDLQNTIYGMYLSVKGYNDKQPILLKKIIEKMATFEIDEKRFEIIKEAYMRSLNNFRAEQPHQHAMYYLRLLMTEVAWTKDELKEALDDVTLPRLKAFIPQLLSRLHIEALLHGNITKQAALGIMQMVEDTLIEHAHTKPLLPSQLVRYREVQLP
DRGWFVYQQRNEVHNNCGIEIYYQTDMQSTSENMFLELFCQIISEPCFNTLRTKEQ
LGYIVFSGPRRANGIQSLRFIIQSEKPPHYLESRVEAFLITMEKSIEDMTEEAFQKHIQ
ALAIRRLDKPKKLSAECAKYWGEIISQQYNFDRDNTEVAYLKTLTKEDIIKFYKEM
LAVDAPRRHKVSVHVLAREMDSCPVVGEFPCQNDINLSQAPALPQPEVIQ画TEF
KRGLPLFPLVKP画FMAAKL
SEQ ID NO 13
完整融合蛋白Fc-ECEl的氨基酸序列
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVC F
NWYVDGVEVHNAKTKPREEGFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL
PAPIEKT1SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG
QPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKQYQTRSPSVCLSEACVSVTSSILSSMDPTVDPCHDFFSYACGGWIKANP
VPDGHSRWGTFSNLWEHNQAIIKHLLENSTASVSEAERKAQVYYRACMNETRIEE
LRAKPLMELIERLGGWNITGPWAKDNFQDTLQVVTAHYRTSPFFSVYVSADSKNS
NSNV1QVDQSGLGLPSRDYYLNKTENEKVLTGYLNYMVQLGKLLGGGDEEAIRPQ
MQQILDFETALANITIPQEKRRDEELIYHKVTAAELQTLAPAINWLPFLNTIFYPVE1
NESEPIVVYDKEYLEQISTLINTTDRCLLNNYMIWNLVRKTSSFLDQRFQDADEKF
MEVMYGTKKTCLPRWKFCVSDTENNLGFALGPMFVKATFAEDSKS1ATE1ILEIKK
AFEESLSTLKWMDEETRKSAKEKADAIYNMIGYPNFIMDPKELDKVFNDYTAVPD
LYFENAMRFFNFSWRVTADQLRKAPNRDQWSMTPPMVNAYYSPTKNEIVFPAGIL
C APFYTRSSPKALNFGGIGVVVGHELTHAFDDQGREYDKDGNLRPWWKNSSVEA
FKRQTECMVEQYSNYSVNGEPVNGRHTLGENIADNGGLKAAYRAYQNWVKKNG
AEHSLPTLGLTNNQLFFLGFAQVWCSVRTPESSHEGLITDPHSPSRFRVIGSLSNSKE
FSEHFRCPPGSPMNPPHKCEVWSEQ ID NO 14
完整鼠融合蛋白Fc-中性溶酶的氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDVPRDCGCKPCICTVPPVSSVFIFPPKPKDVLTITLT
PKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFASTFRSVSELPIMHQD
WLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCM
ITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTF
TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKYDDGICKSSDCIKSAARLIQNMDASVEPCTDF
FKYACGGWLKRNVIPETSSRYSNFDILRDELEVILKDVLQEPKTEDIVAVQKAKTL
YRSCINESAIDSRGGQPLLKLLPDIYGWPVASDNWDQTYGTSWTAEKSIAQLNSKY
GKKVLINFFVGTDDKNST卿IHFDQPRLGLPSRDYYECTGIYKEACTAYVDFMIS
VARLIRQEQSLPIDENQLSLEMNKVMELEKEIANATTKPEDRNDPMLLYNKMTLA
KLQNNFSLEVNGKSFSWSNFTNEIMST雨NIQNEEEVWYAPEYLTKLKPILTKYS
PRDLC NLMSWRFIMDLVSSLSRNYKESRNAFRKALYGTTSETATWRRCANYVNG
刚ENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKKKAEE
KALAHCERIGYPDDHSNENICLNMEYLELNYREDEYFENIIQNLICFSQSKQLKKLRE
KVDKX)EWISGAAVVNAFYSSGRNQIVFPAGILQPPFFSAQQSNSLNYGGIGMVIGH
EITHGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSANNFKDQSQCMVYQYGNFSWDLAGG
QHLNGINTLGENIADNGGIGQAYRAYQNYVKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFA
QVWCGTYRPEYAVNSIKTDVHSPGNFRIIGTLQNSAEFADAFHCRKNSYMNPERK
CRVW
SEQ ID NO 15
人类淀粉样P肽1-38的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQICLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
SEG ID NO 16
人类淀粉样(3肽1-39的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAHGLMVGGV
SEQ ID NO 17
人类淀粉样(3肽1-40的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAnGLMVGGVVSEQ ID NO 18
人类淀粉样P肽1-41的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVI
SEQ ID NO 19
人类淀粉样|3肽1-42的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHH(3KLWFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
SEQ ID NO 20
人类淀粉样(3肽1-43的氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGUvTVGGWIAT
权利要求
1.一种具有式M-A的融合蛋白，能够在淀粉样β肽氨基酸序列中一个或更多个切割位点降解所述淀粉样β肽，其中M是延长所述融合蛋白的半衰期的蛋白质成分，A是切割所述淀粉样β肽的蛋白质成分，其中所述M蛋白质成分共价地连接到A蛋白质成分的N-末端部分。
2. 根据权利要求1的融合蛋白，其中A是蛋白酶。
3，根据权利要求2的融合蛋白，其中A是人类中性溶酶。
4. 根据权利要求3的融合蛋白，其中所述中性溶酶是细胞外的中 性溶酶。
5. 根据权利要求4的细胞外的中性溶酶，包含根据SEQIDNO: 1、 2、 3或4的任一个的氨基酸序列。
6. 根据权利要求2的融合蛋白，其中A是胰岛素降解酶。
7. 根据权利要求2的融合蛋白，其中A是内皮素转化酶1。
8. 根据权利要求1的融合蛋白，其中A是支架蛋白质。
9. 根据权利要求1到8的任一项的融合蛋白，其中M是抗体的 Fc部分。
10. 根据权利要求9的融合蛋白，其中所述抗体是IgG抗体。
11. 根据权利要求9的融合蛋白，其中所述抗体是IgG2抗体。
12. 根据权利要求1的融合蛋白，其中M是来自IgG2抗体的Fc 部分，并且A是细胞外的中性溶酶。
13. 根椐权利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 11的氨 基酸序列。
14. 根据权利要求1的融合蛋白，其中M是来自IgG2抗体的Fc 部分，并且A是胰岛素降解酶。
15. 根椐权利要求1的融合蛋白，包含根椐SEQIDNO: 12的氨基酸序列。
16. 根据权利要求1的融合蛋白，其中M是来自IgG2抗体的Fc 部分，A是内皮素转化酶1。
17. 根椐权利要求1的融合蛋白，包含根据SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。
18. 根据权利要求1到8的任一项的融合蛋白，其中M选自PEG 化和糖基化。
19. 根据权利要求1到8的任一项的融合蛋白，其中M是HSA。
20. 根据权利要求1到8的任一项的融合蛋白，其中M是HSA 结合结构域。
21. 根据权利要求1到8的任一项的融合蛋白，其中M是抗体结 合结构域。
22. 根据权利要求1的融合蛋白，其中M和A通过接头L连接 在一起。
23. 根据权利要求22的融合蛋白，其中L选自肽和化学接头。
24. —种降低淀粉样|3肽浓度的方法，所述方法包括施用根据权 利要求1到23的任一项的融合蛋白。
25. 根据权利要求24的方法，其中在血浆中实现淀粉样P肽的降低。
26. 根椐权利要求24的方法，其中在CSF中实现淀粉样|3肽的 降低。
27. 根据权利要求24的方法，其中在CNS中实现淀粉样P肽的 降低。
28. —种能够降解淀粉样|3肽的药物组合物，包括药学上可接受 量的、根据权利要求1到23的任一项的融合蛋白以及药学上可接受 的栽体或赋形剂。
29. —种预防和/或治疗其中淀粉样p肽的降解是有益的的状况的 方法，包括向需要这种预防和/或治疗的哺乳动物，包括人，施用治疗 有效量的根据权利要求1到23的任一项的融合蛋白。
30. —种预防和/或治疗阿尔茨海默氏病、系统性淀粉样变性或脑 淀粉样血管病的方法，包括向需要这样的预防和/或治疗的哺乳动物， 包括人类，施用治疗有效量的根椐权利要求1到23的任一项的融合 蛋白。
31. 根据权利要求1到23的任一项的融合蛋白，其用于医学治疗。
32. 根据权利要求1到23的任一项的融合蛋白在制造药物中的用 途，所述药物用于其中淀粉样P肽的降解是有益的的状况的预防和/ 或治疗。
33. 根据权利要求1到23的任一项的融合蛋白在制造药物中的用 途，所述药物用于阿尔茨海默氏病、系统性淀粉样变性或脑淀粉样血 管病的预防和/或治疗。
34. 根据权利要求32或33的用途，其中所述药物降低淀粉样P 肽浓度。
35. 根据权利要求34的用途，其中在血浆中实现所述淀粉样卩肽 的降低。
36. 根据权利要求34的用途，其中在CSF中实现所述淀粉样p 肽的降低。
37. 根据权利要求34的用途，其中在CNS中实现所述淀粉样(3 肽的降低。
全文摘要
本发明涉及融合蛋白和它们在阿尔茨海默氏病患者的酶治疗中的用途。所述融合蛋白具有式M-A，能够在淀粉样β肽的氨基酸序列中一个或更多个切割位点降解淀粉样β肽，其中M是延长融合蛋白的半衰期的蛋白质成分，并且A是切割淀粉样β肽的蛋白质成分。
文档编号A61K47/48GK101668545SQ200880010294
公开日2010年3月10日 申请日期2008年3月27日 优先权日2007年3月28日
发明者C·安德松, P·-O·弗雷斯克加德 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司