加了在样本的更深处（深度大约1000 μ) 进行成像的能力。所述的技术允许获得同时的明视场图像，以及对形态变化的显像和量化。 多光子技术具有的这些独特的特点为所述的系统提供了多功能性，允许通过各种广泛存在 的不同的荧光素探针对存活的或者经过固定化培养的内皮细胞（EC)以及完整组织进行成 像，用于调查各种生理学过程，其中所述的完整组织例如是人类的心脏组织以及血管。所述 的BioRad MRC 1024ES系统装配有一个传统的氪-氩激光以及一个飞秒钛-蓝宝石激光， 其中所述的氪-氩激光具有488纳米、568纳米以及647纳米的发射光线，而所述的钛-蓝 宝石激光被调节在735-990纳米之间。通过同时使用所述的传统激光以及钛-蓝宝石激 光，可以按照比例量度对线粒体膜电位以及细胞溶液游离性钙离子进行成像（通过使用例 如，钙橙染料），并且同时对生成的一氧化氮（使用二氨基荧光素-2DA)以及整个静脉的直 径以及体积发生的变化进行观察。在波长488/568下对所述的酯酶活性进行测量以及标准 化处理，光电倍增管（PMT) 1使用激光功率被削弱90%的2/864,而光电倍增管2使用激光 功率被削弱90%的2/1297,以及卡尔曼3滤波器（规则系统）。使用MetaMorph成像处理 软件（Universal Imaging，PA)对所述的焚光素进行量化。
[0230] 实施例2 =Lazarus溶液对于组织以及器官对照组所产牛的作用的鉴宙
[0231] 对所述的对照组（心脏衰变）进行的存活/死亡检测的结果在附图1以及附图2 中被表示出来。在所述的对照组中，在经过120分钟的时间后，左心室（LV)的前室壁以及后 室壁的心室心肌细胞的酯酶活性（绿色荧光素）发生了时间依赖性的降低，而所述心室心 肌细胞的细胞死亡/坏死（红色荧光素）发生了时间依赖性的增加（附图1以及附图2)。 附图2描述的是一个绘图，代表着所述的对照组（心脏衰变）在时间结束后发生的酯酶活 性的降低。而且，用于对所述的对照组的线粒体膜电位进行鉴定的线粒体膜电位检测试剂 盒检测（JC-I)的结果表明，所述的心室心肌细胞线粒体膜存在时间依赖性的去极化作用 (附图3:在每组中，左栏代表的是极化作用（红色）；在每组中，右栏代表的是去极化作用 (绿色））。正如附图4中的代表性绘图所示，在所述对照组中的线粒体发生了增加的去极 化作用。
[0232] 试验组
[0233] 下述试验的目的在于将本发明所述的Lazarus溶液与施尔生液进行比较，所述的 施尔生液是一种在心脏移植中普遍使用的存储溶液。正如上文以及附图28中所描述的， 将每个猪心脏在上述指明的存储溶液（施尔生或者Lazarus)中保存4小时。与所述的 Lazarus心脏搏动模型以及Lazarus死亡1小时（心脏停搏）组相比，所述的施尔生组表现 出更少的酯酶活性（附图5,6,以及7)，更多的坏死（附图5)，以及更强的线粒体膜的去极 化作用（附图8)(分别通过存活/死亡检测以及线粒体膜电位检测试剂盒检测）。
[0234] 正如附图5中所示，在所述的施尔生组表现出增加的坏死（红色；每组中的左栏） 以及降低的酯酶活性（绿色；每组中的右栏）的同时，两个Lazarus组表现出最小程度的坏 死（红色）以及升高的酯酶活性（绿色）。同时对于在不改变溶液的情况下Lazarus对猪 的停搏心脏保存10天的能力进行了鉴定（附图6)。附图6中的结果以绘图的形式描述了 在每个试验组中的所述的酯酶活性，这表明，与所述的施尔生组相比，在每个Lazarus组中 存在更多的存活细胞，这意味着Lazarus在保存所述的猪心脏方面更加有效。接下来，对于 在KTC下在Lazarus溶液中存储了 4个小时的死后1小时的尸体心脏中的酯酶活性进行了 测定。正如附图7中所示，在将所述的心脏停搏供体模型在Lazarus中存储4个小时之后， 与基线相比的酯酶活性以及稳定性有所增加。
[0235] 线粒体膜电位能够提供能量，依靠这种能量，在所述的克雷布斯循环中能够生成 三磷酸腺苷。这样一来，经由上文中所描述的线粒体膜电位检测试剂盒（JC-I)检测，可以 对猪心脏的线粒体膜电位进行测定，其中所述的猪心脏在存储溶液中进行了 4个小时的保 存。红色（极化作用；每组中的左栏）与绿色（去极化作用；每组中的右栏）的比例大于1， 这表示着在心肌细胞中具有健康的线粒体，即，具备生成三磷酸腺苷的条件。正如附图8中 所示，与所述的施尔生组相比，在每个Lazarus组中的猪心脏的线粒体膜电位维持的更好。 而且，正如附图8中所示，在所述的Lazarus组中经过240分钟的时间后，线粒体膜电位的 极化作用被恢复了。
[0236] 同样对于猪心脏的动脉左前降支（LAD)进行所述的存活/死亡检测，其中所述的 猪心脏在溶液中经过了 4个小时的保存。正如附图9中所示，在所述的施尔生组中，所述的 冠状动脉出现显著的坏死（红色；每组中的左栏），而在两个Lazarus组中均出现最小程度 的坏死。与所述的施尔生组相比，每个Lazarus组中的酯酶活性（绿色；每组中的右栏）同 样也更加强健。
[0237] 在使用缓激肽对猪心脏的动脉左前降支（LAD)进行刺激之前以及之后，对内皮功 能（钙的动员以及一氧化氮（NO)的生成）进行鉴定，其中所述的猪心脏在溶液中经过了 4 个小时的保存。为应答于缓激肽而出现的钙动员的增加以及一氧化氮生成的增加表明，在 两个Lazarus组中，内皮功能被得以更好的保存（附图10,11，12)。正如附图10中所示，两 个Lazarus组在基线处以及在经过缓激肽的刺激之后（分别为之前以及之后）具有更强的 钙动员（红色；每组中的顶端行）以及更多的一氧化氮的生成（绿色；每组中的底端行）。 附图11是一个代表性的绘图，表示的是猪心脏的动脉左前降支对于缓激肽的内皮应答（钙 的动员以及一氧化氮的生成），其中所述的猪心脏被保存在施尔生液中。基线处的两个参数 都小于1. 2。附图12是一个代表性的绘图，表示的是心脏停搏供体猪心脏（死后1小时） 的动脉左前降支对于缓激肽的内皮应答（钙的动员以及一氧化氮的生成），其中所述的猪 心脏在Lazarus中经过了 4个小时的保存。与附图11中所示的施尔生心脏搏动模型组相 比，对于所述刺激的应答更加强健（> 2)。这些结果表明，在Lazarus溶液中保存后的内皮 功能由于在施尔生液中保存后的内皮功能。
[0238] 使用Western印迹检测法以及免疫印迹检测法进行的结构检测
[0239] 通过对所述心肌层的结构成分进行标记，来鉴定在所述心脏中的收缩性部件的结 构完整性。将所述的心肌层结构成分进行保存（附图13,14,15,以及16)，其中所述的心肌 层结构成分已经在Lazarus中经过了 4个小时的存储。附图13表示的是在施尔生液或者 Lazarus中经过了 4个小时的存储之后，肌浆球蛋白以及肌动蛋白的免疫荧光素标记结果。 附图14表示的是在施尔生液或者Lazarus中经过了 4个小时的存储之后，肌钙蛋白C以及 Actinin的免疫荧光素标记结果。正如附图14中所示，将肌钙蛋白C以及Actinin(所述 收缩机制中的结构成分）保存在Lazarus中。而且，所述的结果表明，在所述的Lazarus组 中，所述的荧光素呈现出有线条的外观（在所述的施尔生组中并未出现），这意味着这些结 构蛋白在完整的收缩性部件中形成了组织。
[0240] 正如附图15中所示，针对1号、2号以及3号猪的死后解剖心脏的前侧活组织切片 (A) 以及后侧活组织切片（B)进行Western印迹分析，其中所述的猪心脏被存储在Lazarus 或者施尔生液中。使用小鼠抗肌浆球蛋白（轻链；cat#M4401，来自于Sigma;10%聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE) ;7. 5微克/装载良好）对肌浆球蛋白轻链蛋白（20kd)进行识别。正 如附图16中所示，针对2号猪的死后解剖心脏的前侧活组织切片（A)以及后侧活组织切片 (B) 进行Western印迹分析，其中所述的猪心脏被存储在Lazarus或者施尔生液中。使用小 鼠抗actinin(cat#7811，来自于Sigma ;10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) ;15微克/装载良 好）对actinin蛋白（IOOkd)进行识别。与施尔生组相比，在Lazarus中经过存储后的这 些Western印迹呈现出更宽的带，这说明所述的心肌收缩机制中的两种结构成分（肌浆球 蛋白轻链以及Actinin)得到了很好的保存。
[0241] 为了证实在Lazarus中进行保存的内皮功能优于在施尔生液中进行保存的内皮 功能，对动脉左前降支（LAD)中的内皮型一氧化氮合成酶（eNOS)进行免疫荧光标记，其中 所述的动脉左前降支在施尔生液或者Lazarus中经过了 4个小时的存储。内皮型一氧化氮 合成酶是存在于内皮层中负责一氧化氮的生成的酶。正如附图17中所示，与存储于施尔生 液中的心脏相比，被存储于Lazarus中的心脏的内皮层中的内皮型一氧化氮合成酶染色更 加强健。这些结果表明，Lazarus在保存内皮细胞方面比施尔生液更加有效。
[0242] 来自于心脏以及肝脏的10天的数据
[0243] 在另外的研究中，对作为存储溶液对心脏以及肝脏进行10天存储的Lazarus进行 了鉴定。经过10天之后，被存储于Lazarus中的所述心脏具有最小程度的坏死，强健的酯 酶活性（存活/死亡检测一一附图18以及19)，以及保存完好的内皮功能（附图20)。而 且，被存储于Lazarus中的所述肝脏同样具有最小程度的坏死以及强健的酯酶活性（附图 20以及21)。针对死后1小时的尸体组的心肌层以及冠状动脉左主干进行所述的存活/死 亡检测，其中所述的心肌层以及冠状动脉左主干在Lazarus中经过了 10天的存储。正如附 图18中所示，被存储于Lazarus溶液中10天之后的心肌层以及冠状动脉左主干（死后1 小时尸体解剖）具有最小程度的坏死（红色；两组中的左栏）以及显著的酯酶活性（绿色； 两组中的右栏），这意味着在Lazarus溶液中进行10天的存储能够对所述的心脏进行保存。 附图19是一个代表性的绘图，表示的是在Lazarus中经过10天的存储之后所述的心肌层 的酯酶活性的保存。在Lazarus溶液中存储10天之后，Lazarus对于酯酶活性的保存能力 优于在施尔生液中存储4小时之后所述施尔生液对于酯酶活性的保存能力。（直接的比较 参见附图6)。
[0244] 对使用缓激肽刺激的动脉左前降支的内皮功能（钙的动员以及一氧化氮的生成） 进行鉴定，其中所述的动脉左前降支在Lazarus中经过了 10天的存储。正如附图20中所 示，Lazarus溶液保存了动脉左前降支中的钙的动员（红色；左栏）以及一氧化氮的生成 (绿色；中间栏），这意味着在Lazarus中经过10天的存储之后，所述的内皮功能被得以保 存。
[0245] 附图21是一个代表性的绘图，表示的是在肝脏中被得以保存的酯酶活性，其中所 述的肝脏于4°C下在Lazarus中经过了 10天的存储。附图22表示的是肝脏样本中坏死的 平均百分率少于15%，其中所述的肝脏样本于4°C下在Lazarus中经过了 10天的存储，这 意味着在Lazarus溶液中经过10天的存储之后，所述的肝脏被得以保存。
[0246] 实施例3 :灌沣装詈
[0247] 附图26以及27描述的是灌注装置以及系统。附图26表示的是对人类心脏进行 体外复苏以及保存的系统。所述的后负荷球囊栗控制主动脉的后负荷血压。所述的后负 荷球囊栗任选的被压力调节器或者调节阀所替代。将心脏参数维持在下述范围内：后负荷 和/或球囊栗压力为60-80毫米汞柱；主动脉根压力为40-80毫米汞柱（用于在存储过程 中进行灌注）；流速为100-300cc/分钟；心脏输出量（CO) > 2升/分钟；以及血压（BP) 为120-140/60-80毫米萊柱。所述的腔室以及水池（reservoir)中含有所述的溶液，例如， Lazarus溶液。所述系统中有两个元件是自我持续性的：磷酸烯醇式丙酮酸（PEP)羧酸激 酶板以及乳酸脱氢酶（LDH)板。
[0248] 按照下述内容实施一种复苏（唤醒）心脏的方法：
[0249] L快速收集心脏并且在非常冰冷的Lazarus (4°C )中利用高浓度的钾（15毫摩） 使所述的心脏停止循环。
[0250] 2.利用仪器对所述的心脏进行快速处理，维持低温一一即，在室温下停留最短的 时间。
[0251] 3.转移到过量的冰冷的Lazarus中并且在4°C下存储24小时。
[0252] 次日：
[0253] 1.按照需要，确立好血液化学机制。
[0254] 2.准备好冰冷的Lazarus心肌麻醉液，其中含有碳酸氢钠19毫当量（mEq)，氯化 钾18. 5毫当量，硫酸镁37毫当量/升。
[0255] 3.准备好未被氧化的血液。
[0256] 4.以4 : 1的比例混合血液以及Lazarus (确保适当的化学剂量；SP，确认最终的 钙浓度，镁浓度，钾浓度以及钠浓度）
[0257] 5.利用M对所述的灌注系统进行灌注一一维持温度在15-20Γ或者更低
[0258] 6.快速将所述的心脏钩在所述的设备内；在经过身体检查之后（颜色，质地，可触 知性，水肿/缩水等等）。
[0259] 7.温度维持在15°C时，经由所述的主动脉根对所述的心脏进行灌注，灌注使用 的是以4 : 1的比例存在的未被氧化的血液（红细胞压积10-15%)以及心肌麻醉液 (Lazarus，含有碳酸