预防、治疗和诊断利什曼病的利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶组合物的制作方法

专利名称：预防、治疗和诊断利什曼病的利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶组合物的制作方法
预防、治疗和诊断利什曼病的利什曼原虫固醇24-c-甲基
转移酶组合物 关于序列表的声明 与本申请相关的序列表是以代替纸件形式的纯文本格式提供的，并通过引用并入 本说明书。含有所述序列表的该文本文件的名称是480239_404_SEQUENCE_LISTING. txt。 该文本文件的大小为20KB，其创建于2008年7月11日，并经由EFS-Web与提交说明书的同 时提交。 发明背景 发明领域 本发明通常涉及用于预防、治疗和检测患者利什曼病的组合物和方法。更具体地 说，本发明涉及包含利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶(SMT)多肽、其融合多肽以及编码此 类多肽和融合物的多核苷酸的组合物。
背景技术：
人类利什曼病是由利什曼原虫(Leishmania)的原生动物寄生虫引起的一系列疾 病。根据临床表现，利什曼病大致分为皮肤利什曼病(cutaneous leishmaniasis, CL)、粘膜 利什曼病(mucosal leishmaniasis, ML)禾口内脏利什曼病(visceral leishmaniasis, VL) 三种疾病类型。内脏利什曼病通常由杜氏利什曼原虫(L.donovani)复合种即杜氏利什曼 原虫和婴儿(恰氏)利什曼原虫(L. infantum(chagasi))引起，是最为严重的形式，每年报 告约500， 000新发病例(信息源于世界卫生组织www. who. int/leishmaniasis/en/)。活 跃性VL的特征为血液和肝脾异常，如果不进行正确地治疗通常是致死的。
利什曼原虫寄生虫通过白蛉叮咬传播，感染性前鞭毛体在哺乳动物宿主的巨噬 细胞中分化并复制为无鞭毛体。与其他的胞内病原体一样，细胞免疫反应对于防御利什 曼病的保护非常关键。Thl免疫反应在介导防御利什曼原虫的保护中发挥重要的作用，包 括对CD4+和CD8+T细胞、IFN-y 、 IL_12、 TNF-a以及NO的作用，而对11-10和TGF-P的 抑制性作用已有报道(Engwerda et al. ， (1998) Eur J Immuno 128 :669-680 ;Murphy et al. ， (2001)Eur J Immunol 31 :2848-2856 ;Murrayand Nathan. (1999)J Exp Med 189: 741-746 ;Murray et al. ， (2000) Infectl匪n 68 :6289-6293 ;Squires et al. ， (1989) J Immunol 143 :4244-4249 ;Taylor and Murray, (1997)J Exp Med 185 :1231-1239 ;Kaye and Bancroft. (1992)Infect Immun 60 :4335-4342 ;Stern et al. ， (1988)J Immunol140 : 3971-3977 ;和Wilson et al. ， (1998) J Immunol 161:6148-6155)。动物模型中抗利什 曼病的免疫接种可以通过抗原编码DNA载体的送递(Gurunathan et al. ， (1997)J E邓 Med 186 :1137-1147 ;Piedrafita et al. ， (1999) J Immunol 163 :1467-1472 ;和Mendez et al. ， (2001) J Immuno1166 :5122-5128)或通过给予由Th_l诱导佐剂配制的蛋白来实 现，所述佐剂包括IL-12(Afonso et al. ， (1994) Science 263 :235-237 ;Stobie et al.， (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 :8427—8432 ;和Kenney et al. ， (1999) JImmunol 163 :4481-4488)或诸如CpG寡核苷酸(Rhee et al. ， (2002) J ExpMed 195 :1565-1573 ;Stacey and Blackwell. (1999) Infect I匪n67 :3719-3726 ;禾卩Walker et al. ， (1999)Proc Natl Acad Sci USA96 :6970-6975)和单磷酰脂质A(Coler et al. ， (2002) Infect Immun70 : 4215-4225和Skeiky et al. ， (2002) Vaccine 20:3292-3303)的TLR配体。
尽管存在亚单位疫苗在VL模型中有效的证据(Basu et al. ， (2005) JImmunol 174 :7160-7171 ;Stager et al. ， (2000)J Immunol 165 :7064-7071 ;Ghosh et al. ， (2001) Vaccine 20 :59-66 ;Wilson et al. ， (1995) Infect I匪n63 :2062-2069 ;Tewaryet al.， (2005) J Infect Dis 191 :2130-2137 ;Aguilar-Be et al. ， (2005) Infect Imm皿73: 812-819 ;和Rafati et al. ， (2006) Vaccine 24 :2169-2175)，但一直缺乏限定体内有效 抗VL的真正候选抗原的进展。利用感染婴儿利什曼原虫的仓鼠的血清，经血清学筛选法 已鉴定了几个婴儿利什曼原虫抗原(Goto et al. ， (2006) Infect I匪n74 :3939-3944)。 固醇241-甲基转移酶(SMT)，已发现的活性抗原之一，是一种参与麦角固醇生物合成的 酶，所述麦角固醇是杀利什曼原虫的和杀真菌的二性霉素B(Pourshafie et al. ， (2004) Antimicrob AgentsChemother 48:2409-2414)的耙分子。二性霉素B选择性地对一些原生 动物寄生虫和真菌表现出选择性的杀伤活性，然而并未在哺乳动物细胞中发现麦角固醇。 同样，SMT存在于某些寄生虫、真菌和植物中，但在哺乳动物中缺失。 使用由全有机体组成的疫苗预防或治疗利什曼病的策略在人类中并未奏效。因 此，仍强烈需要能有效预防和/或治疗人类或其他哺乳动物(例如犬科动物)利什曼病的 免疫原性组合物和疫苗。本发明满足了这些需求并提供了其他的相关优势。
发明概述 简而言之，本发明提供了用于预防、治疗和检测利什曼病的组合物和方法。 一方 面，本发明的组合物使用包含利什曼原虫固醇24-『甲基转移酶(SMT)多肽的至少免疫原 性部分或SMT多肽变体的多肽，其中所述部分或变体保留了所需的全长SMT多肽的免疫原 性特性。在更具体的实施方案中，利什曼原虫SMT多肽包含杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原 虫、硕大利什曼原虫(L. major)或巴西利什曼原虫(L. braziliensis) SMT多肽的氨基酸序 列。在更具体的实施方案中，SMT多肽包含SEQ ID N0s :1、3、5和11中任一序列所示的氨 基酸序列。 在另一方面，本发明提供了包含编码上述多肽的多核苷酸的组合物以及包含这些 多核苷酸序列的重组表达载体和利用此类表达载体转化或转染的宿主细胞。在更具体的实 施方案中，多核苷酸包含编码杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫或巴西利 什曼原虫SMT多肽的核酸序列。在更具体的实例中，SMT多核苷酸包含SEQ IDN0s :2、4、6 和12中任一序列所示的核酸序列。 在另一方面，本发明提供了包含利什曼原虫SMT抗原的至少免疫原性部分且还包 含一个或更多异源融合伴侣的融合多肽。在相关方面，也提供了编码此类融合蛋白的多核 苷酸。 仍然在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含与生理学上可接受的载体组 合的一种或多种本文所述的多肽和/或融合多肽或编码此类多肽的多核苷酸。
另一方面本发明提供了疫苗组合物，其包含与免疫剌激剂组合的一种或多种本文 所述的多肽和/或融合多肽或编码此类多肽的多核苷酸。在更具体的实施方案中，免疫剌
4激剂为诱导占主导的Thl型免疫反应的佐剂。 在其他方面，本发明提供了剌激患者细胞和/或体液免疫反应的方法，其包括给 予患者上文所述的药物组合物或疫苗。 另一方面，本发明提供了诱导患者防御利什曼病的保护性免疫的方法，其包括给 予患者上文所述的药物组合物或疫苗。 相关方面提供了治疗患有利什曼病的患者的方法，其包括给予患者上文所述的药 物组合物或疫苗。 参考下文详细的描述和附图，本发明这些及其他的方面将会变得明晰。因此将本
文所公开的所有参考文献通过引用全文并入，如同将每一篇单独并入一样。 附图简要说明

图1A-1B表示来自婴儿利什曼原虫(SEQ ID NO :1)、杜氏利什曼原虫(SEQ ID NO : 3)、硕大利什曼原虫(SEQ ID N0:5)、美洲锥虫(T. cruzi) (SEQ ID NO :7)和巴西利什曼原 虫(SEQ ID NO :11)的SMTs的氨基酸序列比对，所述氨基酸序列是由其相应的cDNA序列推 断的。与婴儿利什曼原虫SMT匹配的残基显示于框中。 图2表示未经诱导的E. coli溶胞产物(泳道1)、诱导的E. coli溶胞产物(泳道
2) 和纯化的婴儿利什曼原虫SMT(泳道3)的考马斯亮蓝染色的SDS/4-20X聚丙烯酰胺梯 度凝胶。大小以kDa显示于左侧。 图3表示杜氏利什曼原虫(Ld)、婴儿利什曼原虫(Li)和硕大利什曼原虫(Lm)前 鞭毛体所表达的SMT。 图4表示VL患者对SMT的抗体反应。(A和B)利用ELISA，检测来自VL患者(n =21)、美洲锥虫病患者(Cha :n = 10)、地方病健康对照(EC :n = 10)和非地方病健康供体 (n = 6)的血清对rK39 (A)和rSMT (B)的总IgG反应性，并表示出每一个体的0D值。线条 (bars)代表每组的平均值。(C和D)表示的是VL患者(n = 21)和地方病健康对照(n =
3) 的IgG亚类对rK39(C)和rSMT(D)的反应性，并示出每组的平均值和SEM。 图5表示免疫小鼠对SMT的抗体反应。利用ELISA，评估接种了盐水、仅MPI^ -SE、仅rSMT或rSMT加MPL⑧_SE的小鼠抗SMT-IgGl和IgG2a的水平。用0. 1的0D值作 为临界值，计算终点滴度。每组使用3只小鼠，并示出每组终点滴度的平均值和SEM。
图6表示免疫小鼠在利什曼原虫抗原剌激下的细胞因子产生。用仅培养基、伴 刀豆球蛋白A(conA) 、 rSMT或SLA体外剌激来自接种了仅盐水、仅MPL⑧-SE、仅rSMT或 rSMT加MPL⑧-SE的小鼠的脾细胞。剌激72小时后，收集培养物上清液，并利用夹心 ELISA(sandwichELISA)测量上清液中IFN-y (A)禾P IL-10(B)的水平。插图表示的用不同 比例的SLA剌激时IFN- y反应。示出了每组3只小鼠的平均值和SEM。
图7显示了SMT特异性T细胞流式细胞术分析的结果。(A)代表流式细胞术数 据。(B)CD4+和CD8+T细胞响应SMT产生的TNF-a 、IL-2和IFN-y 。将来自给予了盐水、仅 MPL-SE、仅rSMT和rSMT加MPL-SE的小鼠的脾细胞与仅培养基或在rSMT存在的情况下培 养，通过流式细胞术分析细胞因子的产生。(C)对产生多种Thl型细胞因子的CD4+(左侧) 和CD8+(右侧)T细胞的单细胞分析。 图8表示通过SMT免疫防御婴儿利什曼原虫感染。用婴儿利什曼原虫激发接种了 盐水、MPl^-SE或rSMT+MPl^-SE的小鼠，并在感染后4周测量脾脏(A)和肝脏(B)中寄生虫的数量。示出每组5只小鼠的平均值和SEM。对比盐水和MPI^-SE两组，未配对 t检验(unpairedt-test)的*P < 0. 05且**P < 0. 01 。这代表具有类似结果的三个独立实 验。 图9表示通过SMT免疫防御硕大利什曼原虫感染。用硕大利什曼原虫在耳部激发 接种了盐水或rSMT+MP]^^-SE的小鼠。(A)监控感染部位的病变发展，8周。示出每组5 只小鼠的平均值和SEM。 (B)感染后8周，利用有限稀释测定，评估感染的耳部中寄生虫的 数量。线条表示单个组的平均值。这一实验代表具有类似结果的三个独立实验。
序列标识符的描述 SEQ ID N0 :1为婴儿利什曼原虫固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的氨基酸序列
SEQ ID NO :2为编码SEQ ID NO :1多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :3为杜氏利什曼原虫固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :4为编码SEQ ID NO :3多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :5为硕大利什曼原虫固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :6为编码SEQ ID NO :5多肽的核酸序列。 SEQ ID NO :7为美洲锥虫固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO :8为白色念珠菌(C. albicans)固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的 氨基酸序列。 SEQ ID NO :9_10为用于扩增婴儿利什曼原虫SMT可读框的引物 SEQ ID NO :11为巴西利什曼原虫固醇24_c_甲基转移酶(SMT)多肽的氨基酸序列。 SEQ ID NO :12为编码SEQ ID NO :11多肽的核酸序列。
发明的详细描述 如上文所述，本发明通常涉及预防、治疗和检测利什曼病的组合物和方法。本发明 的组合物包括，例如，多肽，其包含利什曼原虫固醇241-甲基转移酶(SMT)多肽的至少免 疫原性部分或此类SMT多肽的变体，其中该部分或变体基本上保留了与全长SMT多肽相同 或类似的免疫原性特性。如本文所进一步证明的，使用本发明组合物的免疫策略为防御婴 儿利什曼原虫提供了显著的体内保护，所述利什曼原虫是人类及犬科动物的VL致病因子。 此外，利用本发明组合物所实现的预防效果相对于以前报导的疫苗策略，表现出实质性进 步和优势。 如本文所用，"多肽"包含任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通 过共价键连接。包含SMT多肽免疫原性部分的多肽可由免疫原性部分单独组成，可含有两 个或多个免疫原性部分和/或可含有另外的序列。另外的序列可衍生于天然利什曼原虫 SMT多肽或可以是异源的，而且上述异源序列可以(但非必须)是免疫原性的。
利什曼原虫SMT多肽的免疫原性部分是能在以下情况中诱发免疫反应(例如细胞 和/或体液免疫)的部分在感染利什曼原虫不久或曾感染利什曼原虫的患者(诸如人或 犬)中和/或在分离自感染利什曼原虫不久或曾感染利什曼原虫的个体的淋巴结细胞或外 周血单核细胞(PBMC)的培养物中。诱发反应的细胞可包含各型细胞的混合物或可包含分 离的组成细胞(component cells,包括但不限于，T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞和/ 或B细胞)。在具体实施方案中，免疫原性部分能诱导T细胞增殖和/或占主导的Thl型细胞因子反应(例如T细胞和/或NK细胞产生的IL-2、 IFN- Y和/或TNF- a ;和/或单核 细胞、巨噬细胞和/或B细胞产生的IL-12)。通常可利用本领域技术人员所知的技术，包括 本文所提供的代表性方法在内，鉴定本文所述的抗原免疫原性部分。 SMT多肽的免疫原性部分基本上可为任何长度，只要它们保留了一个或多个负责 和/或有助于全长SMT多肽所提供的本文所述的防御利什曼病的体内保护作用的SMT免疫 原性部分。在一实施方案中，与天然蛋白相比，免疫原性部分与抗原特异性抗血清反应的能 力可增强或不变，或者与天然蛋白相比，免疫原性部分对抗原特异性抗血清反应的能力可 以有小于50%优选小于20%的降低。示例性部分的长度通常为至少10U5、25、50或100 个氨基酸，或者更多，直至并包括全长SMT多肽。在具体实施方案中，SMT多肽的免疫原性 部分为能例如在本文所述的体内测定中，提供防御杜氏利什曼原虫复合种中利什曼原虫种 类(Leishmania species)的保护作用的部分，所述杜氏利什曼原虫复合种即杜氏利什曼原 虫和/或婴儿利什曼原虫，其被认为是人类和犬科动物内脏利什曼病致病因子。
本发明的组合物和方法也包含上述多肽的变体。本文所用的多肽"变体"是在一 个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面不同于天然蛋白的多肽，因此与天然SMT多肽相 比，所需要的变体多肽的免疫原性并没有实质性降低。在一实施方案中，与天然蛋白相比， 变体与抗原特异性抗血清反应的能力可增强或不变，或者与天然蛋白相比，变体与抗原特 异性抗血清反应的能力可以有小于50%和优选小于20%的降低。在具体实施方案中，SMT 多肽变体能例如在本文所述的体内测定中，提供防御杜氏利什曼原虫复合种即杜氏利什曼 原虫和/或婴儿利什曼原虫中利什曼原虫种类的保护作用。 变体通常可以通过修饰上述多肽序列的一种、评估修饰多肽与抗原特异性抗体或 抗血清的本文所述的反应性或进行本文所述的体内保护测定来鉴定。 多肽变体通常包括那些展示了与本文所公开的SMT多肽具有至少约70% 、75%、 80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一'性(例 如，如下文所述所测定的)的多肽。 在某些实施方案中，变体含有保守取代。"保守取代"为用一氨基酸取代另一具有 类似特性的氨基酸的取代，从而肽化学领域的技术人员将预料多肽的二级结构和水性不会 发生实质性改变。氨基酸取代通常基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或兼 性性质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基 酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的带有不带电荷的极性头部基团的氨基酸包括 亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，以及丝氨酸、苏氨酸、 苯丙氨酸和酪氨酸。其他可代表保守改变的氨基酸基团包括(l)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、 Gln、 Asn、 Ser、 Thr ; (2) Cys、 Ser、 Tyr、 Thr ;(3)Val、 Ile、 Leu、 Met、 Ala、 Phe ;(4)Lys、Arg、 His;和(5)Phe、Tyr、Trp、His。变体也可以或可择地含有非保守改变。在具体实施方案中， 变体多肽通过5个或更少氨基酸的取代、缺失或添加而不同于天然序列。变体也可以(或 可选地)通过例如氨基酸的缺失或添加进行修饰，所述氨基酸的缺失或添加对多肽的免疫 原性、二级结构和水性的影响最小。 多核苷酸可以包含天然序列(即编码蛋白或其部分的内源性序列)或可以包含此 类序列的变体或生物学或抗原功能性等同物。如下文进一步所述，多核苷酸变体可以含有 一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选，与天然肿瘤蛋白相比，编码的多肽的免疫原
7性没有实质性降低。对编码的多肽免疫原性的影响可按本文所述进行评估。
当比较多核苷酸或多肽序列时，两条序列中的核苷酸或氨基酸序列在如下文所述 进行最大相似性比对时如果相同，则这两条序列被称为"相同的"。两条序列的比较通常通 过在比较窗(comparison window)内比较序列以确定和比较序列相似性的局部区域。本文 所用"比较窗"指至少约20个、通常30个-约75个、40个-约50个连续位置的节段，其中 在将两条序列进行最佳比对后，可将序列可与相同数量连续位置的参照序列进行比较。
利用生物信息学软件(DNASTAR， Inc. ， Madison， WI)Lasergene组中的Megalign
程序，其使用默认参数，可进行用于比较的序列比对。这一程序所包含的几个比对方 案描述以下参考文献中Dayhoff， M. 0. Q978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships,其位于Dayhoff， M. 0.(编 辑)Atlas of ProteinSequence and Structure (蛋白序列禾口结构的图谱)，National BiomedicalResearch Foundation, Washington DC Vol. 5， S卯pl. 3， pp. 345-358 ; Hein(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp.626-645Methods in Enzymology vol. 183， Academic Press, Inc. ， San Diego， CA ;Higgins and Sharp(1989) CABI0S 5 :151-153 ;Myers， E. W. and Muller W. (1988)CABI0S 4 :11_17 ;Robi固n， E. D. (1971)Comb. Theor 11 :105 ;Santou， N. Nes， M. (1987)Mol. Biol. Evol. 4 :406—425 ; Sneath and Sokal(1973)Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of NumericalTaxonomy，Freeman Press,San Francisco, CA ;Wilbur and Lipman(1983)Proc. Natl. Acad. ， Sci. USA 80 :726-730. 可选地，用于比较的序列比对可通过Smith and Waterman(1981)Add. APL Math 2 :482的局部同一性算法、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 :443的同一性 比对算法、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444的相似性方法 搜索、计算机执行这些算法(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA和 TFASTA， Genetics Computer Group (GCG) ， 575 Science Dr. ， Madison， WI)或检查来进行。
适用于测定百分比序列同 一 性和序列相似性的算法的 一 个实例，是BLAST和 BLAST 2. O算法，其分别描述于Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402和 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-410中。BLAST和BLAST 2. O可与本文所述的 参数一起使用，以测定本发明多核苷酸核和多肽的百分比序列同一性。进行BLAST分析的 软件可通过国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information) 公开获得。在一示例性的实施方案中，对核苷酸序列，利参数M(—对匹配残基的奖励分；总 是> 0)和参数N(不匹配残基的罚分；总是< O)，可计算累积分。对氨基酸序列而言，得分 矩阵可用来计算累积分。每一方向字串搜索(word hits)的延伸在以下情况下终止累积 比对分自其所获得最大值下降了 X ;由于一个或更多负得分残基比对的累积而导致的累积 分到达0或0以下；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、 T和X决定比对的灵敏度 和速度。BLASTN程序(对于核酸序列而言)使用的缺省值为字长(W)ll，期望值(E)10，以 及BL0SUM62得分矩阵(参见Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915)比对，(B) 50，期望值(E) 10， M = 5， N = -4和两链比较。 优选地，"序列同一性百分比"通过在至少20个位置的比较窗中比较两条最佳 比对的序列来测定，其中，对比窗中多核苷酸或多肽序列的部分与用于两条序列最佳比对的参照序列(其不包含添加或缺失)对相比，可包含20%或更少，通常为5%-15%，或 10% -12%的添加或缺失(即缺口 )。百分比的计算如下测定两个序列中存在相同核苷酸 碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，匹配位置的数量除以参照序列中 位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以ioo产生序列同一性百分比。
因此，本发明包含与本文所公开的序列具有实质同一性的多核苷酸和多肽，例如 利用本文所述方法(例如，如下文所述采用标准参数的BLAST分析)，与本发明的多核苷酸 或多肽序列相比，包含至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或 更高序列同一性的多核苷酸和多肽。本领域技术人员应当理解，这些值可通过考虑密码子 简并性、氨基酸相似性、阅读框(reading frame)定位等进行适当的调整，以测定两条核苷 酸序列所编码的蛋白的相应同一性。 在另外的实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸和多肽，其包含各种长度的 与本文所公开的一个或多个序列相同或互补的一段连续序列。例如，本发明所提供的多 核苷酸包含本文所公开的一个或更多个序列的至少约15、20、30、40、50、75、100、150、200、 300、400、500或1000或多个连续核苷酸，以及其所有中间长度。很容易理解的是，本文中的 "中间长度"表示任何介于引用值之间的长度，诸如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、 32等；50、51、52、53等；100、 101、 102、 103等；150、 151、 152、 153等；包括所有贯穿200-500、 5000-1000等的整数。 本发明的多核苷酸或其片段，不管编码序列自身的长度，可与其他的DNA序列结 合，诸如启动子、多腺苷酸化信号、其他限制酶位点、多克隆位点、其他编码节段等，它们的 全长从而可能有显著差异。因此预计几乎可使用任何长度的核酸片段，总的长度优选以便 于在既定重组DNA试验方案中制备和使用为限。例如，预计全长长度约10000、约5000、约 3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个等(包括所有中间长度)碱基对的示 例性DNA节段可用于本发明的许多实施方案中。 在另一实例中，本发明涉及能在适度严格条件下与本文所提供的多核苷酸序列或 其片段或其互补序列杂交的多核苷酸。杂交技术在分子生物学领域中是熟知的。出于说 明的目的，用于检测本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的适度严格条件包括5X SSC、 0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH 8. 0)溶液中的预洗涤；5(TC _65"下5XSSC杂交过夜；随后用 每一含有0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65t:下洗涤两次持续20分钟。
而且，本领域普通技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码本文 所述多肽的核酸序列。这些多核苷酸中的一些产生极小的与任何天然基因的核苷酸序列的 同源性。尽管如此，由于密码子使用不同而导致差异的多核苷酸是本发明特别考虑的。此 外，包含本文所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因位于本发明范围内。等位基因是由 于一个或多个诸如核苷酸的缺失、添加和/或取代等的突变而改变的内源基因。由此得到 的mRNA和蛋白可以，但不是必须的，具有改变的结构或功能。可应用标准技术(诸如杂交、 扩增和/或数据库序列比较)鉴定等位基因。 本发明的另一方面提供了融合多肽以及编码此类融合多肽的多核苷酸，所述融合 多肽包含SMT多肽的至少免疫原性部分且还包含异源融合伴侣。例如，在一实施方案中，融 合多肽包含SMT多肽的一个或多个免疫原性部分和一个或多个其他的免疫原性利什曼原 虫序列，所述序列经肽键连接成氨基酸单链。在另一实施方案中，融合多肽可包含多个利什曼原虫抗原表位，其中表位中至少一个来源于SMT多肽。如本文所用的"表位"，是与来自利 什曼原虫感染个体的血液样本发生反应的抗原的一部分(即与此类血液样本中的一种或 多种抗体和/或T细胞特异性结合的表位)。 在另一实施方案中，异源融合伴侣包含辅助提供T辅助细胞表位(免疫融合伴 侣)、优选人识别的T辅助细胞表位，或辅助表达比天然重组蛋白产量更高的蛋白(表 达增强子)的序列。某些优选的融合伴侣包括免疫融合伴侣和表达增强融合伴侣两 者。可选择其他融合伴侣来增加蛋白的溶解度，或使蛋白靶向于所期望的细胞内区室 (compartments)。更多的融合伴侣包括促进蛋白纯化的亲和标签。 在一具体实施方案中，免疫融合伴侣包含衍生于D蛋白的序列，D蛋白是衍生于革 兰氏阴性菌B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza B) (W091/18926)的表面蛋白。例 如，D蛋白衍生物包含该蛋白的前三分之一 (例如N末端的前100-110个氨基酸)，D蛋白 衍生物可进行脂质修饰。在某些实施方案中，N末端上包括D脂蛋白融合伴侣的前109个 残基，以提供具有其他外源性T细胞表位的多肽和增强在E. coli中的表达水平(从而发挥 表达增强子的功能)。脂质尾部确保抗原对抗原呈递细胞的最佳呈递。其他示例性融合伴 侣包括源于流感病毒的非结构性蛋白即NS1 (血凝素)。尽管也可以使用包括T辅助细胞表 位的不同片段，但通常使用N末端的81个氨基酸。 在另一具体实施方案中，免疫融合伴侣包含衍生于称为LYTA蛋白或其一部分(优 选C末端部分)的氨基酸序列。LYTA衍生于肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)，其 合成称为LYTA酰胺酶的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；Gene (1986) 43 : 265-292)。 LYTA是特异性降解肽聚糖主链中某些键的自溶素。LYTA蛋白的C末端结构域 负责对胆碱或一些诸如DEAE的胆碱类似物的亲和性。这一特性已用于研发可用来表达融 合蛋白的E.coli C-LYTA表达质粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化已有 描述(见Biotechnology (1992) 10 :795-798)。在具体实施方案中，LYTA的重复部分可并 入融合蛋白中。在始于残基178处的C末端区发现重复部分。更具体的重复部分合并残基 188-305。 融合序列可直接连接(即无插入氨基酸)或可经由不显著减少组成多肽的免疫原 性特性的连接体序列连接(例如，Gly-Cys-Gly)。形成融合蛋白的多肽通常连接C末端到 N末端，尽管它们也可以连接C末端到C末端、N末端到N末端或N末端到C末端。融合蛋 白的多肽可以任何顺序排列。融合多肽或融合蛋白也可包括保守修饰变体、多态性变体、等 位基因、突变体、子序列、种间同系物和构成融合蛋白的抗原的免疫原性片段。
通常可应用包括重组技术、化学连接等标准技术制备融合多肽。例如，编码融合物 多肽组分的DNA序列可单独组装然后连接到合适的表达载体上。将编码一多肽组分的DNA 序列的3'末端，经或不经肽连接体，连接于编码另一多肽组分的DNA序列的5'末端，因此 序列的阅读框在框架中。这可允许翻译为保留组分多肽生物学活性的单一融合多肽。
肽连接体序列可用于以足以确保每一多肽折叠成其所需要的二级和/或三级结 构的距离，分隔融合组分。利用领域所熟知的标准技术，可将此类肽连接体序列合并入融合 多肽中。合适的肽连接体序列可基于以下一个或多个因素进行选择(l)它们采用弹性延 伸构象的能力；(2)它们不能采用能与第一和第二多肽上的功能表位相互作用的二级结构 的能力；和(3)可与多肽功能表位相互作用的疏水或带电荷残基的缺乏。某些优选的肽连接体序列包含Gly、 Asn和Ser残基。其他近中性氨基酸，诸如Thr和Ala也可用于连接体 序列中。可有效用作连接体使用的氨基酸序列包括下述文献中所公开的那些氨基酸序列 Maratea et al. ， (1985)Gene 40 :39-46 ;Murphy et al. ， (1986)Proc. Natl. Acad. Sci USA 83 :8258-8262 ;美国专利第4， 935， 233号和美国专利第4， 751， 180号。连接体序列的长度 通常为1个_约50个氨基酸。当第一或第二多肽具有可用于分隔功能结构域和防止空间 干扰的非必需N末端氨基酸区域时，连接体是不需要的。 将连接的DNA序列可操作地连接于合适的转录或翻译调节元件。负责DNA表达的 调节元件仅位于编码第一多肽的DNA序列的5'端。同样，终止翻译所需的终止密码子和转 录终止信号只存在于编码第二个多肽的DNA序列的3'端。 通常，分离多肽和融合多肽(及编码它们的多核苷酸)。"分离的"多肽或多核苷 酸为自其初始环境中移除的多肽或多核苷酸。例如，如果从一些或所有的自然系统中共存 的物质中分离天然存在的蛋白质，那么这种天然蛋白为分离的。优选地，此类多肽的纯度为 至少约90% ，更优选至少约95% ，和最优选至少约99% 。如果，例如将多核苷酸克隆到一个 不是其自然环境的一部分的载体中，则认为这种多核苷酸是分离的。 本发明的利什曼原虫SMT多肽和多核苷酸可利用多种方法中的任何方法或利什 曼原虫种类中的任何种类制备或分离，所述利什曼原虫种包括但不只限于，杜氏利什曼原 虫、恰氏利什曼原虫(L. chagasi)、婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫 (L. amazonensis)、巴西利什曼原虫、巴拿马利什曼原虫(L. panamensis)、墨西哥利什曼原 虫(L. mexicana)、热带利什曼原虫(L. tropica)和圭亚那利什曼原虫(L. guyanensis)。此 类种类可从例如美国典型微生物菌种保藏中心(ATCC) (Rockville，MD)获得。
不管采用何种制备方法，本文所述的SMT多肽优选是免疫原性的。换言之，多肽 (和其免疫原性部分)能在分离于感染利什曼原虫不久或或曾经感染利什曼原虫的个体的 淋巴结细胞和/或外周血单核细胞(PBNC)的培养物中诱发免疫反应。更准确地说，抗原和 其免疫原性部分具有在分离于感染利什曼原虫不久或曾经感染利什曼原虫的个体的细胞 中诱导T细胞增殖和/或诱发占主导地位的Thl型细胞因子应答(例如，T细胞和/或NK细 胞产生IL-2、IFN-Y和/或TNF-a ;和/或单核细胞、巨噬细胞和/或B细胞产生IL-12)。 利什曼原虫感染的个体可以患有利什曼病型症状(诸如亚临床的、皮肤的、粘膜的或活跃 的内脏的)或可能无症状的。此类个体可利用技术领域普通技术人员所知的方法鉴定。基 于与下述至少之一相关的临床发现，鉴定个体患有利什曼病寄生虫病变处的分离，利什曼 原虫溶胞产物的阳性皮肤测试或阳性血清学测试。无症状的个体是没有疾病体征或症状的 感染个体。此类个体可以基于阳性血清学测试和/或利什曼原虫溶胞产物皮肤测试进行鉴 定。 术语"PBMC"指主要由存在于外周血中的淋巴细胞和单核细胞组成的有核细胞的 制剂，即包含细胞混合物又包含一种或多种纯化细胞类型制剂。PBMC可通过本领域中已知 的方法分离。例如，PBMC可经密度离心法通过例如Ficoll (Winthrop Laboratories,New York)分离。淋巴结培养物通常可通过用在弗氏完全佐剂中乳化的利什曼原虫前鞭毛体免 疫BALB/c小鼠(例如在足垫后部)来制备。免疫后可切除引流淋巴结。T细胞可在抗小 鼠Ig柱中纯化来移除B细胞，随后穿过交联葡聚糖凝胶G10(S印hadex G10)柱移除巨噬细 胞。同样，进行淋巴结活检或者手术衣橱后，淋巴结细胞可从人体分离。
例如，将细胞与SMT多肽接触然后测量合适的反应，可评估利什曼原虫SMT多肽，或其部分、变体或融合物诱发外周血单核细胞(PBMC)或淋巴结细胞培养物反应的能力。通常，足够用于评估约2乂105个细胞的多肽数量范围为约10ng-约lOOiig，且优选约l-10yg。多肽与细胞的孵育通常在37t:进行，持续约l-3天。与多肽一起孵育后，测定细胞的适当反应。如果该反应是增殖反应，则可以使用本领域普通技术人员所熟知的多种技术中的任何技术。例如，可将细胞暴露于放射性胸苷的脉冲下，并测量掺入细胞DNA中的标记物。通常，可导致增殖增加超过背景(即在未用多肽培养的细胞中所观察到的增殖)至少3倍的多肽，被认为能诱导增殖。 可选地，待测量的反应可以是一种或多种细胞因子(如干扰素-y (IFN-y)、白细胞介素_4 (IL-4)、白细胞介素-12 (p70和/或p40)、白细胞介素_2 (IL-2)和/或肿瘤坏死因子-a (TNF- a ))的分泌或编码一种或多种特异性细胞因子的mRNA水平的变化。例如，干扰素_ y 、白细胞介素_2、肿瘤坏死因子_ a和/或白细胞介素-12的分泌预示着Thl反应，Thl反应负责防御利什曼原虫的保护作用。通常可利用本领域普通技术人员已知的方法，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)，对任何上述细胞因子进行测定。此类测定中所使用的合适的抗体可从多种来源获得，如Chemicon、Temucula，CA和PharMingen San Diego CA获得，且通常按照制造商的说明书使用。编码一种或多种特异性细胞因子的mRNA水平，可通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增来评价。通常，在约1-3乂105个细胞制剂中，能诱导产生30pg/mL的IL-12、 IL_4、 IFN- y 、 TNF- a或IL-12p40，或10pg/mL的IL-12p70的多肽，被认为能剌激细胞因子的产生。 利用熟知的技术，如Paul, Fundamental Immunology (基础免疫学)，3rd ed.(第三版)，243-247 (Raven Press, 1993)中总结的技术和其引用的参考文献中的技术，可制备和评价利什曼原虫SMT多肽的免疫原性部分。此类技术包括利用例如本文所述的代表性技术筛选衍生于天然抗原的多肽的免疫原性特性。 除了重组多肽表达外，SMT多肽、部分和变体可通过合成或重组方法产生。可利用本领域普通技术人员所熟知的技术产生具有少于约100个氨基酸，通常少于约50个氨基酸的合成多肽。例如，可利用任何商业上可获取的诸如Merrifield固相合成方法的固相技术合成此类多肽，其中将氨基酸依次添加到逐渐增长的氨基酸链上(参见Merrifield，(1963)J Am. Chem. Soc. 85 :2149-2146)。自动合成多肽的设备可自诸如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division,Foster City， CA等供应商处商购获得，并可按照制造商的用法说明操作。 含有天然SMT多肽的部分和/或变体的重组多肽，可利用熟知和确定的技术自编码抗原的DNA序列中很容易地制备。例如，来自将重组蛋白分泌到培养基中的合适的宿主/载体系统的上清液，可首先利用商购获得的过滤器浓縮。浓縮后，可将浓縮物应用于诸如亲和性基质或离子交换树脂等合适的纯化基质中。 通常，可使用本领域普通技术人员所知的多种表达载体中的任何表达载体来表达本发明的重组多肽。可在用包含编码重组多肽的多核苷酸的表达载体转化或转染的任何合适的宿主细胞中实现表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞和高等真核细胞。优选，所用的宿主细胞为E. coli、酵母或诸如COS或CHO的哺乳动物细胞系。以这种方式表达的DNA序列可编码天然存在的抗原、天然存在的抗原的一部分，或其其他变体。例如，天然
12抗原的变体通常可利用诸如寡核苷酸定点特异性诱变的标准诱变技术制备，而且可移除部分DNA序列以允许制备截短的多肽。 在某些方面，将本文所述的多肽、多核苷酸、部分、变体、融合多肽等并入药物组合物或疫苗中。药物组合物通常包含与生理学可接受载体组合的本文所述的一种或多种多肽、多核苷酸、部分、变体、融合蛋白等。疫苗，也称为免疫原性组合物，通常包含与诸如佐剂免疫剌激剂组合的、本文所述的一种或多种多肽、多核苷酸、部分、变种、融合蛋白等。
免疫剌激剂可以是提高或强化针对外源性抗原的免疫反应(抗体和/或细胞介导的)的任何物质。免疫剌激剂的实例包括佐剂、生物可降解的小球体(例如聚乳酸乳液(polytactic galactide))和脂质体(将化合物并于其中，参见例如Fullerton的美国专利第4， 235， 877号)。疫苗制剂通常描述于例如Powell & Newman ， eds. ， Vaccine Design(thesub皿itend adj證nt即proach)(疫苗设计(亚单位禾口佐剂方法))(1995)。
多种免疫剌激剂中的任何免疫剌激剂都可用于本发明的疫苗中。例如佐剂可以包括其中。许多佐剂包含有适于保护抗原避免遭快速代谢的诸如氢氧化铝或矿物油的物质，和诸如脂质A(天然的或合成的)、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)或分支杆菌(Mycobacterium)种类或分支杆菌来源的蛋白的免疫反应剌激剂。合适的佐剂是可商购获得，例如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich.) ;Merck佐剂65(Merck and Company, Inc. ，Rahway，N. J) ;AS-2禾口其衍生物(GlaxoSmithKline Beecham，Philadelphia, Pa.) ;CWS、 TDM、白细胞干扰素，诸如氢氧化铝凝胶(明砜)或磷酸铝的铝盐；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不可溶性悬浮液；酰化糖；阳离子型或阴离子型多糖衍生物；磷腈；生物可降解的小球体；单磷酰脂质A和皂苷A。也可使用诸如GM_CSF或白细胞介素_2、7或12的细胞因子，作为佐剂。 可用于本发明的其他示例性佐剂包括，诸如TLR7激动剂、TLR7/8激动剂等Toll样受体激动剂。其他示例性佐剂还包括咪喹莫德(imiquimod)、 gardiquimod、瑞喹莫德(resiquimod)禾口相关4t合物。 某些优选的疫苗使用适于诱导Thl型占主导的免疫反应的佐剂系统。高水平的Thl型细胞因子(例如IFN-y 、 TNF-a . 、 IL_2和IL-12)倾向于加强诱导针对所给予的抗原的细胞介导的免疫反应。与此相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于加强诱导体液免疫反应。应用本文所提供的疫苗后，患者将维持包括Thl型和Th2型反应在内的免疫反应。在Thl型反应为主导的优选实施方案中，Thl型细胞因子的水平提高到高于Th2型细胞因子水平的程度。可应用标准测定方便地评估这些细胞因子的水平。有关细胞因子家族的综述，参见Mossman和Coffman， (1989) Ann. Rev. Immunol. 7 :145-173。 可用于诱发占主导的Thl型反应的某些佐剂包括，例如单磷酰脂质A优选3-脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MP1")与铝盐(美国专利第4，436，727号、第4，877，611号、第4， 866， 034号和第4， 912， 094号)的组合。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导占主导的Thl反应。此类寡核苷酸是所熟知的，并描述于WO 96/02555、W099/33488和美国专利第6， 008， 200号和第5， 856， 462号中。免疫剌激性DNA序列也有描述，例如由Sato et al. ， (1996) Science 273 :352描述。另一示例性的佐剂包含诸如皂苷A的皂苷或其衍生物，包括QS21禾口 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc. ，Framingham，Mass.);七叶皂苷(escin);洋地黄皂苷(digitonin);或丝石竹(Gypsophila)或昆诺藜(Chenopodiumquinoa)皂苷。其他示例性的制剂包括本发明佐剂组合中的一种以上皂苷，所述佐剂组合例如QS21、 QS7、皂苷A、 13 -七叶皂苷或洋地黄皂苷中至少两种的组合。 在具体实施方案中，佐剂系统包括单磷酰脂质A和皂角苷衍生物的组合，诸如在WO 94/00153所述的QS21和3D-MPL 佐剂的组合，或如W0 96/33739所述的不良反应小的组合物，其中QS21被胆固醇所淬火。其他制剂包含水包油乳剂和维生素E。 W0 95/17210中描述了另一种使用QS21、3D-MP1"佐剂和水包油乳剂中的维生素E的佐剂制剂。
另一种加强型佐剂系统包括WO 00/09159所述的含CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合。 在某些优选的具体实例中，本发明所用的佐剂为未决的美国专利申请公开第20080131466号所述的吡喃葡糖脂质A(GLA)佐剂，在此通过引用将其所公开的内容全部并入。 其他示例性的佐剂包括Montanide ISA 720 (S印pic， France) 、 SAF (Chiron，Calif ， United States) 、 ISC0MS(CSL) 、 MF-59 (Chiron) 、 SBAS佐剂系列(SBAS_2、 AS2 '、AS2 〃 、 SBAS-4或SBAS6，可自SmithKlineBeecham， Rixensart， Belgium获得)、Detox、RC-529 (Corixa， Hamilton, Mont)，和未决的美国专利申请序列第08/853,826号和第09/074， 720号所述的其他氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGPs)(在此通过引用将两者所公开的内容全部并入)，以及W099/52549A1所述的聚氧乙烯乙醚佐剂。 本发明的组合物也可以或可选地包含对利什曼原虫SMT抗原具特异性的T细胞。通常可在体内或体外利用标准方法制备此类细胞。例如，T细胞可从患者的骨髓、外周血或部分骨髓或外周血中分离。可选地，T细胞可衍生于相关的或不相关的人类、非人类哺乳动物、细胞系或培养物。 可用本发明的多肽、编码此类多肽的多核苷酸和/或表达此类多肽的抗原呈递细胞(antigen presenting cell, APC)剌激T细胞。此类剌激在一定条件下进行，持续的时间足以允许对多肽具有特异性的T细胞传代。优选地，多肽或多核苷酸存在于诸如小球体的运输载体中，以易于特异性T细胞的传代。 如果T细胞特异性增殖、分泌细胞因子或杀伤包被有多肽或编码该多肽的表达基因的靶细胞，则认为T细胞对本发明的多肽具特异性。可利用标准技术中的任何技术评估T细胞的特异性。例如，在铬释放测定或扩展测定中，与阴性对照相比，剌激指数在溶解和/或增殖中增加两倍以上，预示T细胞特异性。例如可按Chen et al. ， (1994)CancerRes. 54 :1065-1070)中所述，进行此类测定。可选地，可利用多种已知技术实现T细胞增殖检测。例如，可通过测量DNA合成的增加来检测T细胞增殖(例如，通过用含氚的胸腺嘧啶脉冲标记T细胞培养物，并测量掺入DNA中的含氚的胸腺嘧啶的量)。与本发明的多肽(100ng/ml-100 ii g/ml，优选200ng/ml-25 y g/ml)接触3_7天，应该会导致T细胞增殖增加至少两倍。如上所述的接触2-3小时，应该会导致T细胞激活，这是利用标准细胞因子测定来测量的，其中细胞因子(例如TNF或IFN-y)释放水平增加2倍预示着T细胞激活(参见Coliganet al. ， (1998)Current Protocols in Immunology,vol. 1)。 口向应多肽、多核苷酸或表达多肽的APC而激活的T细胞，可以是CD4+和/或CD8+。蛋白特异性T细胞可利用标准技术扩增。在优选的实施方案中，T细胞来源于患者、相关供体或无关供体，并在剌激和扩增后，给予所述患者。 在本发明的组合物中，药学可接受的赋形剂和载体溶液的配制，对本领域技术人
员而言是熟知的，如同在多种治疗方案中，包括例如口月艮，胃肠夕卜，静脉内，鼻内和肌肉内给
药和制剂在内，为使用本文所述的具体组合物探索合适的剂量给药和治疗方案。 在某些应用中，本文所公开的组合物可经口服给药送递至个体。就此而论，这些组
合物可以用惰性稀释剂或用可吸收的可食用载体配制，或它们可包于硬壳或软壳明胶胶囊
中，或它们可压縮成片剂，或它们可以直接掺入到膳食食品中。 在某些情况下，希望本文所公开的组合物送递方式为胃肠外、静脉内、粘膜内，或甚至腹膜内，例如如美国专利第5， 543， 158号、美国专利第5， 641， 515号和美国专利第5， 399， 363号所述(在此特别通过引用将每个专利全文并入)。作为游离碱或药学可接受的盐的活性成分的溶液，可在与诸如羟基丙基纤维素的表面活性剂适当混合的水中制备。分散剂也可在甘油、液态聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。 适于注射使用的药物剂型(pharmaceutical form)包括无菌水溶液或分散剂和用于临时制备无菌注射液或分散剂的无菌粉末(美国专利第5， 466， 468号，在此将其通过引用全文并入)。任何情况下，剂型必须为无菌的且流动性达到易于注射的程度。在制造和储存情况下，它必须是稳定的，且必须预防诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的包被，在分散剂的情况下通过维持所需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳荥(thimerosal)等，可促进对微生物作用的防御。许多情况下，优选包括等渗剂，例如，糖或氯化钠。在组合物中使用延缓吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以使可注射组合物的吸收延长。
为实现胃肠外水溶液给药，例如，如果需要，应适当地缓冲溶液，并且首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体的水溶液尤其适用于静脉内的、粘膜内的、皮下和腹膜内给药。因此，按照本发明的公开内容，能使用的无菌水性介质对本领域技术人员而言是已知的。例如，一次剂量可溶解于lml的等渗NaCl溶液中，或也可添加到1000ml皮下输液或注射到推荐的输注部位(例如见Remington' sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)，15th Edition,卯.1035-1038和1570-1580)。依照所治疗个体的情况，必然存在剂量上的某些差异。负责给药的人员在任何情况下都确定单个个体的合适剂量。而且，对于对人给药，制剂应当满足无菌、热原性和FDA生物制品标准办公室(FDA Office ofBiologies standards)所要求的一般安全性和纯度标准。 无菌注射溶液的制备如下通过将所需数量的活性化合物与上文所列举的其他组分一起并入到适当的溶剂中，如果需要，随后过滤灭菌。通常，通过将各种已灭菌的活性组分并入到包含基础分散介质和上文所列举的所需要的其他组分的无菌媒介(sterilevehicle)中，制备分散剂。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，这可产生活性组分与其早前无菌过滤的溶液中的任何其他所需组分的粉末。 本文公开的组合物可配制成中性的或盐的形式。药学可接受的盐包括酸式加成盐
15(由蛋白的游离氨基基团形成的)和由例如如同盐酸、磷酸的无机酸或如同乙酸、草酸、酒 石酸、苦杏仁酸等有机酸形成。游离的羧基基团形成的盐也可以衍生于诸如氢氧化钠、氢氧 化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如同异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等 有机碱。配制后，溶液将以与制剂剂量相配伍的方式并以治疗有效量给药。制剂易于采用 多种剂型给药，诸如可注射的溶液、药物释放胶囊等剂型。 本文所用的"载体"包括，任何和所有的溶剂、分散剂、介质、媒介、包被、稀释剂、抗 菌和抗真菌剂、等渗剂和延缓吸收剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂 在药物活性物质中的用途，在本领域内是熟知的。除了任何常规介质或试剂与活性组分不 相容外，其在治疗组合物中的应用是经过考虑的。辅助活性组分也可以并入组合物中。
短语"药学可接受的"指当给予人时不会产生变态反应或类似的不良反应的分子 实体和组合物。包含作为活性成分的蛋白的水性组合物的制备，在本领域内业已充分理解。 通常将此类组合物制成可注射的液态溶液或悬浮液；也可以制备注射前适于液体溶液或悬 浮液的固体形式。也可以乳化制剂。 在某些实施方案中，组合物可经鼻内喷雾、吸入和/或其他气雾剂送递媒介送递。 将基因、多核苷酸和肽组合物经鼻内气雾剂喷雾直接送递至肺部的方法，已描述于例如美 国专利第5， 756， 353号和美国专利第5， 804， 212号(在此特地将每一专利通过引用全文并 入)中。同样，利用鼻内微粒体树脂送递药物(Takenaga et al. ， 1998)和溶血磷脂丙三 醇化合物(美国专利第5， 725， 871号，在此特地将其通过引用全文并入)，在药学领域内也 是所熟知的。同样，采用聚四氟乙烯支持基质的形式的跨粘膜药物送递描述于美国专利第 5， 780， 045号(在此特地将其通过引用全文并入)中。 在某些实施方案中，送递可利用脂质体、纳米胶囊、微粒、小球体、脂质颗粒、小囊 泡等发生，以便将本发明的组合物引入到合适的宿主细胞。尤其是，可配制本发明的组合 物，用于封入脂质颗粒、脂质体、小囊泡、纳米球、纳米颗粒等送递。应用已知的和常规技术 可此类送递媒介的配制和应用。 药物或免疫原性组合物可以可选地含有免疫剌激剂和编码一个或多个上文所述 的多肽或融合蛋白的DNA分子，以便原位产生所需要的多肽。在此类组合物中，DNA可存在 于本领域普通技术人员所知的多种送递系统中的任何送递系统中，包括核酸表达系统、细 菌和病毒表达系统。适当的核酸表达系统含有在患者中表达必需的DNA序列(诸如合适 的启动子和终止信号)。细菌送递系统包括给予在其细胞表面表达多肽的免疫原性部分的 细菌(如卡介苗)。在具体实施方案中，DNA可利用病毒表达系统(例如牛痘或其他牛病 毒、逆转录病毒或腺病毒)引入，这包括非致病的(缺陷的)、具有复制能力的病毒。将DNA 并人此类表达系统的技术，对本领域普通技术人员而言是熟知的。DNA也可以是"裸的"， 例如如Ulmer et al. ， (1993) Science259 :1745-1749所述和Cohen， (1993) Science 259: 1691-1692所评述的。通过将DNA包被到生物可降解的有效转运到细胞的珠上，可增加裸 DNA的吸收。 本发明的药物组合物和疫苗也可用于，例如诱导诸如人或犬的患者防御利什曼原 虫的保护性免疫，以预防利什曼病或减小其严重性。组合物和疫苗也可用于剌激患者的细 胞和/或体液的免疫反应以治疗已感染的个体。在一实施方案中，对利什曼原虫感染患者 而言，所产生的免疫反应包括优先的Thl免疫反应(即以产生细胞因子白细胞介素1、白细反应)。在另一实施方案中，对未感染的患者而言，免疫反应包括产生白细胞介素12和/或白细胞介素2，或剌激Y S-T细胞。在任一类型的患者中，所剌激的反应可包括产生IL-12。此类反应也可来自自利什曼原虫感染或未感染个体的PBMC或其组分的生物样本中诱导。如以上所述，通常可利用本领域普通技术人员所知的诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法对以上任何细胞因子及其他已知的细胞因子进行测定。 技术人员利用本领域中可获得的知识和/或常规技术，可容易地确定用于这些目的的合适的给药剂量和给药方法。用于本发明以上方面的给药途径和频率及剂量因人而异，而且可以与在抗其他感染的免疫中正用的并行，所述其他感染如包括原生动物、病毒和细菌感染。例如，在一实施方案中，在l年周期内给予1-12剂量。此后根据需要或期望，定期进行加强接种。当然对个体患者而言替换方案是适当的。在具体实施方案中，合适的剂量为当如以上所述给药时，能诱发免疫的患者产生足以保护患者免遭利什曼病至少1-2年的免疫反应的多肽或DNA的量。通常，剂量中存在的多肽的量(或由剂量中的DNA原位产生)范围为宿主每kg约lOOng-约lmg，通常约10 y g-约100 y g。合理的剂量大小因患者体量不同而各异，但通常在约0. lml-大约5ml内变动。 SMT组合物、融合多肽和多核苷酸也用作检测和/或监控患者利什曼原虫感染的诊断试剂。例如，本发明的组合物、融合多肽和多核苷酸可用于检测抗利什曼原虫的体液抗体或细胞介导的免疫的体外和体内测定中，用来诊断感染、监控疾病进展或评估治愈访视(test-of-cure)。 诊断方法和试剂盒优选使用SMT多肽、部分、变体等，选择性地与一种或多种其他利什曼原虫抗原组合。在某些实施方案中，在本发明的诊断方法中优选使用本文所述的多种抗原，例如3种或更多，4种或更多，5种或更多，6种或更多等。基本上抗原可用于所期望的任何测定形式，例如分别测定的单个抗原，同时测定的多种抗原，固定在诸如阵列等固体支持体上的抗原。 在一实施方案中，提供了用于检测生物样本中利什曼原虫感染的诊断试剂盒，其包含(a)包含本文所述SMT多肽的至少一个免疫原性部分的多肽，和(b)检测试剂。
在另一实施方案中，提供了用于检测生物样本中利什曼原虫感染的诊断试剂盒，其包含(a)对多肽具有特异性的抗体或其抗原结合片段，所述多肽包含本文所述SMT多肽的至少一个免疫原性部分，和(b)检测试剂。 在另一实施方案中，提供了用于检测生物样本中利什曼原虫感染存在的方法，其包含(a)将生物样本与结合本文所述SMT多肽的单克隆抗体接触；和(b)检测生物样本中结合该单克隆抗体的利什曼原虫蛋白的存在。 存在本领域普通技术人员所知的多种测定形式，用来利用纯化的抗原或融合多肽检测样本中的抗体。参见例如Harlow and Lane， Antibodies :A Laboratory Manual (抗体实验室手册)，Cold SpringHarbor Laboratory, 1988。在一实施方案中，测定包括用固定于固体支持体上的多肽结合并移除样本中的抗体。然后利用结合抗体/多肽复合体和含有可检测的报道基团的检测试剂，检测结合的抗体。合适的检测试剂包括结合抗体/多肽复合体的抗体和标记有报道基团的游离多肽(即在半竞争性测定中)。可选地，可应用竞争性测定，其中用报道基团标记与多肽结合的抗体，并在该抗原与样本一起孵育后，允许其与固定的抗原结合。样本组分抑制标记的抗体与多肽结合的程度，预示样本与固定的多肽的反应性。 固体支持体可为本领域普通技术人员所知的，可附着抗原的任何固体材料。例如，固体支持体可为微量滴定板或硝基纤维或其他合适的薄膜中的检测孔(test well)。可选地，支持体可以是诸如玻璃、玻璃纤维、胶乳的珠或盘，或诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯的塑料材料。支持体也可以是磁性颗粒或纤维光学传感器，诸如例如美国专利第5， 359， 681号中所公开的。 利用本领域已知且可获得的多种技术中的任何技术，可将多肽结合于固体支持载体上。术语"结合"既指诸如吸附的非共价连接和共价键合(其可以为抗原与支持体上的功能基团的直接键合，或可以为借助交联剂的键合)。优选经吸附结合于微量滴定板或薄膜中的？L。在这种情况下，通过在合适的缓冲液中将多肽与固相载体接触适当的时间，实现吸附。 在某些实施方案中，所用的诊断测定为酶联免疫吸附测定(ELISA)。这一测定可通过以下步骤进行首先将已固定于固体支持体上的多肽抗原与样本接触，固相载体通常为微量滴定板的孔，如此以来，允许样本中多肽的抗体与固定的多肽结合。然后自固定的多肽中移除未结合的样本，并添加能与固定的抗体-多肽复合体结合的检测试剂。然后利用合适的用于特异性检测试剂的方法，测定仍然与固体支持体结合的检测试剂的量。
—旦多肽固定于支持体上，通常就阻断了支持体上剩余的蛋白结合位点。本领域普通技术人员所知的任何合适的封闭剂，诸如牛血清白蛋白或吐温2(T(Sigma ChemicalCo. ，St. Louis，M0)。然后将固定的多肽与样本一起孵育，允许抗体(如果样本中存在的话)与抗原结合。在孵育前，样本可用合适的诸如磷酸盐缓冲液(PBS)等稀释剂稀释。通常，合适的接触时间(即孵育时间)为足以在感染的样本中检测针抗利什曼原虫的抗体存在的时间段。优选地，接触时间为足以实现结合抗体与未结合抗体间平衡时所实现的结合水平的至少95%的时间段。本领域普通技术人员应当理解，实现平衡所需要的时间可易于通过测定一定时间内发生的结合水平来测定。室温下，约30分钟的孵育时间通常是足够的。
通过用诸如含有O. 1X吐温20TM的PBS的合适缓冲液洗涤固相载体，可移除未结合的样本。随后可将检测试剂添加到固体支持体中。合适的检测试剂为可与固定的抗体-多肽复合体结合，并可利用本领域技术人员所知的多种方法检测中的任何方法检测的任何化合物。检测试剂通常含有与报道基团结合的结合剂(诸如，例如，蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白、植物凝集素或游离抗原)。示例性的报道基团包括酶(诸如辣根过氧化物酶)、基质、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。结合剂与报道基团的结合可利用本领域普通技术人员所知的标准方法来实现。 然后将检测试剂与固定的抗体-多肽复合体一起孵育，持续足以检测结合的抗体的时间量。合适的时间量通常根据制造商的用法说明或经测定一段时间内发生的结合水平来测定。然后移去未结合的检测试剂，并利用报道基团检测结合的检测试剂。检测报道基团所使用的方法取决于报道基团的性质。对于放射性基团而言，闪烁计数或放射自显影方法通常是合适的。光谱方法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。利用耦合于不同报道基团(通常为放射性基团或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白，可检测生物素。通常通过添加基质(通常持续特定的一段时间)，随后进行反应产物的光谱分析或其他分析，来检测酶报道基团。 为了测定样本中是否存在利什曼原虫抗体，通常将从仍然与固体支持体结合的报道基团中所检测的信号，与对应于预测定的临界值(cut-off value)的信号比较。临界值优选地为当固定的抗原与未感染患者来源的样本一起孵育时所获得的信号的平均值。通常，样本产生的信号高于平均值三个标准偏差以上，即可认为该样本是利什曼原虫抗体和利什曼原虫感染阳性的。在另一实施方案中，按照Sackett et al. ，Clinical Epidemiology :ABasic Science for Clinical Medicine,p. 106-7(Xittle Brown and Co. ， 1985)的方法，利用受试者工作特征曲线(Receiver Operator Curve)，测定临界值。简而言之，在本实施方案中，临界值可由真性阳性率(例如灵敏度)和假性阳性率(100%特异性)配对曲线确定，所述曲线对应于用于诊断检测结果的每个可能的临界值。曲线上最靠近左上角的临界值(即围绕着最大区域的值)为最准确的临界值，样本产生的信号高于这一方法所测定的界限值，即可认为该样本为阳性的。可选地，可将临界值沿曲线移到左侧，以使假性阳性率最小，或移到右侧，以使假性阴性率最小。通常，样本产生的信号高于这一方法所测定的界限值，即可认为该样本利什曼原虫感染阳性的。 在另一实施方案中，诊断测定可以以流通检测模式(flow-throughtest format)或带状检测模式(strip test format)进行，其中将抗原或融合多肽固化在诸如硝基化纤维的薄膜上。在流通检测中，当样本穿过薄膜时，样本中的抗体与固定的多肽结合。然后当含有检测试剂的溶液流过薄膜时，检测试剂(例如蛋白A-胶体金)与抗体-多肽复合体结合。然后如上所述，检测结合的检测试剂。在带状检测模式中，将薄膜与多肽结合的一端浸入到含有样本的溶液中。样本沿薄膜移动穿过含有检测试剂的部位，到达固定的多肽区。在多肽上的检测试剂浓度，预示样本中存在利什曼原虫抗体。通常上述检测可用非常少量(例如1滴)的患者血清或血液进行。 仍然在另一实施方案中，提供了利用对本发明的一种或多种抗原、融合多肽和/或免疫原性部分具特异性的抗体(其可为多克隆的或单克隆的)和/或T细胞，检测生物样本中利什曼原虫的方法。 本说明书所引用的所有出版物和专利申请在此通过引用并入，如同每篇单个细胞外或专利申请特别指出通过引用并入一样。 尽管为了理解清晰，已借助例证和实例相当详细地描述了上述发明，但显然，根据本发明的教导，对本领域普通技术人员而言，在没有背离所附加的权利要求的精神和范围的情况下，可对本发明做某些改变和修饰。仅以说明而非限制的方式，提供下述实施例。本领域技术人员应当很容易地认识到，可以改变或修饰以产生基本类似结果的各种非关键性参数。
实施例 实施例1 利用在佐剂中配制的利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶防御内脏利什曼病的保护性免疫 A.材料和方法
1.动物和寄生虫
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雌性C57BL/6小鼠购买于Charles River实验室(Wilmington, MA)，并保持在无特异性病原体的条件下。实验开始使用8-12周龄的小鼠。婴儿利什曼原虫(MH0M/BR/82/BA-2)的前鞭毛体培养于MEM(基本必需培养基)(Invitrogen， Carlsbad, CA)中，MEM添加了O. 5XMEM必需氨基酸溶液(Invitrogen) ，0. ImM MEM非必需氨基酸(Invitrogen) ， lmM丙酮酸钠，25mM HEPES(羟乙基哌嗪乙磺酸)，8. 3mM葡萄糖，26mM碳酸氢钠，1 y g/ml对氨基苯甲酸，50 g/ml庆大霉素，10%热灭活的胎牛血清和6 g/ml氯高铁血红素。杜氏利什曼原虫和硕大利什曼原虫(MH0M/IL/80/Friedlin)是由国立卫生研究院(NationalInstitutesof Health)的David Sacks博士惠赠的，并培养于之前所述的199培养基(Medium 199，Belkaid et al. ， (2002) J Immunol 168 :3992-4000)中。对数期或静止期晚期的前鞭毛体用于感染或抗原制备。 2.婴儿利什曼原虫SMT的克隆和重组蛋白的产生 利用婴儿利什曼原虫基因组DNA，用5' CAA TTA CAT ATG TCCGCC GGT GGC CGTG(SEQ ID NO :9) 、3' CAA TTA AAG CTT CTAAGC CTG CTT GGA CGG(SEQ ID NO :10)引物对，经PCR，扩增婴儿利什曼原虫SMT的可读框。将扩增的PCR产物用6X组氨酸标记框内插入pET-28a载体(EMD Biosciences, San Diego， CA)中，且对插入物进行测序。通过Clustal方法利用MegAlign软件包(DNASTAR Inc. ，Madison，WI)，将婴儿利什曼原虫SMT的推断的氨基酸序列，与自NCBI数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov)获得的杜氏利什曼原虫(登录号AAR92098)、硕大利什曼原虫(CAJ09196)、美洲锥虫(EAN81270)和白色念珠菌(AAC26626)的SMT氨基酸序列进行对比。 将用于婴儿利什曼原虫SMT克隆的pET-28a载体转化到E. coliRosetta中。并与1M异丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG) —起孵育诱导重组蛋白的表达。然后用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen Inc. ， Valencia, CA)，将rSMT纯化为6X组氨酸标记的蛋白。利用BCA蛋白测定(PierceBiotechnology Inc. ，Rockford， IL)，测量纯化蛋白的浓度。利用考马斯亮蓝染色，随后SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，评估蛋白的纯度。利用鲎阿米巴状细胞溶解物检测(CambrexCorporation， East Rutherford, NJ)，测量蛋白的内毒素水平，并显示低于10EU/mg蛋白。
3.免疫小鼠 以lOiig rSMT力口 20ii gMPL -SE(GlaxoSmithKline Biologicals， Rixensant，Belgium)共0. 1ml体积免疫小鼠。另一组小鼠用仅10 y grSMT给药。对照组仅接受盐水或MPL _SE。在小鼠的足垫右后部或尾根部，每隔3周，共进行3次皮下免疫。
4.蛋白质印迹法 将前鞭毛体悬浮于SDS样本缓冲液中，随后煮沸5分钟，制备用于免疫印迹的样本。含有5X10S个前鞭毛体的样本经SDS-PAGE分离并印迹于聚偏氟乙烯薄膜(polyvinylidene difluoride membrane)上。自rSMT力口 MPL-SE免疫的小鼠获得的多克隆抗体用于蛋白质印迹法。利用来自天然小鼠的同样稀释度的血清作为对照。然后用HRP-结合的羊抗鼠IgG(Rockland Immunochemicals, Inc. ， Gilbertsville， PA)探测薄膜。利用化学发光的超灵敏HRP基质试剂盒(Chemiluminescent Supersensitive HRP SubstrateKit，BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)进行显景》。
5.人抗SMT IgG的ELISA
在ELISA包被缓冲液中稀释rSMT，96-孔板按200ng/孔抗原进行包被，随后用含 有0.05X吐温-20(Tween-20)和1 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭。接下来，将平板 与巴西内脏利什曼病患者(n = 21)血清，及来自美洲锥虫病患者(n = 10)、地方病健康供 体(n = 10)和非地方病健康供体(n = 6)以1 : 200稀释的血清一起孵育。对于所有的 IgG而言，HRP-结合的抗-人IgG (Rockland Immunochemicals)用作二Ab。对于IgG亚类 测定而言，使用HRP-结合的抗-人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 (Invitrogen)。利用四甲联苯 胺过氧化物酶基质(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)进行平板显景》， 禾口通过酶标仪(microplate reader)在450nm处读取(570nm参考值)。
6.鼠抗SMT IgG的ELISA ELISA实验设计类似于上述方案，但是使用不同的一抗和二抗。在最后一次免疫 l周后，抽取每组3只小鼠的血液，用于Ab ELISA。在5倍连续稀释液中，将小鼠血清样本 稀释到1 : 100，并应用于平板。然后将平板与HRP-结合的羊抗鼠IgGl或IgG2 (Southern Biotech,Birmingham, AL) —起孵育。平板用基质显影并用酶标仪在450nm波长处读取。借 助Gr即hPad Prism软件，利用0. 10D值作为临界值，计算终点滴度。
7.使用脾细胞的细胞因子测定 在最后一次免疫2周后，由每组3只小鼠采集脾脏。将每孔完全RPMI培养基(添 加了 10X热灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和lOOii g/ml链霉素的PRMI)中的2乂105脾细 胞，平板接种于96孔板，然后用仅3ii g/ml伴刀豆球蛋白A、100ii g/ml婴儿利什曼原虫可 溶性溶解产物抗原(LiSLA) 、 10 g/ml rSMT或培养基剌激。培养72小时后，收集培养物上 清液并通过夹心ELISA检测IFN- y和IL-10的水平。
8.细胞内染色和流式细胞术 在最后一次免疫2周后，由每组3只小鼠采集脾脏。将每孔100 1完全PRMI中 的1 X 106脾细胞，平板接种于圆底96孔板，然后用仅PMA/伊吾诺霉素、10 g/ml rSMT 或培养基剌激。在剌激期间，将共同剌激抗体抗CD28(eBioscience， San Diego， CA)和 抗CD49d(eBioscience)添加到培养基中，以使孔中最终浓度为1 P g/ml。 37(TC下孵育2 小时后，将布雷菲德菌素A(GolgiPlug :BD Biosciences, San Jose， CA)添加到孔中，并 在37t:下继续孵育另外12小时。用50iU 1 : 50的抗CD16/32(eBioscience)封闭细 胞，然后用Alexa Fluor 700-抗-CD3 (eBioscience) 、 PerCP-抗-CD4 (BD Biosciences)、 PE-抗-CD8(BD Biosciences)染色。随后利用Cytof ix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences) 固定细胞。用抗-CD16/32再次封闭细胞，然后用FITC-抗-TNF- a (eBioscience)、 PacificBlue-抗-IL-2 (eBioscience)禾口 PE_Cy7_抗_IFN_ y / (BD Biosciences)进行细胞 内染色。利用LSRII FACS仪(BD Biosciences)和DIVA软件分析细胞。
9.婴儿利什曼原虫激发小鼠 在最后一次免疫3周后，用婴儿利什曼原虫激发每组7只小鼠。将5X 106婴儿利 什曼原虫悬浮于汉克(氏)平衡盐溶液(hypodermoclysisfluid)中，并静脉注射到小鼠尾 静脉中。激发后4周，处死小鼠，采集脾脏和肝脏，以便利用有限稀释测定，测定这些组织中 的寄生虫数量。用玻璃研磨器将这些组织匀浆化，在含有NNN血琼脂的96孔微量培养板中 用完全HOMEM将悬浮液连续地稀释两倍。平板接种IO天后，检查每个孔中寄生虫的存在， 并基于最后阳性孔的稀释剂，估算最初组织中的寄生虫数量。
B.结果 1.利什曼原虫种类表达SMT 利用特异引物，借助PCR扩增，自婴儿利什曼原虫总DNA中克隆SMT可读框。大 小为1062bp，而且序列与数据库(LinJ36. 4930 ; 1， 062bp， 353个氨基酸，39. 8kDa，获得自 GeneDB :www. genedb. org)中的100%匹配。利用NCBI数据库(丽w. ncbi. nlm. nih. gov)进 行的序列分析显示，婴儿利什曼原虫SMT与杜氏利什曼原虫、硕大利什曼原虫、巴西利什曼 原虫和美洲锥虫的SMTs分别有99. 6%、96. 6%、81%和66. 0%的同一性(图1A-1B)。
在E. coli中表达rSMT并纯化(图2)。预测蛋白的表观分子量(42kDa)。所产生 的抗rSMT的小鼠多克隆抗体用于通过蛋白质印迹分析检测利什曼原虫种类中的天然SMT。 在所有测验的利什曼原虫种类即杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和硕大利什曼原虫中， 抗SMTAb检测到表观分子量大小为38KD的带，这与预测的大小在同一范围，然而带的强度 不同(图3)。当来源于天然小鼠的血清作为一抗时，检测不到那些带。
2. VL患者血清识别rSMT 为测定利什曼原虫SMT在人类中抗原性，通过ELISA，应用来自21例巴西VL患者 的血清，检查内脏VL患者中针对rSMT和rK39的抗体的普遍性(prevalence) 。 rK39是血 清诊断性抗原，而且针对该抗原的抗体的存在，预示活跃的VL(Burns et al. ， (1993)Proc Natl Acad SciUSA 90:775779)。 21例中的19例显示了针对rK39的强烈的Ab反应，而且 这些反应在VL患者中是特异性的(图4A)。这些血清显示了针对rSMT的中度到强烈的反 应性，而且看起来这些Ab反应在VL患者中是特异性的，然而1例非地方病健康供体显示了 中度反应(图4B)。感染杜氏利什曼原虫的苏丹VL患者识别rSMT(数据没有显示)，表明 SMT在杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫感染患者中都是抗原性的。 进一步检查血清，以确定它们的IgG亚类。在VL患者血清中检测IgGl、 IgG2和 IgG3针对rK39的反应，且IgGl是主要的亚类(图4C)。针对rSMT的IgGl反应也是主要 的，尽管滴度比低于针对rK39的那些(图4D)。在VL患者血清中观察到一些针对rSMT的 IgG2反应，但是其不是VL特异性的，因为健康供体显示了针对这一抗原的IgG2反应。几乎 没有检测到IgG4针对rK39或rSMT的反应。 3. rSMT加MPL⑧_SE诱导具有Thl特征的免疫反应因为rSMT加MPL⑧_SE疫苗 诱导小鼠防御VL的保护作用，我们因而评估疫苗所诱导的免疫反应。用rSMT加MPI^-SE 免疫的小鼠显示强烈的针对rSMT的，以高水平的抗原特异性IgGl和IgG2a为特征的体液 免疫(图5)。相比之下，仅用rSMT的免疫导致IgGl为主的抗体反应。仅注射盐水或佐剂 的小鼠不显示针对rSMT的抗体反应。 为调查免疫所产生的细胞介导的反应，测量rSMT或LiSLA剌激下脾细胞所产生 的细胞因子。来自用rSMT加MPL -SE免疫的小鼠的脾细胞，响应rSMT ，产生高水平的 IFN- y (图6A)。这些小鼠也对LiSLA剌激作出反应，尽管所产生的IFN- y数量远低于rSMT 剌激所观察到的IFN-y数量。相比之下，来自仅用rSMT免疫的小鼠的脾细胞，响应rSMT， 仅产生低水平的IFN- y 。与仅rSMT给药相比，当MPL⑧-SE与抗原联合注射时，IFN- y / IL-10比率得以显著提高(图6B) 。 rSMT或LiSLA剌激下，仅盐水或佐剂组中未发现可检测 到的细胞因子产生。4. rSMT力口MPL⑧-SE诱导CD4+和CD8+T细胞表达多种Thl型细胞因子
为进一步调查rSMT加MP:l^^-SE接种所诱导的细胞反应，对CD4+和CD8+T细胞所 产生的Thl型细胞因子进行流式细胞术分析。将体外与SMT或不与SMT —起培养后收获的 脾细胞首先在前射光和测射光的基础上设门，然后CD3表达(图7A)。 CD4+和CD8+细胞进 一步自CD3+群体设门。分析这些群体中产生TNF- a 、 IL-2或IFN- y的细胞的频率。
FACS数据显示，抗原特异的CD4+和CD8+细胞受rSMT加MPL⑧_SE接种诱导(图 7B)。在rSMT剌激下产生TNF- a 、 IL-2或IFN- y的CD4+细胞，仅发现于该组小鼠中。抗 原特异CD8+细胞也发现于rSMT加MPL⑧-SE给药的小鼠中，而且产生TNF-a或IFN-y的 那些细胞的频率很高。 当在基于单细胞水平上的TNF-a 、IL-2或IFN-y表达模式，进一步将CD4+和CD8+ 细胞分为7个不同的群体时，表明许多产生多种细胞因子的抗原特异性T细胞被rSMT加 MPL -SE诱导(图7C) 。 rSMT剌激下，存在仅产生TNF- a的CD4+和CD8+细胞两者，而仅 表达IFN- y的细胞几乎没有。大多数产生IFN- y的抗原特异性CD4+T细胞共表达TNF- a 或TNF- a和IL-2两者。而且许多抗原特异性CD8+T细胞同时产生TNF- a和IFN- y 。
5. rSMT-免疫接种的小鼠抵抗婴儿利什曼原虫感染 为评估rSMT力口MPL⑧_SE接种防御VL的保护效果，利用静脉内注射5X 106个婴 儿利什曼原虫前鞭毛体激发免疫的小鼠。婴儿利什曼原虫感染期间，C57BL/6小鼠在感染 4周左右显示出肝脏内寄生虫负荷高峰(数据没有显示)。因此，我们选择4周作为一个时 间点来测定激发小鼠的脾脏和肝脏中寄生虫的数量。与仅用盐水或佐剂激发的小鼠相比， 在用rSMT加MPL⑧_SE免疫的小鼠中观察到寄生虫显著减少(图8)。与仅用盐水和佐剂 的组相比，免疫的小鼠显示，脾脏中寄生虫数量减少43倍和55倍，肝脏中寄生虫数量分别 减少111倍和117倍。在仅用盐水和佐剂的组中不存在显著差异。在SMT免疫的小鼠中重 复地观察到类似强度的保护作用。
C.讨论 用婴儿利什曼病原虫SMT免疫显著地保护了小鼠免遭婴儿利什曼原虫感染，其为 人类和犬科动物VL的致病因子，而且这种预防效果大大地强于任何先前所报导的候选疫 苗的效果。已存在数量有限的已证明在动物模型中诱导防VL的候选疫苗(Basu et al.， (2005) JImmunol 174 :7160-7171 ;Ghosh et al. ， (2001) Vaccine 20 :59-66 ;和Rafatiet al. ， (2006) Vaccine 24:2169-2175)。对大多数候选者而言，所观察到的保护水平是极微 弱的，寄生虫负荷通常仅减少2倍。在小鼠中，感染后4周左右肝脏中寄生虫数量显示出高 峰，随后减少。相比之下，在脾脏中观察到寄生虫持续性感染。与先前报导的抗原相比，本 发明的SMT免疫获得更高程度的保护作用，而且这种保护作用可同时在脾脏和肝脏中观察 到。 此外，两种VL致病因子即婴儿利什曼原虫和杜氏利什曼原虫，以及CL致病因子 即硕大利什曼原虫和CL及弥散性利什曼病(DL)致病因子即巴西利什曼原虫，都表达SMT。 这种SMT表达模式表明，该抗原也可用于其他形式的利什曼病中。而且，在用SMT免疫接 种时，与哺乳动物蛋白同源性的缺乏预计提供安全性优势。SMT也发现于其他病原体中，包 括寄生虫和真菌，诸如锥虫(Trypanosoma spp.) (Zhou etal. ， (2006) J Biol Chem 281: 6290-6296)、白色念珠菌(Jensen-Pergakes etal. ， (1998) Antimicrob Agents Chemother 42:1160-1167)禾口卡氏月市囊虫(Pneumocystis carinii) (Kaneshiro et al. ， (2001) JEukaryot MicrobiolSuppl :144S-146S)。因而，SMT也代表用于治疗除VL外的状况的候选 疫苗。 实施例2 用rSMT免疫的小鼠受到免遭硕大利什曼原虫感染的保护 将BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)保持在无特异性病原体的条件 下。实验开始时，小鼠8-12周龄。将硕大利什曼原虫(MH0M/IL/80/Friedlin)的前鞭毛体 培养于25°CT 199培养基(Mediuml99)中，该培养基添加了 20%热灭活的胎牛血清、每ml 100U的青霉素、每ml lOOii g链霉素、2mM左旋谷氨酰胺、0. lmM腺嘌呤、40mM HEPES、每ml 0.25mg氯高铁血红素和每ml 0. 31mg 6-生物素。对数期或静止期晚期的前鞭毛体用于感 染或抗原制备。 免疫5只小鼠组。第一组用盐水免疫，作为阴性对照。第二组用10 ii g rSMT加 20 ii g MPL -SE (GlaxoSmithKl ine Biologicals， Rixensant， Belgium)总体禾只为0. lml 免疫。作为激发剂，将2， 000个硕大利什曼原虫前鞭毛体悬浮于10 P 1磷酸盐缓冲液并皮 内注射到左耳和右耳。免疫实验方案完成后3周，感染小鼠。 通过利用公制游标卡尺测量耳部病变区硬结直径，每周监测感染进展，持续8周 (图9A)。 在激发后8周，收集耳部组织，以便利用有限稀释测定来测定寄生虫的数量。用研 磨器将该组织匀浆化，在含有NNN血琼脂的96孔微量培养板中用完全199培养基将悬浮液
连续稀释两倍。平板接种io天后，检查每个孔中寄生虫的存在，而且基于最后阳性孔的稀
释剂，估算最初组织中寄生虫的数量(图9B)。 实验结果证明，用rSMT免疫的小鼠显著保护防御为皮肤利什曼病致病因子的硕 大利什曼原虫。这些结果表明，用rSMT免疫能有效保护防御为内脏、皮肤、粘膜和弥散性利 什曼病致病因子的利什曼原虫病原体。 可以组合上文所述的各种实施方案，以便提供其他的实施方案。通过引用，全文并
入本说明书所涉及和/或申请资料页所列举的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专
利申请、国外的专利、国外的专利申请和非专利出版物。如有必要，可更改实施方案的各种
方面，以便应用各种专利、申请和出版物的概念再提供其他的实施方案。 根据上文的详述，可对实施方案做出这些或其他改变。总之，在所附的权利要求
中，所用的术语不应当解释为，限制说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，而应当解
释为包括所有可能的实施方案，以及授予权利的此类权利要求的等同物的全部范围。因此，
权利要求并不限于公开的内容。
权利要求
组合物，包含与免疫刺激剂组合的利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶(SMT)多肽或其免疫原性部分或变体。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述SMT多肽具有婴儿利什曼原虫(L. infantum) SMT多肽、杜氏利什曼原虫(L. donovani)SMT多肽和硕大利什曼原虫(L. major) SMT多肽或 巴西利什曼原虫(L.braziliensis)SMT多肽的氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述SMT多肽具有选自SEQID N0s :1、3、5或11中 任一序列所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NOs :1、3、5或11中任一序列具有至少90%同源 性的序列。
4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶(SMT)多 肽能在体内测定中提供防御婴儿利什曼原虫(L. infantum)的保护作用。
5. 如权利要求1所述的组合物，其中所述其免疫原性部分能在体内测定中提供防御婴 儿利什曼原虫(L. infantum)的保护作用。
6. 如权利要求1所述的组合物，其中所述其变体能在体内测定中提供防御婴儿利什曼 原虫(L. infantum)的保护作用。
7. 组合物，包含与免疫剌激剂组合的融合多肽，所述融合多肽包含权利要求1所述的 至少一种多肽和至少一种异源融合伴侣。
8. 组合物，包含与免疫剌激剂组合的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码权利 要求1所述的多肽。
9. 组合物，包含与免疫剌激剂组合的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码权利 要求7所述的融合多肽。
10. 如权利要求1、7、8或9中任一项所述的组合物，其中所述免疫剌激剂选自含CpG的 寡核苷酸、合成的脂质A、 MPLTM、3D-MP1"、皂苷、皂苷类似物、AGPs、 Toll样受体激动剂或其 组合。
11. 如权利要求1、7、8或9中任一项所述的组合物，其中所述免疫剌激剂为稳定的乳剂 中的MP1"。
12. 剌激哺乳动物免疫反应的方法，包括给予权利要求1、7、8或9中任一项所述的组合物。
13. 诱导哺乳动物防御利什曼病的保护性免疫的方法，包括给予权利要求1、7、8或9中 任一项所述的组合物。
全文摘要
公开了用于预防、治疗和检测利什曼病的组合物和方法。该组合物通常包含利什曼原虫固醇24-c-甲基转移酶(SMT)多肽、部分、变体和/或融合物以及编码SMT多肽、部分、变体和/或融合物的多核苷酸。
文档编号A61K38/45GK101743016SQ200880024553
公开日2010年6月16日 申请日期2008年7月11日 优先权日2007年7月13日
发明者史蒂文·里德, 后藤康之 申请人:传染性疾病研究院