用于进行组织保存的组合物以及方法
【专利说明】用于进行组织保存的组合物以及方法
[0001] 本申请是2008年2月19日递交的申请号为200880011995. 4,发明名称为"用于 进行组织保存的组合物以及方法"的分案申请
[0002] 相关的美国申请
[0003] 本申请要求享有申请日为2007年2月17日的USSN60/901，844、申请日为2007年 2月20日的USSN 60/902, 587、以及申请日为2007年8月27日的USSN 60/966, 511的优 先权，上述每篇申请均完整的在此引入作为参考。
[0004] 发明所属技术领域 [0005] 本发明涉及组织保存。
[0006] 发明的【背景技术】
[0007] 心脏移植的主要障碍在于供体心脏的可利用性有限以及供体心脏的质量不好，这 种质量不好归因于在存储过程中的退化。利用当前的实践以及保存溶液，所述的保存时间 的极限是4-6个小时，并且在美国，所有的心脏异体移植物都是从刚刚发生脑死亡的、参与 到生命支撑体系中的心脏搏动的供体处获得的。而且，当前的实践导致了被移植心脏的加 速的血管病变的显著发病率的产生。照此，目前紧迫的需要一类长期存储的溶液，能够保存 供体心脏的结构完整性以及生理学完整性。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供了一种溶液，所述的溶液在进行植入之前对一种从人类处收集的器官 或者从与人类相容处收集的器官进行保存，所述的收集到的器官需要在一段保存过程中或 者鉴定过程中被保存或者复苏，其中所述的植入包括移植或者复植。本发明所述的溶液还 能够允许所述的器官在所述的保存过程中被进行运输，从而改变其地理位置。本发明提供 了用于进行器官存储的经过改进的组合物、方法、以及装置，所述的组合物、方法、以及装置 保存了所述器官的功能完整性，并且重建了无功能性器官或者退化器官的功能。增加心脏 停搏（NBH)供体的使用以及更长时间的储存供体心脏能够在本质上增加所述的供体库的 大小，并且允许供体心脏在更长的距离内进行运输，从而增强接受者的可利用性。作为所述 的经过改进的存储方法的结果，完整无缺的、具有功能性冠状动脉内皮的心脏的移植能够 使血管病变最小化，所述的血管病变是在使用当前的技术进行心脏移植之后发生的。
[0010] 本发明提供了用于保存或者复苏生物组织的组合物。所述的组合物中含有一种生 理盐溶液以及下述组分中的至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，或者至少五种：用于 生成三磷酸腺苷（ATP)的底物，用于消耗氨的底物，用于缓冲细胞内酸度的试剂，用于淬火 (quench)活性氧组分的试剂，和/或用于平衡组织水肿/脱水的试剂。
[0011] 在一个方面，所述的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用于生成三磷酸腺苷 的底物。任选的，所述的用于生成三磷酸腺苷的底物是磷酸肌酸，肌酸乙酯，二肌酸苹果酸， 肌酸葡糖酸，果糖，蔗糖，核糖，己糖或者戊糖。可以选择的，所述的用于生成三磷酸腺苷的 底物是肌酸乳清酸，一水合肌酸，腺苷，或者葡萄糖。
[0012] 所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及一种用 于消耗氨的化合物。任选的，所述的用于消耗氨的化合物是鸟氨酸或者羧基磷酸。可以选 择的，所述的用于消耗氨的化合物是L-瓜氨酸苹果酸。
[0013] 在另外一个方面，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐 溶液以及一种用于缓冲细胞内酸度的试剂。在一个方面，所述的用于缓冲细胞内酸度的试 剂是组氨酸，谷氨酰胺，色氨酸，赖氨酸，或者牛磺酸。可以选择的，所述的用于缓冲细胞内 酸度的试剂是碳酸氢钠，Tris-羟甲基氨基甲烷（THAM)，或者L-肌肽。
[0014] 任选的，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐溶液以及 一种用于淬火活性氧组分的试剂。在一个方面，所述的用于淬火活性氧组分的试剂是二硫 苏糖醇（DTT)，β -巯基乙醇，乙酰半胱氨酸，α -硫辛酸，牛磺酸，白藜芦醇（Resveratr0I)， 叶黄素，硒，甲硫氨酸，或者生育酚/维生素 Ε。
[0015] 在另外一个方面，所述的用于保存或者复苏生物组织的组合物中含有一种生理盐 溶液以及一种用于平衡组织的水分含量（水肿/脱水）的试剂。所述的用于平衡组织的水 分含量的试剂包括甘露醇，尿素，丙三醇，异山梨醇，或者五水合蜜三糖。任选的，所述的用 于平衡组织的水分含量的试剂是五水合蜜三糖的penta片段。
[0016] 所述的溶液被用来对存活的供体心脏、用于移植而临时存储的存活的供体心脏、 以及尸体供体的心脏进行复苏，并且允许对存活的、存储的、或者尸体的器官例如心脏进行 延长的临时存储。存活的供体心脏以及尸体心脏的心肌细胞的功能得以保存，并且所述的 存活的供体心脏以及尸体心脏的冠状动脉以及腔室的内皮功能也得以保存。当在死亡之后 的短时间内将所述的器官与本发明所述的溶液进行接触并且将器官存储于所述的溶液中 时，所述的溶液还能够介导代谢性变化以及退化性变化的逆转，并且能够对所述心脏（以 及其他器官）中的细胞死亡以及细胞存活能力的恶化进行抑制。通过维持三磷酸腺苷的水 平，线粒体的功能，心肌细胞的收缩性，预防酸中毒，抑制细胞凋亡的诱发，从而维持代谢功 能。通过调节钙离子、钠离子、钾离子以及氯离子来维持变力性（inotrophy)以及变松性 (lusitropy)。所述溶液的缓冲能力能够预防酸中毒。所述的溶液保存了所述器官中的钙 动员，一氧化氮的生成，并且维持了所述冠状动脉的内皮依赖性血管收缩功能以及内皮不 依赖性血管收缩功能。通过调节离子浓度以及水通道蛋白（aquaporin)通道，在再灌注时 预防了脱水以及随后的过度水合（水肿），并且预防了缺血性再灌注损伤。所述的溶液以及 存储系统是一种自我持续性的再生系统，用于生成三磷酸腺苷以及一氧化氮的底物。
[0017] 所述的组合物能够预防缺血性再灌注损伤。这项功能是由抗坏血酸以及谷胱甘 肽，肉碱（通过预防乙酰辅酶A的积累，所述的积累能够导致自由基-缺血性再灌注损伤的 发生），肌肽以及α-硫辛酸来介导的，上述物质均是自由基（羟基自由基，纯态氧，过氧化 氢自由基以及超氧化物）清除剂。所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳 酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及用于预防器官和/或组织的脱水和/或水 肿的试剂。所述的溶液中还含有其他的盐类包括氯化镁，氯化钠，和/或磷酸氢二钠。
[0018] 通过对钠离子（较少）以及钾离子（较多）（即，同渗容摩）进行调节，可以对所述 心脏的脱水（在存储过程中）以及经过再灌注之后的过度水合或者水肿进行控制。所述的 溶液是轻微低渗的以及轻微低同渗容摩（hyposmolar)的，因此能够在存储过程中驱使水 进入所述的心脏内并且在再灌注过程中进行平衡。外部氯化钾浓度的增加弥补了所述的钾 电流（接近于能斯特电势）并且防止钾随水向外运动（钾离子的水合壳层）。还可以通过 对所述的水通道蛋白通道进行的调节来对脱水/水肿进行控制，其中所述的对于水通道蛋 白通道进行的调节是经由所述的离子电流完成的。同样的，外部的钾可能延迟/降低了钙 离子向所述细胞内的运动，因而经由钙激活的钾通道来预防脱水。例如，所述的溶液中含有 125毫摩钠以及7毫摩钾。在一个方面，所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸 镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷，谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于生成三磷酸腺苷的底物。例 如，所述的用于生成三磷酸腺苷的底物是肌酸乳清酸，一水合肌酸，腺苷，或者葡萄糖。二氯 乙酸通过对能够使丙酮酸脱氢酶（PDH)发生磷酸化的激酶进行抑制致使其失活来增加三 磷酸腺苷的生成。二氯乙酸通过促进所述的三羧酸（TCA)循环来诱导三磷酸腺苷的合成。
[0019] 在所述的瓜氨酸苹果酸-精氨酸循环中，苹果酸盐（从瓜氨酸中分裂出来）进入 所述的三羧酸循环从而生成更多的三磷酸腺苷。同样的，瓜氨酸苹果酸转化成精氨酸以及 延胡索酸盐；延胡索酸盐进入所述的三羧酸循环从而促进更多的三磷酸腺苷的生成。在三 羧酸循环中，苹果酸盐以及延胡索酸盐都能够引发更多三磷酸腺苷的生成。
[0020] 所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷， 谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于缓冲酸度的试剂。用于缓冲细胞内酸度的试剂是肌酸乳清 酸，其通过促进肌肽的合成来缓冲细胞内酸度。一水合肌酸通过增加能量的产生并且减少 乳酸盐的积累来缓冲酸度。酸度还可以通过碳酸氢钠、Tris-三羟甲基氨基甲烷（THAM)、以 及L-肌肽来进行缓冲（细胞内酸度）。二氯乙酸通过降低被保存的器官中的乳酸盐的水平 来控制酸度，因此所述的溶液也如此。L-肉碱能够促进心肌乳酸盐的产量的降低，因此能够 降低酸度。
[0021] 所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷， 谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于消耗氨的底物。例如，所述的用于消耗氨的底物是L-瓜氨 酸苹果酸。氨与羧基磷酸混合后形成瓜氨酸苹果酸，这形成了一氧化氮以及三磷酸腺苷的 底物。
[0022] 所述的组合物中含有氯化钙，氯化钾，磷酸钾，硫酸镁，碳酸氢钠，D-葡萄糖，腺苷， 谷胱甘肽，胰岛素，以及一种用于预防器官和/或组织的脱水和/或水肿的试剂，一种用于 生成三磷酸腺苷的底物，一种用于缓冲酸度的试剂，以及一种用于消耗氨的底物。优选的， 所述的组合物中包括下述化合物以及浓度：
[0023] 大约0· 147克/升氯化钙（1毫摩）
[0024] 大约0· 52克/升氯化钾（7毫摩）
[0025] 大约0· 06克/升磷酸钾（一钾盐）（0· 44毫摩）
[0026] 大约0· 11克/升氯化镁（六水合物）（0· 50毫摩）
[0027] 大约0· 125克/升硫酸镁（五水合物）（0· 50毫摩）
[0028] 大约7. 30克/升氯化钠（125毫摩）
[0029] 大约0· 35克/升碳酸氢钠（4. 2毫摩）
[0030] 大约0· 05克/升磷酸钠（二钠盐；五水合物）（0· 19毫摩）
[0031] 大约1. 98克/升葡萄糖/D-葡萄糖（11毫摩）
[0032] 大约0· 27克/升腺苷（1毫摩）
[0033] 大约0· 46克/升谷胱甘肽（还原态；L 5毫摩）
[0034] 大约0· 18克/升抗坏血酸（1毫摩）
[0035] 大约0· 21克/升L-精氨酸（1毫摩）
[0036] 大约0· 27克/升肌酸乳清酸（0· 5毫摩）
[0037] 大约0· 30克/升一水合肌酸（2毫摩）
[0038] 大约0· 15克/升L-瓜氨酸苹果酸（1毫摩）
[0039] 大约0.08克/升二氯乙酸（0.5毫摩）
[0040] 大约2. 3克/升L-肌肽（10毫摩）
[0041] 大约2.0克/升L-肉碱（10毫摩）
[0042] 大约0.021克/升α-硫辛酸（〇· 1毫摩）
[0043] 大约〇· 50毫升/升胰岛素（10晕克/毫升）
[0044] 用于调整pH的THAMCTris-羟甲基氨基甲烷；100毫摩储备液，12. 1克/升）
[0045] (大约1升蒸馏水）。
[0046] 将上述的成分混合在一起，从而形成一种溶液。在混合了其余的成分之后，任选的 加入胰岛素。例如，在将一种器官浸没于所述的溶液之前的几分钟的时间里或者几小时的 时间里加入胰岛素，所述的几分钟时间例如是〇. 5分钟，1分钟，2分钟，5分钟，所述的几小 时时间例如是〇. 5小时，1小时，2小时，3小时，4小时，或者5小时。
[0047] -种优选的组合物中包括存在于下述剂量范围内的化合物，从而形成一种具有期 望比例的组合物：
[0048] 0· 1-0. 5克/升氯化钙
[0049] 0· 25-0. 75克/升氯化钾（7毫摩）
[0050] 0· 01-0. 5克/升磷酸钾（一钾盐）
[0051] 0· 01-0. 5克/升氯化镁（六水合物）
[0052] 0· 01-0. 5克/升硫酸镁（五水合物）
[0053] 5. 0-10. 0克/升氯化钠（125毫摩）
[0054] 〇· Ol-O. 5克/升碳酸氢钠
[0055] 0· 01-0. 5克/升磷酸钠（二钠盐；五水合物）
[0056] 1. 0-5. 0克/升D-葡萄糖/葡萄糖（11毫摩）
[0057] 0· 01-0. 5克/升腺苷（1毫摩）
[0058] 0· 01-0. 75克/升谷胱甘肽（还原态；1. 5毫摩）
[0059] 0· 01-0. 5克/升抗坏血酸（1毫摩）
[0060] 〇· 01-0. 5克/升L-精氨酸（1毫摩）
[0061] 〇· 01-0. 5克/升肌酸乳清酸（0· 5毫摩）
[0062] 0· 01-0. 5克/升一水合肌酸（2毫摩）
[0063] 0· 01-0. 5克/升L-瓜氨酸苹果酸（1毫摩）
[0064] 0· 01-0. 5克/升二氯乙酸（0· 5毫摩）
[0065] 0· 23-2. 3 克 / 升 L-肌肽（1-10 毫摩）
[0066] 0· 20-2. 0 克 / 升 L-肉喊（1-10 晕摩