专利名称：：用于治疗失禁的组织块组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于治疗失禁的组合物。更具体地讲，本发明涉及包括活的肌肉组织块和载体的用于治疗失禁的组合物。
背景技术：
：软组织(例如，血管、皮肤或肌肉骨骼组织)损伤十分常见。许多这类疾病发生在没有系统性疾病的情况下，并且是慢性复发性低度损伤和使用过度的结果。一个非常常见的软组织损伤的实例是失禁。失禁是指任何类型的尿液或粪便不自主流出的疾病。失禁会造成窘迫并导致社交孤立、抑郁和生活质量丧失，并且是老年人群养老院化的主要原因。失禁有几种类型，包括急迫性失禁或急迫性尿失禁、压力性失禁或压力性尿失禁、满溢性失禁，以及混合性失禁或混合性尿失禁。混合性失禁或混合性尿失禁是指患者患有不止一种形式的尿失禁(如压力性失禁和急迫性失禁)的情形。患者对有效的药物治疗，尤其是对混合性失禁和压力性尿失禁(SUI)的医疗需求^f艮强烈。这种强烈的医疗需求是缺乏有效的药物治疗和患者人数众多的共同结果。最近的评估报告显示，美国患有SUI的人数达1800万，其中妇女占绝大多数。在膀胱没有收缩或没有过度膨胀的情况下，通过观察腹部压力增大的同时的尿液流失情况，可以确认是否患有压力性失禁。压力性失禁的情况可以归类为尿道过度活动或固有括约肌缺陷。在尿道过度活动的情况下，膀胱颈和尿道在咳嗽或紧张时下垂，同时尿道口张开，并有明显的尿液漏出(漏尿点压力为60-120cmH2O)。在固有括约月几缺陷的情况下，膀胱颈在膀胱充满而不收缩期间会张开。出现明显漏尿时压力极小或没有压力。膀胱颈和尿道下垂反复不定，很多情况下甚至不下垂，并且漏尿点压力较低(〈60cmH20)。(J.G.Blaivas,1985,Urol.Clin.N.Amer.,12:215-224;D.R.Staskin等人，1985,Urol.Clin.N.Amer.,12:271-278)。急迫性失禁的定义是与急迫而强烈的排尿欲望有关的尿液不自主流失。虽然膀胱不自主收缩可能与神经系统疾病有关，但它们也可能发生在神经系统表现正常的个体身上(P.Abrams等人，1987,Neurol.&Urodynam.,7:403-427)。与急迫性失禁相关的常见神经系统障碍有中风、糖尿病和多发性硬化症(E.J.McGmre等人，1981,J.Urol.,126:205-209)。急迫性失禁是由逼尿肌不自主收缩引起，逼尿月几不自主收缩也可能是由于膀胱炎症和逼尿肌收缩性减弱所引起，逼尿肌收缩性减弱时，膀胱不能完全排空。满溢性失禁的特征在于尿液流失与膀胱过度膨胀有关。满溢性失禁可能是由于膀胱收缩性减弱或导致过度膨胀和溢流的膀胱出口阻塞所引起。膀胱可能会因诸如糖尿病或脊髓损伤之类的神经系统病症或在接受盆腔根治性手术后处于继发性活跃状态。尿失禁(急迫性和满溢性尿失禁)的另一个常见的重要原因是膀胱收缩性减弱。这是一种在老年人群和神经系统疾病(尤其是糖尿病)患者中越来越常见的病症。(N.MResnick等人，1989,NewEngl.J.Med,320:1-7;M.B.Chancellor和J.G.Blaivas,1996,AtlasofUrodynamics，WilliamsandWilkins,Philadelphia,Pa.)。收缩性不足时，膀胱无法排空其中的尿液；这不仅会导致失禁，而且还会造成尿路感染和肾功能不全。目前，临床医师在治疗逼尿肌收缩能力减弱方面的能力非常有限。还没有有效的药物能够改善逼尿肌的收缩性。虽然乌拉胆碱可以略微增加膀胱内压，但在对照研究中还没有显示出该物质可以帮助膀胱有效排空(A.Wein等人，1980,J.Urol.,123:302)。最常见的治疗方法是通过间歇导尿或留置导尿回避这个问题。针对压力性尿失禁有很多治疗手段。目前最常见的治疗压力性失禁的方法包括下列几种吸收性产品；留置导尿；子宫托(即设置用以支撑月旁胱颈的阴道环)；以及药物(AgencyforHealthCarePolicyandResearch.PublicHealthService:UrinaryIncontinenceGuidelinePanel.UrinaryIncontinenceinAdults:ClinicalPracticeGuideline.AHCPRPub.No.92-0038.Rockville,Md.U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,March1992;M.B.Chancellor,EvaluationandOutcome.In:TheHealthofWomenWithPhysicalDisabilities:SettingaResearchAgendaforthe90's.Eds.KrotoskiD.M.,Nosek,M.,Turk,M.,BrooksPublishingCompany,Baltimore,Md.,Chapter24,309-332,1996)(美国公共卫生署卫生保健政策研究所尿失禁指导小组，《成人尿失禁临床实践指南》，AHCPR出版号No.92-0038,马里兰州罗克维尔，美国卫生及公共月l务部，1992年3月；M.B.Chancellor,《"残疾妇女的健康为90年代设定研究方向，，研讨会评《介与收获》，编者KrotoskiD.M.、Nosek,M.和Turk,M.，布鲁克斯出版社，第24章第309-332页，1996年)。运动是另一种压力性尿失禁治疗方式。例如，凯格尔运动(Kegdexercise)是一种常见的治疗压力性失禁的流行方法。对于在3-6个月内每日进4亍四次这项运动的患者来说，他们中有一半会受益于该运动。虽然50%的患者声称通过凯格尔运动病情有所改善，但采用凯格尔运动的失禁治愈率只有5%。此外，由于疗程时间太长，并且需要每日坚持，大多数患者都会停止这项运动并放弃该方案。治疗尿失禁的另一种方法是使用尿道栓。尿道栓是一种用于治疗妇女压力性失禁的一次性塞状物。遗憾的是，尿道栓与超过20%的尿路感染有关；更为遗憾的是，尿道栓不能治愈失禁。使用阴道探头的生物反馈和功能性电刺激方法也可用于治疗急迫性和压力性尿失禁。然而，这些方法耗时且昂贵，并且结果也只是略好于凯格尔运动。外科手术也可用于治疗压力性尿失禁，例如腹腔镜膀胱颈悬吊术或开腹膀胱颈悬吊术；经阴道膀胱颈悬吊术；人工尿道括约肌手术(复杂而昂贵的外科手术，二次手术率为40%)。其他治疗方法包括采用外源可注射物质(例如硅氧烷、碳涂敷颗粒、特氟隆、胶原)和自体同源脂肪的尿道内注射方法。这些可注射物质中的每一种都有其缺点。授予Berg的美国专利No.5,007,940、5,158,573和5,116,387报道了包含离散的聚合物本体和硅橡胶本体的生物相容性組合物，此类组合物可以注射到尿道组织内，用以通过组织填充治疗尿失禁。此外，授予Lawm的美国专利No.5,451,406报道了包含碳涂敷颗粒基底的生物相容性组合物，此类组合物可以注射到组织(例如尿道组织和膀胱颈组织以及覆盖尿道和膀胱颈的组织)内，用以通过组织填充治疗尿失禁。与组织填充方法或治疗有关的一种担忧或不良后果涉及填充剂内的固体颗粒从原始置入位置迁移至身体各个器官内的可贮藏部位，以及随后组织对过小颗粒的慢性炎性反应。这些不利影响在泌尿学文献，具体地讲在下列文献中有所报道Malizia,A.A.等人，"MigrationandGranulomatousReactionAfterPeriurethralInjectionofPolytef(Teflon)(尿道周注射聚四氟乙烯(特氟隆)后的迁移和肉芽肿性反应)"，JAMA,251:3277-3281(1984)和Claes,H.、Stroobants,D.等人，"PulmonaryMigrationFollowingPeriurethralPolytetmfluoroethyleneInjectionForUrinaryIncontinence(尿道周注射聚四氟乙烯治疗尿失禁后的肺部迁移)"，J.Urol.,142:821-822(1989)。确保不会发生迁移的重要因素是植入适当尺寸的颗粒。如果颗粒太小，则它们可能会被身体的白细胞(吞噬细胞)吞噬并携带到远处的器官，或者可能会在血管系统中运送直至它们到达具有更大约束作用的部位。颗粒沉积的靶器官包括肺、肝脏、脾、脑、肾和淋巴结。授予Wallace等人的美国专利No.4,803,075中公开了在具有生物相容性润滑剂的含水介质中使用小直径球状颗粒的情况。虽然这些材料显示了积极的短期增大效果，但这种效果持续时间4艮短，因为这些材料往往会迁移和/或4皮宿主组织吸收。胶原注射通常采用牛胶原，这种材料的吸收时间为4-6个月，因此需要反复注射。胶原的另一个缺点是大约5%的患者对牛胶原过敏，并且还会产生抗体。作为可注射填充剂的自体同源脂肪移植物具有明显的缺点，因为注射的大部分脂肪会被再吸收。此外，人们对自体同源脂肪移植物的存活范围和时间存在争议。移植处通常会出现炎性反应。脂肪移植术的并发症包括脂肪再吸收、结瘤和组织不对称。最近提出的采用工程肌源细胞的肌肉细胞注射疗法可能会提供用于治疗失禁(尤其是压力性尿失禁)和改善排尿节制的备选方法。优选地，肌源细胞注射可以是自体同源的，以使得过敏反应非常小或无过敏反应。肌纤维的前体即成肌细胞为单核肌细胞，其在许多方面不同于其他类型的细胞。成肌细胞自然融合后形成有丝分裂后多核肌管，因而可以用于长时间表达和递送生物活性蛋白质(T.A.Partridge和K.E.Davies,1995,Brit.Med.Bulletin,51:123-137;J.Dhawan等人，1992,Science,254:1509-1512;A.D.G醒ell,1994,In:Myology.第2版，EngelAG和ArmstrongCF编著,McGraw-Hill,Inc,303-304;S.Jiao和J.A.Wolff,1992,BrainResearch,575:143-147;H.Vandenburgh,1996,HumanGeneTherapy,7:2195-2200)。使用成肌细胞来治疗肌肉退变以修复组织损伤或治疗疾病在美国专利No.5,130,141和5,538,722中有所公开。此外，成肌细胞移植也被用于修复心肌功能障碍(S.W.Robinson等人，1995,CellTransplantation,5:77-91;C.E.Murry等人，1996,J.Clin.Invest.,98:2512-2523;S.Gojo等人，1996,CellTransplantation,5:581-584;A.Zibaitis等人，1994,TransplantationProceedings,26:3294)。使用成肌细胞来治疗尿失禁在美国专利No.6,866,842以及下列文献中有所公开Transplantation.2003Oct15;76(7):1053-60;JUrol.2001Jan;165(1):271.和YokoyamaT.J,.Urology,165:271-276,2001。专利申请WO2004055174公开了培养基组合物、培养方法和获得的成肌细胞及其用途。利用肌源祖细胞进行的软组织和骨骼扩增与填充、组合物以及治疗方法在WO0178754中有所公开。对哺乳类动物疾病进^亍成"几细胞疗法在US9909451中有所7>开。虽然细胞疗法具有优于其他注射法的优点，^旦也存在4支大缺点。与使用成肌细胞治疗压力性尿失禁有关的最大局限性之一是成肌细胞需要3-4周的冗长体外培养才能获得注射所需的细胞数量，这使得这种疗法非常昂贵并且令许多患者难以承担。筌于治疗尿失禁及膀胱收缩性问题的上述局限性和并发症，本领域需要在这方面提供新的有效的替代疗法。
发明内容本发明为包含活肌肉组织块和载体的用于治疗失禁的组合物。该组合物包含至少一种活月几肉组织块，该活肌肉组织块具有至少一种可以,人该组织块迁移至移才直部4立以形成新组织的活细力包。活H几肉组织块可以得自自体同源的组织、异源组织或异种组织。载体包括但不限于生理缓冲溶液、可注射凝力交溶液、生理盐水和水。该组合物可用于治疗失禁，方法是将组合物注入泌尿生殖组织(例如尿道、尿道括约肌和膀胱)内以治疗尿失禁，以及将其注入结直肠组织(例如结肠、直肠和结直肠括约月几)内以治疗大便失禁。具体实施例方式活肌肉组织块可以得自自体同源组织、异源组织或异种组织。在一个实施例中，活肌肉组织块得自自体同源组织。该肌肉组织在无菌条件下获得。活肌肉组织可以使用多种常规技术中的任何一种获得，这些技术包括活组织检查或其他外科组织去除技术。获得活肌肉组织之后，可7随即在无菌条件下将组织弄碎。此外，可以在本领域普通技术人员已知的任何标准细胞培养基内，在存在或不存在血清的情况下弄碎组织。活肌肉组织块的大小可以在约0.1至约3mm3的范围内，但优选的是，活月几肉组织块的大小为约0.1至约lmm3。本发明的组合物还包含载体。载体为生物相容性的，并且具有足以方便注射的物理特性。载体包括但不限于生理緩冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水和水。生理緩冲溶液包括但不限于緩冲盐水、磷酸盐緩冲溶液、Hank平衡盐溶液、Tris緩冲盐水和Hepes緩冲盐水。在一个实施例中，生理緩冲溶液为Hank平衡盐溶液。可注射的凝胶溶液可以在注射前以凝胶形式存在，或者可以在施用后凝为胶体并保持位置不变。可注射的凝力交溶液由水、生理盐水或生理緩冲溶液和力交凝材料构成。胶凝材料包括但不限于蛋白质，例如胶原、弹性蛋白、凝血酶、纤粘蛋白、明胶、纤维蛋白、弹性蛋白原、多肽、层粘连蛋白、蛋白聚糖、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、富血小板血浆(PRP)凝块、贫血小板血浆(PPP)凝块、自组装肽水凝胶和去端肽胶原；多糖，例如果胶、纤维素、氧化纤维素、曱壳质、脱乙酰壳多糖、琼脂糖、透明质酸；多核苷酸，例如核糖核酸、脱氧核4唐核酸；以及其他物质，例如海藻酸盐、交联海藻酸盐、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)共聚物、聚(乙歸醇)、聚丙烯酸酯、单硬脂酸甘油-共-琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物以及它们的组合。在一个实施例中，组合物还包括微粒。本领域的技术人员也把微粒称为微珠或微球。微粒既提供临时的填充作用，又提供活肌肉组织块可以在其上粘附和生长的基底。微粒必须足够大，以避免注射后在局部或向远处迁移，同时又要足够小，以J吏得可通过皮下注射针施用。因此，;徵粒具有大体上为圆形的形状，其平均4黄截面尺寸在约100至约1,000微米的范围内，优选在约200至约500微米的范围内。微粒优选由生物相容性聚合物形成。生物相容性聚合物可以为合成聚合物、天然聚合物或它们的组合。如本文所用，术语"合成聚合物"是指自然界中不存在的聚合物，即使该聚合物是由天然存在的生物材料制成。术语"天然聚合物，，是指天然存在的聚合物。生物相容性聚合物也可以是可生物降解的。可生物降解的聚合物在接触潮湿的身体组织时容易分解成小片段。这些片段随后会被身体吸收或排泄。更具体地讲，由于可生物降解的片段被身体吸收或排泄，使得体内不会永久性保留痕量或残余片段，因此不会引起永久性的慢性异物反应。在一个实施例中，微粒由至少一种合成聚合物构成。合适的生物相脂族聚醋r聚氨基酸、共聚酸醋、^亚坑基草酸醋、、￡醜胺、:A酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚胺碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含有胺基团的聚氧杂酯、聚酸肝、聚磷腈、聚富马酸二羟丙酯、聚氨酯、聚酯型聚氨酯、聚醚型聚氨酯。用于本发明的合适的合成聚合物还可以包括基于在下列物质中发现的序列的生物合成聚合物胶原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、弹性蛋白、凝血酶、纤粘蛋白、淀粉、聚氨基酸、明胶、海藻酸盐、果胶、纤维蛋白、氧化纤维素、甲壳质、脱乙酰壳多糖、弹性蛋白原、透明质酸、丝綢、核糖核酸、脱氧核糖核酸、多肽、蛋白质、多糖、多核香酸以及它们的组合。为了本发明的目的，脂族聚酯包括但不限于如下单体的均聚物和共聚物丙交酯(其包括乳酸、D-丙交酯、L-丙交酯和内消旋丙交酯)；乙交酯(包括乙醇酸)；p-己内酯；对二氧杂环已酮(l,4-二氧六环-2-酮)；三亚曱基碳酸酯(l,3-二氧杂环己烷-2-S同)；三亚曱基碳酸酯的烷基衍生物；以及它们的共混物。本发明所用的脂族聚酯可以为具有直链、支链或星型结构的均聚物或共聚物(无规、嵌段、片段、锥形嵌段、接枝、三嵌段等)。在骨骼包括至少一种天然聚合物的实施例中，合适的天然聚合物的例子包括但不限于纤维蛋白基材料、胶原基材料、透明质酸基材料、糖蛋白基材料、纤维素基材料、丝绸以及它们的组合。本领域技术人员将会知道，选择合适的材料来形成生物相容性微粒取决于多个因素。这些因素包括体内机械属性；细胞对材料在细胞附着、增殖、迁移和分化方面的响应；以及任选地生物降解动力学。其他相关因素包括化学组成、组分的空间分布、聚合物的分子量以及结晶度。在另一个实施例中，可以在本发明的组合物中4参入生物效应物。生物效应物会促进受影响组织的愈合和/或再生(如生长因子和细胞因子)、防止感染(如抗微生物剂和抗生素)、减轻炎症(如抗炎剂)、防止或最大限度减少粘结的形成(如氧化再生纤维素(例如得自Ethicon,Inc.的INTERCEED和Surgicel)和透明质酸)以及抑制免疫系统(如免疫抑制剂)。肽、抗体、酶、糖蛋白、激素、细胞因子、糖胺聚糖、核酸、镇痛剂。应当理解，可以在组合物内掺入一种或多种相同或不同功能的生物效应物。人们已经知道，异源或自体同源的生长因子可以促进受伤或受损组织的愈合和/或再生。示例的生长因子包括但不限于TGF-P、骨形态发生蛋白质、生长分化因子-5(GDF-5)、软骨源性形态发生蛋白质、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、血管内皮细胞源生长因子(VEGF)、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、肝细胞生长因子以及它们的片段。合适的效应物同样包括上述药剂的激动剂和拮抗剂。糖胺聚糖是带多电荷的多糖，其在细胞粘附方面起作用。可用作生物效应物的示例性糖胺聚糖包括但不限于硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质素(也称为透明质酸)以及它们的组合。生物效应物也可以为酶，例如基质消化酶，这种酶有利于细胞突破细胞外基质的包围向外迁移。合适的基质消化酶包括但不限于胶原酶、软骨素酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、肽酶、嗜热菌蛋白酶、基质金属蛋白酶和蛋白酶。本领域的普通技术人员将会知道，合适的生物效应物可以由外科医生根据医学原理和适用的治疗对象来确定。组合物中的生物效应物的量会根据多种因素而变化，其中包括给定专利申请中的因素，例如促进细胞存活、增殖、分化或有利于和/或加速组织愈合。生物效应物可以在将由活肌肉组织块和载体组成的组合物施用至组织伤口区域之前或之后才参入到该组合物中。本文所述用于治疗失禁的组合物可以通过这样制备首先用合适的采集工具从供体(自体同源、异源或异种供体)获得肌肉组织样本。然后在采集组织时将肌肉组织样本切碎并分割成小块，或者作为另外一种选^奪，在从身体收获和采集之后将肌肉组织样本切石争。在组织样本在收获后切碎的实施例中，可以将组织样本称重，然后在磷酸盐缓冲盐水中洗三遍。然后在HamF12培养基内在存在少量(例如约lml)生理緩沖溶液(例如磷酸盐緩冲盐水)或基质消化酶(例如0.2%的胶原酶)的情况下将大约100至500mg组织切碎成小块。将肌肉组织切碎成大约0.1至lmm3大小的小块。切碎组织可通过多种方法完成。在一个实施例中，使用两把无菌手术刀在平行和相对方向切割来完成切碎，在另一个实施例中，可以用能够自动将组织分成所需尺寸的颗粒的加工工具将组织切碎。在一个实施方案中，可使用本领域普通技术人员已知的多种方法中的任意方法将组织糜从生理流体中分离出来并浓缩，所述方法为例如篩分法、沉淀法或离心法。在一些组织糜一皮过滤并浓缩的实施方案中，组织糜悬浮液优选在悬浮液中保持少量流体，防止组织变干。活肌肉组织块的悬浮液与本文所述载体(任选与微粒)混合，并且通过注射递送到需进行组织l奮复的部位。此外，在注射到需进4亍组织修复的部位之前，可以将生物效应物添加至含有或不含有摆i粒的组合物中。本文所述组合物可用于处理软组织。软组织通常是指在整个身体上发现的骨外结构，包括但不限于牙周组织、皮肤组织、血管组织、肌肉组织、筋膜组织、眼组织、心包组织、肺组织、滑膜组织、神经组织、肾组织、食道组织、泌尿生殖组织、肠组织、结直肠组织、肝组织、胰腺组织、脾组织、脂肪组织以及它们的组合。优选地，本文所述组合物可用于处理泌尿生殖组织(例如尿道、尿道纟舌约肌和膀胱)、食道组织(例如食道和食道括约月几)以及结直肠组织(例如结肠、直肠和结直肠括约"几)。该组合物还可以用于组织填充、组织增大、美容治疗、治疗处理和组织封闭。以下是制备用于治疗失禁的组合物的非限制性实例。使用常规外科技术以常规方式对患者进行组织修复手术准备工作。采用常规组织样本采集工具和技术从患者身体获取用于形成组合物的肌肉组织样本。将肌肉组织样本切碎并分割成粒度为约0.1至约3mm3的活肌肉组织块。使用常规的切石争技术切石年组织，例如用两把无菌手术刀沿相对的平4亍方向切割。在存在约lml生理緩冲溶液的情况下，切-f约100至500mg组织，所需组织数量取决于修复部位组织的损伤程度。将活肌肉组织块过滤和/或浓缩，以使之与生理緩冲溶液分离。通过离心浓缩活肌肉组织块。然后将活肌肉组织块与Hank平衡盐溶液载体(任选与微粒)混合，然后注射进组织修复部位。可以使用套件来辅助制备组合物。该套件包括采集工具、无菌容器(其容纳用于保持组织活性的试剂)、加工工具、载体和递送装置。采集工具用于从受试者获取活肌肉组织。该组织可以置ii于含有保持组织活性的试剂的无菌容器内。用于保持组织样本活性的合适试剂包括但不限于生理盐水、磷酸盐緩沖溶液、Hank平衡盐水、标准细胞培养基、达尔伯克改良型伊4各尔培养基(Dulbecco'smodifiedEagle'sMedium)、抗坏血酸、HEPES、非必需氨基酸、L-脯氨酸、自体同源血清以及它们的组合。加工工具用于将组织切石f成活月几肉组织块，或者作为另外一种选择，可对采集工具进行改造，以采集组织样本并将其加工成细小的组织颗粒。如本文所述，载体可以为生理i爰冲溶液、可注射凝胶溶液、生理盐水或水，并且也可以任选地包括微粒。递送装置使得载体内的活组织块能沉积到患病组织中，例如尿道括约肌附近或周围的《且织。实例1在压力性尿失禁(SUI)大鼠模型中，检测了基于施用活肌肉组织块组合物的新型疗法对恢复漏尿点压力(LPP)的功效。活肌肉组织块来自雄鼠的骨骼肌。将共24只雌性Lewis大鼠随机分配到3组(每组8只)中的l组，即无失禁动物、注射载体的失禁动物和注射载体+活的碎组织块的失禁动物。对后两组施行双侧阴部神经切断术(PNT),以导致SUI。术后一周，通过尿道内注射对每组动物进行治疗。5周后，对每只大鼠的LPP测量至少4次，并确定平均值。动物护理本研究所用动物4要照"FinalRulesoftheAnimalWelfareActregulations(9CFR)(动物福利法规最终条例(CFR第9篇))"、PublicHealthServicePolicyonHumaneCareandUseofLaboratoryAnimals(关于人性化护理和^使用实^r动物的公共卫生月l务政策)和GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals(实-验动物护理和-使用指南)中的所有适用章节进4亍处理和飼养。在开始上述手术前，由TestingFacilityInstitutionalAnimalCareandUseCommittee(实-睑室才几构动物护理和4吏或程序进行了审批。选择Lewis大鼠是因为其具有同基因表型。这使得能在不使用免疫抑制剂的情况下评估源自一只大鼠而被植入另一只大鼠的组合物的SUI治疗。动物被单独关养在微型隔离器内。通过设定环境控制器将温度保持在18。C至26。C(64。F至79。F),相对湿度为30%至70%。除了偶尔中断以进行研究步骤外，保持12小时光照、12小时黑暗的交替循环。动物房内保持用100%新鲜空气每小时换气10次或以上(不进行空气再循环)。为动物随意供应Purina认证的饲粮和过滤后自来水。才才—牛和方法动物。用先前确定的双侧阴部神经切断术(PNT)导致SUI。所有操作都在无菌条件下进行。使用2.5%-4%的异氟烷对大鼠诱发麻醉，并做好无菌手术准备工作。诱发之后，经鼻锥输入0.5-2.5%的异氟烷以保持麻醉。为了进行PNT手术，将臀部到尾基、尾部以上和后腿内侧以下区域的毛发刮掉，并让动物保持K卧姿势。通过背侧纵向切割，将坐骨直肠窝向两侧切开。利用头戴式手术放大镜，将阴部神经分离并切断。使用Nexaband液体局部组织粘结剂将切口合上。对无失禁动物组施4亍相同外科手术，不同的是实际上并不切断神经。制备组合物和给药。通过对三只雄性Lewis大鼠静脉注射过量的戊巴比妥纳(100mg/kg)使其安乐死。去除其四头肌组织。用手术刀将一块骨骼肌切成-争块，然后施用至300孩i:米细i包滤网上。用10mL注射器柱塞将碎块强行挤过滤网。用手术刀刀刃刮滤网下侧，然后将所得活肌肉组织块称重。将总共lg活肌肉组织块在3mL不含Ca"和Mg"的Hank平衡盐溶液(HBSS)(cat弁:14175-095Invitrogen，CA)中重新悬浮成均一的组合物。总组织浓度为0.3g/mL。将HBSS中悬浮的活肌肉组织糜装入100微升Hamilton注射器内，并用皮下注射针注入大鼠尿道内。在SUI致伤手术后一周，对动物进行治疗。将雌性大鼠麻醉，然后在每只大鼠尿道的2点钟和IO点钟位置共注射两剂(每剂IO微升)。对用载体治疗的动物以相同方式单独注射HBSS。漏尿点压力(LPP)测试。术后第5周，将大鼠麻醉并仰卧放置，手动排空膀胱，并使压力为零。随后在室温下通过耻骨上导尿管将膀胱充满生理盐水溶液(每小时5ml)。将耻骨上导尿管连接至注射器泵和压力传感器。所有膀胱压力均以膀胱水平处的空气压力为基准。将压力传感器信号放大并转化为数字信号，以便用ADInstruments的计算机软件PowerLab以每秒10个样本的速率采集计算机数据。手动緩慢增加腹压，直到出现漏尿为止，以达到膀胱峰值压力，这时迅速释放外部腹压。对每只大鼠进4亍至少四次LPP测试。使用Cred6方法排空膀胱，并在两次LPP测量间隔期间将其重新注满。4吏用ADInstruments压力传感器采集LPP数值，并且使用计算机软件PowerLabChartTM进行分析。经定性分析，将每只动物在LPP测试周期内的各个异常值确认为压力失真，并从研究中排除。压力结果失真的定义是，相比同一LPP测试周期内的其他压力结果，被视为人为偏高或偏低的压力值(mmHg)。在LPP测试过程中，可能会由多种方式产生压力失真，包括不小心用导尿管尖阻塞了膀胱粘膜壁或尿道；膀胱内的尿和/或生理盐水没有完全排空；测试时动物麻醉不够充分，导致其收缩膀胱。结果与讨论平均LPP和标准偏差在下面有4艮道。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结论数据显示，相比只注射载体的失禁动物，用活肌肉组织块治疗的失禁动物在4周后观察到功能得到改善。大约68%的无失禁动物的功能得到改善，表明比只注射载体的失禁动物的改善率高42%。数据表明，活肌肉组织块产生了明显优于载体治疗的改善，因而可以作为治疗压力'性尿失禁的手段。实例2在2种压力性尿失禁(SUI)大鼠模型中，对照检测了基于施用活肌肉组织块组合物的新型疗法对恢复漏尿点压力(LPP)的功效。活肌肉组织块组合物可以如实例1所述制备。2种可以对照的不同大鼠才莫型分别为通过双侧阴部神经切断术和尿道松解术导致失禁的大鼠。尿道松解术沖莫型由之前确定的方法形成。简而言之，将通过腹膜内注射开他每丈(60mg/kg体重)和曱苯噻。秦(5mg/kg体重)使动物麻醉。将动物仰卧置于水循环热敷垫上。按照标准手术程序在腹部做好手术准备，并盖上消毒盖布。沿下腹部中线切开，并识别膀胱和尿道。切割盆內筋膜，将尿道近端和远端沿四周分离，同时通过锐器解剖法将尿道从前阴道壁和耻骨上分离。应当小心别损坏输尿管或下膀胱血管。在阴道内插入棉签以帮助解剖。分别用4-0薇乔(Vicryl)缝线和4-0尼龙缝线缝合腹直肌筋膜和皮肤。每种损伤模型有3组，大鼠可随机分配到3组中的1组，即无失禁动物、注射载体的失禁动物和注射载体+活肌肉组织块的失禁动物。术后一周，通过尿道内注射对每组动物施用治疗剂。5周后，对每只大鼠测量5或6次LPP,并确定平均值。实例3关于将组合物施用至尿道内的各种路线的描述。注射组织糜的环尿道路线。将包含微粒的组织糜组合物分配进连接17GA针头的高压注射器内。将针头慢慢插入尿道口旁边的粘膜下组织内。确定针头的正确位置后，将悬浮液注射到尿道周围3个位置处2点钟、6点钟和10点钟位置。注射过程中，可以观察到尿道腔逐渐闭合，随后开口消失。为了确信成功，操作结束时应看到尿道粘膜完全附着(即接触)。可以注射1或2针管，以使尿道完全闭合。经尿道路线。直视下，使用特制针头从尿道粘膜下方注射组织糜组合物。将膀胱镜插入尿道中段。借助膀胱镜观察，将针尖小心插入到尿道粘膜之下。将组织糜准确植入粘膜下组织内，直到可以看见尿道粘膜完全接合。顺行路线。顺行路线专供前列腺切除术后失禁的雄性使用。在充分麻醉下制作耻骨上导管。优选进行全身麻醉。将柔性膀胱镜经耻骨上导管插入膀胱内。确定膀胱颈。借助膀胱镜观察，将针尖小心插入到膀胱颈粘膜之下。将组织糜制剂准确植入粘膜下组织内，直到可以看见膀胱颈完全接合。实例4通过经验证的尿失禁模型使大鼠尿失禁。从大鼠的骨骼肌(例如二头肌、三头肌或四头肌)上采集骨骼肌活组织，并将组织切碎成0.1-0.4mn^的碎块。将活组织块与所需体积的载体混合，这些载体例如为磷酸盐緩冲盐水(PBS)或HBSS或其他载体(例如胶原水溶液、透明质酸水溶液)和微载体(例如聚乙醇酸(PGA)或聚乳酸(PLA))。混合之后立即注射到失禁动物的尿道中段或膀胱颈内。在基线期和术后3-4周，对所有动物进行尿动力学测试。采集尿道组织进行器官浴槽等容研究，以测试尿道功能和免疫化学。实例5目的是证明可以从猪的骨骼肌上釆集自体同源的活肌肉组织块(大小〈lmm),将其与载体(PBS、HBSS、胶原水溶液、HA水溶液)混合并在超声控制下注射到尿道内。此外，该手术可用于评价作为治疗途经治疗尿失禁(尤其是压力性尿失禁)的本文所述组合物。骨骼肌样本可通过切开活检术获得。可以从每头猪获得大约100-500mg肌肉组织。将样本切成〈lmm3的碎块。将活肌肉组织块与载体和/或微粒混合。在经尿道超声探针和注射系统的帮助下，将样本注射到横紋括约肌和尿道粘膜内。可在注射前后测量尿道压力分布，以确定术后尿道闭合压力变化。术后还可以对获取自猪的样本进行组织学实-睑。实例6目的本实—验目的在于评价活肌肉组织块组合物对压力性尿失禁的治疗。活肌肉组织块可以用大小、细胞活性和通过各种规才各针头施用的难易度来表征。方法将取自四头肌的一块大鼠骨骼肌(大约lg)用手术刀切石争，然后施加至300微米的细胞滤网上。用10mL注射器柱塞将活肌肉组织块强行挤过滤网。用30mLPBS冲洗石f块，并将悬浮液以1600rpm离心5分钟制成粒料。将粒料在500微升PBS中重新悬浮，并且进一步表征。平均粒度分布的范围是100-300微米(大约0.1-lmm3)。偶尔会观察到较长的碎块(〉lmm3)。还测试了该组合物通过各种规格针头注射的难易度。试验了三种规才各的针头18GA、21GA和25GA。组织块悬浮液可以轻+>通过所有针头，甚至是25GA针头。此外，未观察到结块/堵塞现象。每次穿过针头后，都还要在显微镜下对组合物样本进行分析，均未观察到混合物扰动/腐蚀现象，这说明组织块经历的是无阻挡的流动。实例7按照上述实例中详述的方法从相关来源采集骨骼肌或组织活体。将活体组织切石争成细糊状，以形成活肌肉组织块。如上述实例所述，将碎块与所需体积的载体(任选与微粒)混合，并使用本领域已知的技术将碎块注射到肛门内括约肌或肛门外括约肌内，以治疗大便失禁。实例8按照上述实例中详述的方法从相关来源采集骨骼肌或组织活体。将活体组织切碎成细糊状，以形成活肌肉组织块。如上述实例所述，将碎块与所需体积的载体(任选与微粒)混合，并使用本领域已知的技术将石,块注射到下食道括约肌和/或幽门括约月几内，以治疗酸反流和其他消化系统相关疾病。实例9从Farm-to-Farm(Warren,NJ)采购新鲜的猪骨餘肌样本。用一对手术刀将样本手动切碎。使骨格肌组织糜推挤通过300(L3-50,ATMProducts)或425(L3-40,ATMProducts)微米钢目筛网来进一步粉碎。该操作将组织进一步切碎至更均一的尺寸。对每种尺寸的样本称重，并按下列量准备10、20、30和40微克。按照制造商提供的方案，采用MTS检测分析法(CdlTiter96AQueousOneSolutionCellProliferationAssay(单溶液细胞增殖4企测试剂盒)，Promega,Madison,WI)测定组织糜的活性。用从猪骨酪肌上分离的细胞生成标准曲线。表1显示了该检测分析结果。表1:对各种尺寸和数量的碎猪骨骼肌进行MTS检测分析的结果。尺寸测试量(单位jug)细胞计数300um1024558±35472062929±23063079137±621640105588±2904425um1021087±9232063646±13643086824±1478540110533±978MT1022654±9482040591±6523058339±4684074637±97817如表所示，切碎方法保持了骨骼肌组织的活性。将骨骼肌组织推挤通过金属筛网以控制其碎块尺寸后，活性没有改变。在4。C和室温下，在Hank平衡盐溶液载体(HBSS,Invitrogen,Carlsbad,CA)中进一步评估随时间推移的骨骼肌组织糜活性。对5微克、10微克和20微克的3份组织进行了最多4小时的试验。在所有情况下，将样本在冰上(4。C)或室温(RT)下进行培养。所采用的测试方法是MTS检测分析法(Promega)。表2示出了该实验的结果。表2.为最多4小时的组织糜活性研究而进行的MTS检测分析的结丞。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>讨论组织活性随时间推移而降#<。最佳活性记录在丁=0时。但1至2小时间所记录的活性仅有较小的变化。4°C下记录的活性略好。结论本实验重点说明了组织应在少于1小时的总加工时间内快速切碎。当温度降低为4。C时，活性也略微提高。实例10对肌肉组织糜外植体上长出的细胞进行表征。从Farm-to-Farm(Warren,NJ)采购新鲜的猪骨骼肌样本。用一对手术刀将样本手动切-争。在DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)、10%FBS(Hyclone,Logan,UT)、青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)或EGM-2(Lonza,Walkerville,MD)培养基内培养组织块。通过抗体染色对从DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)、10%FBS(Hyclone,Logan,UT)、青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)或EGM画2(Lonza,Walkerville,MD)培养基内的猪骨骼肌外植体上长出的细胞进行表型表征，并用Guava4义器(GuavaTechnologies,Inc.,Hayward,CA)进行分析。通过CD56+(N-cam，Abeam,Cambridge,MA)群体鉴定出成肌细胞，并通过双阳性CD34+/CD144+(分另'J得自BDPharmingen,SanJose，CA和eBiosciences,SanDiego,CA)群体鉴定出内皮细胞。作为对照，使用了人源骨骼肌和内皮细胞。下表汇总了该实验的结果。标志物DMEM中生长的细胞EGM-2中生长的细胞对照骨骼肌细胞对照内皮细月包CD34+<1%<1%<1%9%CD56+97%21%75%<1%CD144+<1%<1%<1%99%讨论由表可知，从组织块迁移出来的细胞的表型取决于培养基。在从DMEM、10。/oFBS培养基(其是典型的用于成肌细胞的生长培养基)内的外植体长出的细胞群体中，骨成肌细胞占97%。EGM-2培养基中成肌细胞的百分比降低至21%。由于剩余79%的细胞对内皮标志物染色不为阳性，我们假定剩余细胞为成纤维细胞。HannesStrasser等人以及其他研究人员获得了类似的细胞群体，他们证明成肌细胞和成纤维细胞两者都是骨骼肌组织内的两种主要细胞类型(Lancet2007,369:2179-86)。结论在体外细胞培养中，我们确定从碎肌肉组织块中长出的至少一些细胞是成肌细胞，但这些结果与培养基有关。组织糜内成肌细胞的存在有利于在治疗SUI中采用再生疗法。实例11猪尿道细胞分离从Farm-to-Pharm(Warren,NJ)采购了猪尿道。用一对手术刀去除尿道的脂肪和结締组织，并将尿道切碎。记录组织的重量(B.lg),并将组织放入50ml圆锥管内的消化酶(见下文)与DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)、10%FBS(Hyclone,Logan,UT)、青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)的混合物中。用ParafilmM⑧膜裹住锥形管以密封。将锥形管转移至37。C培养箱内以225RPM的速度振荡2小时。每培养1小时，都要把锥形管从培养箱内取出，管口朝上直立l-2分钟，以查看消化是否彻底。彻底消化时(不超过2小时)，将管口朝上直立l-2分钟，让大块沉淀。将细胞悬浮液(不含大块)转移至新的锥形管内，并用新鲜的DMEM、10%FBS、青霉素/链霉素稀释。将细胞悬浮液以150xg的速度离心5分钟，抽吸出上清液。加入新鲜培养基(总体积最多50ml)并重新悬浮。将细胞悬浮液以150xg的速度离心5分钟，除去上清液。加入新鲜培养基(总体积最多30ml),用移液管上下吸液以将细胞重新悬浮。将重新悬浮的细i包粒料通过100jum过滤器过滤。将细胞悬浮液以150xg的速度离心5分钟，抽吸出上清液，并将细胞粒料在PBS内重新悬浮。使用GUAVA⑧细胞计数器(GuavaTechnologies,Inc,Hayward,CA)对细胞计数。共获得约6x106个细胞。将细胞以5,000个细胞/cm2的密度覆盖在EGM-2(Lonza,Walkersville,MD)内，并置于37°C的培养箱内。消化酶0.25U/ml月交原酶(ServaElectrophoresis,GmbH,Heidelberg,Germany)、2.5U/ml分散酶(DispaseII165859,RucheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)和lU/ml透明质酸酶(Vitrase,ISTAPharmaceuticals,Irvine,CA)。增殖纟企测分析目的是评估猪肌肉组织糜对从猪尿道分离出的细胞的增殖作用。将按照上述方法分离的尿道细J包以10,000个细胞/孔的密度种才直在24孔培养皿上。实-睑条件为-低血清(生长培养基20%)陽低血清(生长培养基20%)+不同数量的组织糜(500、250或50微克/孔)将组织糜添加至穿透孔内(孔径0.4微米)。对两类培养基，即EGM-2和DMEM/EGM-2(50/50,vol/vol)进行了测试。在第2天、第3天和第7天，使用Guava仪器采集细胞以获得细胞数量和活性。结果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>从猪尿道分离的细胞在与肌肉组织糜一起培养两三天后，表现出比在基础培养基内培养时更快的增殖率。增殖速率与基础培养基有关，但肌肉组织糜对从猪尿道分离出的细胞的进一步增殖速率有明显作用。在培养3天时作用最为明显，之后逐渐减弱，大概是由于缺乏新鲜营养物和存在培养废物所致。据观察，产生最大增殖作用的是使用250微克/孔肌肉组织糜时，此时，尿道源细胞在EGM-2培养基中2天后和3天后的增殖率分别增加了77%和93%,而尿道源细胞在DMEM/EGM-2培养基中3天后的增殖率增加了74%。结论以上提供的数据明显反映出，碎肌肉组织块对猪尿道源细胞的增殖率有着积极的体外作用。这表明，这些负责恢复失禁大鼠(实例1中提供)漏尿点压力(LPP)的细胞的作用机制在健康细胞中至少部分地增强，因而可以使尿道组织再生。这也"i兌明，这些细胞的疗效不〗义在于填充作用，而是更多地在于营养作用，从而促进了真正的长期再生响应。实例12介绍本研究的目的是确定测试才羊品的安全性，以及记录将自体同源组织源产物注射到健康动物尿道腔周围肌肉壁内经过长达三个月的时间后，所诱发的雌猪尿道动力学功能变化和组织学变化。本研究遵照1978年12月22日公布的FoodandDrugAdministrationGoodLaboratoryPracticeRegulations,Title21oftheU.S.CodeofFederalRegulations,Part58(《美国联邦法规》第21篇《美国食品及药品管理局良好实验室规范》第58部分)(及其所有适用修订本)进行。对已批准方案的所有变更或修订均保持在研究文件的原始方案内。实验设计在最多3个月+/-5天后处理的时间内对7只动物(另有1只备用)进行了研究。治疗之前进行了最少7天的预处理。两组动物均植入了留置膀胱导管(>7天)。备用动物除外。第0天注射药物实验动物接受了来自肌肉供体的自体同源组织源产物。对对照动物注射了载体(Hank平衡盐溶液(HBSS)，Invitrogen)制品。/人实'睑组动物的每个后腿采集肌肉活体组织。就地加工外植组织以生成用于治疗注射的测试样品。让动物在大约3个月的时间内康复和存活。在域处理期间和后处理第21、29、57、94天规定时间间隔内进行膀胱尿动力学评价。尿动力学测试包括漏尿点压力(LPP)和尿道压力分布(UPP)测量。所有动物都在后处理约3个月后安乐致死，并对尿路进行微观评价。检疫实-验室接收的所有动物都在第6天检疫放行之前接受了体检。所观察到的形态和行为均在规范之内，实验室兽医对动物无条件放行。处理月几肉活组织4企查:使用8mm穿孔活检针进行肌肉活组织检查以制备测试样品。制备测试样品和载体:本研究所用载体为Hank平衡盐溶液(HBSS,Invitrogen,Carlsbad,CA)。测试样品以如下方式制备。进行肌肉活组织检查并获得500-700mg组织。用一对手术刀将组织剔除脂肪并切碎。操作过程中用少量HBSS让组织保持湿润。切^淬后，将组织施加至425微:米金属目筛网(L3-40,ATMProducts)上，并使用注射器柱塞(5cc)将组织挤过筛网进一步切碎。采集样本并使之在HBSS(总体积1.5ml)内重新悬浮。处理工序:在麻醉条件下将测试样品和对照制品经尿道口递送。改下，在沿尿道中的离膀胱颈后三分之一和中三分之一之间的4个不同位置进行环周注射(每部位6-8针)。漏尿点压力测试使用ADInstruments压力传感器获得LPP值并用计算机软件PowerLabCharT进行分析。记录结果并制成表格(表3)。第0天使用留置膀胱导尿管对所有经过处理的动物进行了LPP测量。假设同时还进行UPP测量，排尿口最终将不用于未来的LPP测量。最大尿道压力测试使用ADInstruments压力传感器获得UPP值并用计算机软件PowerLabChartTM进行分析。然后按照标准方法计算MUCP。记录结果并制成表格(表3)。验尸/组织采集/组织病理学检查三个月后，将动物安乐致死并进行包括整个尿路在内的有限的验尸和有限的组织采集。验尸过程中采集尿道、膀胱、输尿管和肾。在压力条件下，用10%中性緩沖福尔马林将尿道固定约24小时。固定之后，将组织提交至VetPathServices,Inc.(VPS)进4亍组织学目的的处理和组织病理学检查。将尿道修剪、灌入石蜡并切开。从膀胱颈开始，沿整个尿道每隔2.5mm制作一个切片，并行苏木精-伊红和马松三色(Masson，sTrichrome)染色。在马松三色染色载片上进行尿道测量。获得经过组织形态计量学图像分析的测量结果。测得尿道总厚度、平滑肌层厚度和骨骼肌层厚度。用尿道总厚度减去平滑肌层和骨骼肌层厚度之和得到结締组织厚度。结果尿动力学测试LPP和mUCP测试结果包括在表3中。23表3:本研究中各动物的LPP和mUCP测试结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>对照组动物和实^验组动物之间在LPP上没有发现差别。^f旦数据表明，第21天，在3/5的实验组动物上观察到最大尿道闭合压力(mUCP)显著增加(>250%)。随着时间的发展，mUCP值与对照组动物的指标逐渐接近(见表3)。应当指出的是，实验动物6由于与实验无关的受伤不得不在第93天之前安乐致死。组织学目的的，见察载体对照动物在对照动物的尿道上皮内观察到轻中度上皮增生(2/2)和无到轻度慢性活动性和糜烂性炎症(1/2)。在两只对照动物的上皮和粘膜固有层内都观察到轻度或中度亚急性炎症。在对照动物的粘膜固有层内观察到无到中度孢嚢(l/2)和浮肿(2/2)以及无到轻度出血(2/2)和淋巴结样包块(2/2)。在对照动物的肌层内观察到无到轻度亚急性炎症(1/2)。上皮增生平均得分为1.3,慢性活动性和糜烂性炎症得分为0.1,上皮和粘膜固有层内亚急性炎症得分为1.7，孢嚢得分为0.2,浮肿得分为0.8,出血得分为0.5,淋巴结样包块得分为0.6。肌层内亚急性炎症平均得分为O.l。实验动物在5/6的实验动物的尿道上皮内观察到无到中度上皮增生。在6/6的实验动物的上皮和粘膜固有层内观察到轻度或中度亚急性炎症。在实验组动物的粘膜固有层内观察到无到中度孢嚢(2/6)和浮肿(6/6),以及无到轻度出血(5/6)和淋巴结样包块(6/6)。在4/6的实验动物的肌层内观察到无到轻度亚急性炎症。上皮增生平均得分为0.6，上皮和粘膜固有层内亚急性炎症得分为1.3,孢嚢得分为O.l，浮肿得分为0.9,出血得分为0.2,淋巴结样包块得分为0.4。肌层内亚急性炎症平均得分为0.1。组织形态计量学图象分析载体对照动物在载体对照动物中，尿道平均总厚度为1.4,平滑肌平均厚度为0.7,骨骼肌平均厚度为0.0，结締组织平均厚度为0.8。平滑肌占尿道厚度的47%,横紋肌占尿道厚度的0%。实验动物在实验动物中，尿道平均总厚度为1.7,平滑肌平均厚度为0.8,骨骼肌平均厚度为0.1,结締组织平均厚度为0.9。平滑肌占尿道厚度的45.0%,横紋肌占尿道厚度的3.2%。讨论第21天时，可以在3/5的实验组动物身上观察到最大尿道闭合压力(mUCP)明显增加。剩余的两只动物由于未知原因没有对注射物产生相似反应。随后在第28天、第57天和第94天，见察到mUCP减小。导致UPP减少的准确机制尚不明确。事实上，我们没有观察到纤维变性或炎症。可能是动物没有受伤影响了测试结果。在标准组织学目的的检查中观察到实验组的注射组织融合到尿道组织中，并且形成新的肌纤维。组织学目的评价的另一个重要之处在于，没有在标本中发现感染、炎症或纤维变性症状。此外，没有证据表明，新组织"隆起，，或组织沉积的形成会导致尿道腔压缩或阻塞。因此，简单地阻塞或压缩尿道不会产生术后影响。结论在后处理第21天，3/5的实验动物的mUCP显著(〉250。/。)增加。检查尿道时，没有任何因处理诱发的局部发炎迹象。实^r动物和载体对照动物的尿道变化相对类似。与对照动物尿道相比，实马全动物尿道内的上皮增生和上皮及粘膜固有层亚急性炎症的严重程度略低。只在载体对照动物尿道中观察到慢性活动性和糜烂性炎症。在实验动物尿道中，尿道的平均总厚度略大于对照动物尿道。在实验动物的尿道中，横紋肌占尿道厚度的3.2%,而在载体对照动物的尿道中没有观察到横紋肌。对碎肌肉块的安全性研究表明，不存在显著副作用。第21天mUCP显著(〉250%)增加以及横紋肌的存在表明，肌肉组织糜可用于治疗SUI。2权利要求1.一种用于治疗失禁的组合物，所述组合物包括活肌肉组织块和载体。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述活肌肉组织来自由下列组成的组自体同源组织、异源组织、异种组织以及它们的混合物。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述载体选自由下列组成的组生理緩冲溶液、可注射凝月交溶液、生理盐水和水。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体为生理緩沖溶液。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述生理緩冲溶液为緩冲盐水、磷酸盐缓冲溶液、Hank平衡盐溶液、Tris緩冲盐水和Hepes緩沖盐水。6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体为包含生理緩冲液和胶凝材料的可注射凝胶溶液。7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胶凝材料选自由下列组成的组蛋白质、多糖、多核苷酸、海藻酸盐、交联海藻酸盐、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(氧化烯)、聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)共聚物、聚(乙烯醇)、聚丙烯酸酯、单硬脂酸甘油co-琥珀酸酯/聚乙二醇(MGSA/PEG)共聚物以及它们的组合。8.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包括至少一种微粒。9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述微粒由生物相容性聚合物构成，所述生物相容性聚合物选自由下列组成的组合成聚合物、天然聚合物以及它们的组合。、10.—种治疗失禁的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的组合物注射进泌尿生殖组织内。11.一种治疗失禁的方法，所述方法包括将根据权利要求1所述的组合物注射进结直肠组织内。12.—种制备用于治疗失禁的组合物的方法，所述方法包括以下步骤a.提供至少一种活的碎肌肉组织块；以及b.将所述组织块与适用于注射进泌尿生殖组织内的载体混合。全文摘要本发明公开了用于治疗失禁的组合物。更具体地讲，本发明公开了活肌肉组织块与载体的组合物。所述组合物可用于治疗尿失禁和大便失禁。文档编号A61K35/34GK101678049SQ200880019655公开日2010年3月24日申请日期2008年6月5日优先权日2007年6月15日发明者A·戈谢夫斯卡,A·赛达,C·S·布恩苏西索,S·达纳拉申请人:伊西康公司