专利名称：融合蛋白及其在利什曼病的诊断和治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及由合成的嵌合基因构建体产生的融合蛋白及其在利什曼病的诊 断和治疗中的用途，所述合成的嵌合基因构建体包含来自D6、K39和K9的序列。相关领域的描述利什曼原虫属(Leishmania)生物是巨噬细胞的细胞内原生动物寄生虫，其导致 人和家畜中广泛范围的临床疾病，所述家畜主要是犬。在某些感染中，该寄生虫可处于潜伏 很多年。在其他的情况中，宿主可以发展为多种形式的利什曼病中的一种。例如，该疾病 可以是无症状的或可以表现为亚临床内脏利什曼病，所述亚临床内脏利什曼病的特征为不 适、腹泻和间歇性肝肿大的轻微症状。患有亚临床或无症状疾病的患者通常具有低的抗体 滴度，这使得该疾病难以用标准技术进行检测。可选择地，利什曼病可表现为皮肤疾病，该 皮肤疾病是严重的但通常是自限的医学问题，或者利什曼病可表现为高度破坏性的不是自 限的粘膜疾病。最终并且最严重的情况下，该疾病可表现为累及脾、肝和淋巴结的急性内脏 感染，如果听任不治疗的话，该疾病通常是致死疾病。急性内脏利什曼病的症状包括肝脾肿 大、发热、白细胞减少、贫血和丙种球蛋白过多。该疾病的3种主要临床变种已知为皮肤变种、粘膜皮肤变种和内脏变种。皮肤利 什曼病可自身表现为白蛉叮咬部位的单一皮肤溃疡，感染后不久或数月后显现为弥散性损 伤。粘膜皮肤综合征以皮肤形式发展，但数月或数年后进展为口、鼻或咽的损伤。皮肤和粘 膜皮肤疾病的主要长期影响是瘢痕形成。内脏利什曼病具有3-6个月的潜伏期并且累及网 状内皮系统。内脏利什曼病的临床表现包括肝和脾的增大、发热、贫血和体重丢失。在缺乏治疗 的情况下，有症状的内脏疾病通常以死亡结束。近些年来，Hiv和引起内脏疾病的利什曼原 虫属种的共存已经导致数百双重感染的个体的病例(Berman，J. D.，(1997)Clin. Infect. Dis. 24 684)。在2000年，世界卫生组织最近估计利什曼病侵袭88个国家的人，3亿5千万 人处于染上该疾病的风险并且每年约2百万新病例。该疾病的毁灭性的影响的实例为苏丹 内脏利什曼病的最近流行，其夺去估计100，000人的生命(Seaman, J.，et al. (1996) Int. J. Epidemiol. 25:862)。如海湾战争期间亲内脏利什曼病的爆发所证实的，该疾病频繁成为军事行动中的威胁(Magill，J.，et al. (1993)N Engl J Med 328 :1383)。在世界很多地区，利什曼病是严重的问题，包括巴西、中国、东非、印度和中东地 区。该疾病在地中海地区还是地方性的，包括法国南部、意大利、希腊、西班牙、葡萄牙和北 非。在过去的20年中，利什曼病的病例数显著增加并且现在世界各地存在数百万的该疾病 的病例。每年诊断约2百万的新病例，25%的新病例是内脏利什曼病。然而，目前没有疫苗 或可行的有效治疗。利什曼病由利什曼原虫属的数个种引起。动质体目的这些单细胞生物与锥体虫有 关，锥体虫是非洲的昏睡病和南美的查加斯病的成因生物。利什曼原虫属寄生虫通常以两 种截然不同的方式存在，昆虫载体的能动的前鞭毛体和存在于哺乳动物宿主中的固定的无 鞭毛体。前鞭毛体通过受感染的遍及世界热带和温带各处的白蛉的叮咬而被传播到人。当 传递至哺乳动物宿主时，前鞭毛体感染网状内皮系统的巨噬细胞并转变为无鞭毛体。利什曼病的准确诊断常常难以实现。有利什曼原虫属的20个种感染人，包 括杜氏利什曼原虫(L. donovani)、恰氏利什曼原虫(L. chagasi)、婴儿利什曼原虫 (L. infantum)、硕大利什曼原虫(L. major)、亚马逊利什曼原虫(L. amazonensis)、巴西 利什曼原虫(L. braziliensis)、巴拿马利什曼原虫(L. panamensis)、墨西哥利什曼原虫 (L. mexicana)、热带利什曼原虫(L. tropica)和圭亚那利什曼原虫(L. guyanensis)，并且 没有明确指示利什曼原虫属感染存在的特有迹象或症状。已经使用了寄生虫检测方法，但 这些方法既不是敏感的也不是临床实用的。现有的皮肤测试通常使用整体的或分解的寄生 虫。这些测试通常是不敏感的、不可再现的并且易于与多种其他疾病交叉反应。此外，这些 测试中使用的制剂通常是不稳定的。因此，需要改进的方法用于利什曼原虫属感染的检测。例如，本领域需要更敏感的 和特异性更强的方法用于检测利什曼原虫属感染和鉴别那些可能进展为急性内脏感染的 无症状利什曼原虫属感染。本发明实现这些需要并且进一步提供其他相关利益。概述本发明通常涉及包含至少两种异源利什曼原虫属抗原的组合物、包含所述抗原的 融合多肽和编码所述抗原和融合物的多核苷酸，其中所述利什曼原虫属抗原选自K39、K26 和/或K9。本发明还涉及在利什曼病的诊断、治疗和预防中使用本发明的多肽和多核苷酸 的方法。本发明的抗原，当被联合使用和/或作为如本文所述的融合多肽或多核苷酸使用 时，提供改进的和预想不到的优势，并且在利什曼病诊断和疫苗开发方面是特别有用的。因此，根据一个实施方案，本发明提供分离的融合多肽，其包含两个或更多个选自 K26.K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分或变体。在相关实施方案中，分离的融 合多肽包含至少全部三种以上的利什曼原虫属抗原，其中至少一种抗原分离自杜氏利什曼 原虫。在具体实施方案中，本发明的融合多肽包含以下包含至少以6的142-267位残基 (SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO 6)的 第二免疫原部分；和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在更 具体的实施方案中，本发明的融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位氨基酸残基所示的 氨基酸序列。在某些实施方案中，所述融合多肽包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO :21)的N末端 氨基酸序列。在某些其他实施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列。在多个实施方案中，本发明提供编码本发明的融合多肽的分离的多核苷酸。本发明还提供与本文各处所述的融合多肽特异性地结合的分离的抗体或抗原结 合片段。在另一实施方案中，本发明考虑到药物组合物，其包含以下与生理学可接受的载 体的组合本发明的融合多肽，或识别本发明的融合多肽的分离的抗体或抗原结合片段，或 编码本发明的融合多肽的多核苷酸。在相关实施方案中，本发明考虑到疫苗组合物，其包含以下与非特异性免疫应答 增强剂的组合本发明的融合多肽，或识别本发明的融合多肽的分离的抗体或抗原结合片 段，或编码本发明的融合多肽的多核苷酸。在具体实施方案中，本发明提供在选自血清、血液和唾液的生物样品中检测无症 状或亚临床利什曼原虫属感染的方法，所述方法包括使生物样品与融合多肽接触，所述融 合多肽包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分；并在 所述生物样品中检测与所述融合多肽结合的抗体的存在，从而检测所述生物样品中无症状 亚临床或活动性利什曼原虫属感染。在更具体的实施方案中，检测生物样品中无症状或亚 临床利什曼原虫属感染的方法利用包含以下的融合多肽包含至少以6的142-267位残基 (SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO 6)的 第二免疫原部分；和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在仍 然更具体的实施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位残基所示的氨基酸 序列。在仍然更具体的相关实施方案中，所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端氨基酸序列。在相关实施方案中，检测生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属感染的方法使 用与固体支持物结合的融合多肽，其中所述固体支持物可以包含，例如硝化纤维、胶乳或塑 料材料。在某些实施方案中，所述方法还包括i)从固体支持物去除未结合的样品；ii)将 检测试剂添加到所述固体支持物；并且iii)相对于预定截断值测定与所述固体支持物结 合的检测试剂的的水平，从而检测所述生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属感染。在多个实施方案中，本发明提供鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或 亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的方法，所述方法包括使获自受无症状或亚临床内脏利 什曼病侵袭的患者的生物样品与第一多肽接触，所述第一多肽是融合多肽，其包含两个或 更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分，所述生物样品选自血清、 血液和唾液；并且独立地使所述生物样品与包含如SEQ ID N0s:6、10或11所示的氨基酸 序列的第二多肽接触；并且在所述样品中检测与第一和第二多肽的至少一个结合的抗体的 存在，从而鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患 者ο在具体实施方案中，鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏 利什曼病侵袭的患者的方法使用融合多肽，其包含包含至少K26的142-267位残基(SEQ ID NO 5)的第一免疫原部分；包含至少K39的2110-2343位残基(SEQ ID NO 6)的第二免 疫原部分；和包含至少K9的1-399位残基(SEQ ID NO 7)的第三免疫原部分。在仍然更具 体的实施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8的10-262位氨基酸残基所示的氨基酸序列。在仍然更具体的相关实施方案中，所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端氨基酸序列。在相关实施方案中，鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏 利什曼病侵袭的患者的方法使用与固体支持物结合的融合多肽，其中所述固体支持物可以 包含，例如硝化纤维，胶乳或塑料材料。在某些相关实施方案中，所述方法还包括i)从每个 固体支持物去除未结合的样品；ii)将检测试剂添加到每个固体支持物；并且iii)相对于 预定截断值的水平比较与每个固体支持物结合的检测试剂水平，从而鉴别受可能发展为急 性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。在具体实施方案中，所述检测试剂包含与结合剂结合的报告基团。在相关实施方 案中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。在其他相关实施方案中，所述 报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、胶体金、生物素和染料颗粒。在多个其他实施方案中，本发明提供用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利 什曼病的诊断试剂盒。在具体实施方案中，用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什 曼病的试剂盒包含融合多肽和检测试剂，所述融合多肽包含两个或更多个选自K26、K39和 K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分，其中所述样品选自血清、血液和唾液。在某些实施方案中，用于鉴别受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床 内脏利什曼病侵袭的患者的诊断试剂盒包含第一多肽、第二多肽和检测试剂，所述第一多 肽是融合多肽，其包含两个或更多个选自D6、K39和K9的利什曼原虫属抗原或其免疫原部 分，所述第二多肽包含如SEQ ID NOs 10或11所示的氨基酸序列。本发明的试剂盒还可以包含含有与结合剂结合的报告基团的检测试剂，和/或结 合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素和/或报告基团选自放射性同位素、荧光基 团、发光基团、酶、胶体金、生物素和染料颗粒。附图简要描述
图1显示出以8融合基因构建体的示意图，其包含N末端9个氨基酸的基序、Ldl^6 基因序列的142-267位多核苷酸(SEQ ID NO :1)、LdK39基因序列的2110-2343位多核苷酸 (SEQ ID NO 2)和LdK9基因序列的1-399位多核苷酸(SEQ ID NO :3)，所述N末端9个氨 基酸的基序包含6 XHIS标签(即6个组氨酸残基)。图2显示出以8、1(39和K9抗原检测来自委内瑞拉的人类患者的血清中的VL的能 力的比较。图3显示出1(9、以6、以8和K39抗原检测来自委内瑞拉的犬的血清中的VL的能力 的比较。序列标识简要描述SEQ ID NO :1表示杜氏利什曼原虫以6基因序列的142-267位多核苷酸，其编码 K26抗原的免疫原部分。SEQ ID NO :2表示杜氏利什曼原虫K39基因序列的2110-2343位多核苷酸，其编 码K39抗原的免疫原部分。SEQ ID NO 3表示杜氏利什曼原虫K9基因序列的1_399位多核苷酸，其编码免疫 原部分和全长K9抗原。SEQ ID NO :4表示合成基因K28的多核苷酸序列，其包含N末端9个氨基酸的基序、SEQ ID N0:1的多核苷酸序列，所述N末端9个氨基酸的基序包含6XHIS标签，所述 SEQ ID NO :1的多核苷酸序列与SEQ IDNO :2的多核苷酸序列融合，所述SEQ ID NO :2的多 核苷酸序列与SEQ IDNO :3的多核苷酸序列融合。ORF始于第4位核苷酸。SEQ ID NO 5表示杜氏利什曼原虫以6抗原的142-267位多核苷酸所编码的免疫 原多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 6表示杜氏利什曼原虫K39抗原的2110-2343位多核苷酸所编码的免
疫原多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 7表示杜氏利什曼原虫K9抗原的1-399位多核苷酸所编码的免疫原 全长多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 8表示SEQ ID NO 4所编码的以8多肽的氨基酸序列。SEQ ID NO 9表示杜氏利什曼原虫以6抗原的单一重复单元的氨基酸序列。SEQ ID NO 10表示杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的氨基酸序列。SEQ ID NO 11表示杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单元的氨基酸序列。SEQ ID NO :12表示编码SEQ ID NO :9的杜氏利什曼原虫以6抗原的单一重复单 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO :13表示编码SEQ ID NO :9的杜氏利什曼原虫以6抗原的单一重复单 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO 14表示编码SEQ ID NO 10的杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO :15表示编码SEQ ID NO :11的杜氏利什曼原虫K39抗原的单一重复单 元的多核苷酸序列。SEQ ID NO 16表示杜氏利什曼原虫以6基因的全长多核苷酸序列。SEQ ID NO 17表示杜氏利什曼原虫K39基因的全长多核苷酸序列。SEQ ID NO 18表示杜氏利什曼原虫K9基因的全长多核苷酸序列。SEQ ID NO 19表示SEQ ID NO 16所编码的氨基酸序列。SEQ ID NO 20表示SEQ ID NO 17所编码的氨基酸序列。SEQ ID NO :21表示在本发明的多肽的重组产生中使用的示例性的N末端组氨酸 标签。详细描述利什曼原虫属抗原及其融合物本发明通常涉及使用利什曼原虫属抗原的组合物和方法。本发明的组合物 通常包含利什曼原虫属种的至少两种异源抗原或其免疫原部分。可以从例如对于多 种利什曼原虫属种的国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information (NCBI))数据库获得利什曼原虫属抗原序列，所述多种利什曼原虫属种包括杜 氏利什曼原虫、恰氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫、硕大利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫、委 内瑞拉利什曼原虫(L. venezuelensis)、巴西利什曼原虫、巴拿马利什曼原虫、墨西哥利什 曼原虫、热带利什曼原虫和圭亚那利什曼原虫。在一方面，本发明提供如本文所述的包括融合多肽的分离的利什曼原虫属多肽和 包含所述分离的利什曼原虫属多肽的组合物。通常，本发明的多肽会是分离的多肽并且可以包含来自两个或更多个利什曼原虫属基因的氨基酸序列的多肽片段(例如抗原/免疫原 部分)、多个多肽片段(例如融合多肽)或全长多肽，所述利什曼原虫属基因包括但不限于 K26、K39和/或K9。本领域技术人员应当理解到，抗原多肽片段还可以获自本领域内已经 可以获得的那些。使用常规重组和/或合成技术可以制备本发明的多肽、所述多肽的抗原 /免疫原片段和其他变体。在某些实施方案中，本发明的多肽是融合多肽。在具体实施方案中，所述融合多肽 包含Κ26、Κ39和/或Κ9抗原或其免疫原部分，所述免疫原部分是抗原的/免疫原的，即它 们在免疫测定(例如ELISA或T细胞刺激检测)中与来自受感染的个体的抗血清和/或T 细胞可检测地反应。可以使用技术人员熟知的技术进行对于免疫原活性的筛选。例如，可 以使用诸如 Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual (抗体实验手册)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988中所述的那些方法进行这些筛选。在一个示例性 的实例中，本发明的多肽(例如融合多肽)可以被固定在固体支持物上并且与患者血清接 触以允许血清中的抗体与固定的多肽的结合。然后，可以去除未结合的血清并使用诸如125I 标记的蛋白A检测结合的抗体。如技术人员应当意识到的，本发明的融合多肽可以包含本文公开的利什曼原虫属 K26、K39和/或K9多肽的抗原或免疫原部分或片段。如本文所用的“免疫原部分”是本发 明的免疫原多肽的片段，所述片段自身与识别所述多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受 体是免疫上反应性的(即特异性地结合)。通常可以使用熟知技术鉴定免疫原部分，例如 Paul, Fundamental Immunology (基石出免疫学)，5th ed. , Lippincott Williams &Wilkins, 2003和其中引用的文献中总结的那些方法。这些技术包括对于与抗原特异性抗体、抗血清 和/或T细胞系或克隆反应的能力筛选多肽。如本文所用的抗血清和抗体是“抗原特异性 的”，如果它们特异性地与抗原结合(即它们在免疫测定中与蛋白反应并且不与无关蛋白可 检测地反应)。可以如本文所述和使用熟知技术制备这些抗血清和抗体。在具体实施方案中，本发明的融合多肽的抗原/免疫原部分或多肽片段是以基本 不低于全长融合多肽的反应性的水平与抗血清和/或T细胞反应的部分(例如在ELISA和 /或T细胞反应性检测中)。优选地，融合多肽中抗原/免疫原部分的免疫原活性的水平是 全长融合多肽的免疫原性的至少约50%、优选地至少约70%和最优选地大于约90%。在 某些情况下，会鉴定出具有高于对应的全长融合多肽的免疫原活性的免疫原活性水平的优 选的免疫原部分，例如，具有高于约100%或150%或更高的免疫原活性。在具体实施方案 中，所述全长融合多肽的免疫原性会具有由其中包含的每种抗原/免疫原部分所贡献的加 成的免疫原性。本发明的融合多肽还可以包含一个或多个多肽，其与T细胞和/或针对本发明的 多肽生成的抗体是免疫上反应性的，特别是与针对具有本文公开的氨基酸序列的多肽或其 免疫原片段或变体生成的抗体是免疫上反应性的。在具体实施方案中，所述被针对的多肽 是本文所述的融合多肽。在本发明的另一实施方案中，提供了融合多肽，其包含能够激发T细胞和/或抗体 的两个或更多个多肽，所述抗体与两个或更多个本文所述的多肽是免疫上反应性的，或由 包含在本文公开的多核苷酸序列中的连续多核苷酸序列编码的两个或更多个多肽或其免 疫原片段或变体，或与这些多核苷酸序列中的两个或更多个在中严紧性至高严紧性的条件下杂交的两个或更多个多核苷酸序列编码的两个或更多个多肽。本发明还提供包含以6、以9和/或K9多肽的片段的融合多肽，所述片段包括抗原 /免疫原片段，所述抗原/免疫原片段包含利什曼原虫属D6、K39和/或K9抗原的至少约 5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250，300或350个连续氨基酸或更多并且包括所有中 间的长度，所述抗原/免疫原片段例如本文所示的那些片段或由本文所示的多核苷酸序列 所编码的那些片段。在另一方面，本发明的融合多肽包含多肽片段的多拷贝，多肽片段的重复或多亚 基多肽片段，包括以任何顺序包含至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个连续片段的、诸 如利什曼原虫属D6、K39和/或K9多肽的抗原/免疫原片段，并且包括所有长度的本文所 示的多肽组合物或由本文所示的多核苷酸序列编码的那些。在另一方面，本发明的融合多 肽可以包含两个或更多个如SEQ ID NOs :5-7和9-11中所示的利什曼原虫属抗原片段。在 相关方面，所述融合多肽包含如SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :8的10-262位氨基酸所示的氨 基酸序列。在仍然另一方面，本发明提供包含两个或更多个本文所述的利什曼原虫属K26、 K29和/或K9多肽的变体的融合多肽。本发明通常所包括的多肽变体与本文所示的多肽 序列通常，沿着其长度，表现出至少约70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%, 95^^96^^97^^98%或99%或更高的一致性(按照下文所述测定)。优选地，相对于天然 K26.K29和/或K9序列，这些变体会具有相同的、相似的或提高的免疫活性。如本文所用的术语多肽“变体”是通常与本文具体公开的多肽(例如利什曼原虫 属K26、K29和/或K9多肽)的区别在于一个或多个取代、缺失、添加和/或插入的多肽。 这些变体可以是天然存在的或可以是合成生成的，例如，通过使用许多本领域公知的技术 中的任何技术修饰一个或多个本发明的以上多肽序列并评估其如本文所述的免疫原活性。在很多情况下，变体会包含保守型取代。“保守型取代”是氨基酸被具有相似性质 的另一氨基酸取代的一种取代，以使肽化学领域技术人员会期望多肽的二级结构和亲水性 质基本上不改变。如上文所述，可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰并且仍 获得编码具有诸如免疫原特性的所需特性的变体或衍生物多肽的功能性分子。当希望改变 多肽的氨基酸序列以产生等同的或甚至改进的本发明多肽的免疫原变体或部分时，本领域 技术人员通常会按照表1改变编码DNA序列的一个或多个密码子。例如，在蛋白结构中，某些氨基酸可以被其他氨基酸取代，而没有与诸如抗体的抗 原结合区或底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力的明显丢失。因为蛋白的相 互作用能力和性质限定该蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列中并且当然，在其根本的 DNA编码序列中进行某些氨基酸序列取代，并且仍然获得具有相似性质的蛋白。因此，预期 可以在公开的组合物的肽序列或编码所述肽的对应的DNA序列中进行各种改变，而没有它 们生物效用或活性的明显丢失。表 权利要求
1.分离的融合多肽，其包含两个或更多个选自K26、K39和K9的利什曼原虫属 (Leishmania)抗原或其免疫原部分或变体，其中所述抗原中至少一个分离自杜氏利什曼原 虫(Leishmania donovani)0
2.如权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含包含SEQIDN0:5的K26序 列、包含SEQ ID NO 6的K39序列和包含SEQ ID NO 7的K9序列。
3.如权利要求2所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位 所示的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽还包含 MHHHHHHTS (SEQ ID NO 21)的N末端氨基酸序列。
5.分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中任一项所述的融合多肽。
6.分离的抗体或抗原结合片段，其特异性地结合权利要求1-4中任一项所述的融合多肽。
7.药物组合物，其包含(a)权利要求1所述的融合多肽，或(b)权利要求6所述的分离的抗体或抗原结合片段，或(c)权利要求5所述的多核苷酸；和 生理学可接受的载体。
8.疫苗，其包含(a)权利要求1所述的融合多肽，或(b)权利要求6所述的分离的抗体或抗原结合片段，或(c)权利要求5所述的多核苷酸；和 非特异性免疫应答增强剂。
9.检测生物样品中无症状或亚临床利什曼原虫属(Leishmania)感染的方法，所述生 物样品选自血清、血液和唾液，所述方法包括(a)使生物样品与融合多肽接触，所述融合多肽包含两个或更多个选自K26、K39和K9 的利什曼原虫属抗原或其免疫原部分或变体；以及(b)检测所述生物样品中与所述融合多肽结合的抗体的存在，从而检测所述生物样品 中无症状或亚临床利什曼原虫属感染。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述融合多肽包含SEQIDNOs :5-7中所示的氨基 酸序列。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位所示的氨基酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端氨基酸序列。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述融合多肽与固体支持物结合。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料材料。
15.如权利要求9所述的方法，其中检测步骤包括(a)从固体支持物中去除未结合的样品；(b)将检测试剂添加到固体支持物；以及(C)相对于预定截断值的水平检测与固体支持物结合的检测试剂水平。
16.鉴定受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者 的方法，所述方法包括(a)使获自受无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者的生物样品与第一多肽接触， 所述第一多肽是包含两个或更多个选自D6、K39和K9的利什曼原虫属(Leishmania)抗原 或其免疫原部分或变体的融合多肽，所述生物样品选自血清、血液和唾液；以及(b)独立地使所述生物样品与第二多肽接触，所述第二多肽包含如SEQID N0s:10或 11所示的氨基酸序列；以及(c)检测所述样品中与所述第一和第二多肽中至少一个结合的抗体的存在，从而鉴定 受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述融合多肽包含SEQIDNOs :5-7中所示的氨基 酸序列。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述融合多肽包含如SEQIDNO 8的10-262位所示的氨基酸序列。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述融合多肽还包含MHHHHHHTS(SEQ ID NO 21) 的N末端氨基酸序列。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述第一和第二多肽各自与分别的固体支持物结I=I O
21.如权利要求20所述的方法，其中所述固体支持物包括硝化纤维、胶乳或塑料材料。
22.如权利要求16所述的方法，其中其中检测步骤包括(a)从每个固体支持物中去除未结合的样品；(b)将检测试剂添加到每个固体支持物；以及(c)相对于预定截断值的水平比较与每个固体支持物结合的检测试剂水平。
23.如权利要求15或22中任一项所述的方法，其中所述检测试剂包含与结合剂结合的报告基团。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A和凝集素。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述报告基团选自放射性同位素、荧光基团、发光 基团、酶、生物素和染料颗粒。
26.用于检测生物样品中无症状或亚临床内脏利什曼病的诊断试剂盒，所述生物样品 选自血清、血液和唾液，所述试剂盒包含(a)融合多肽，其包含两个或更多个选自D6、K39和K9的利什曼原虫属(Leishmania) 抗原或其免疫原部分或变体；和(b)检测试剂。
27.用于受可能发展为急性内脏利什曼病的无症状或亚临床内脏利什曼病侵袭的患者 的诊断试剂盒，其包含(a)第一多肽，所述第一多肽是包含两个或更多个选自D6、K39和K9的利什曼原虫属 (Leishmania)抗原或其免疫原部分或变体的融合多肽；(b)第二多肽，其包含如SEQID NO 10或11所示的氨基酸序列；和(C)检测试剂。
28.如权利要求26或27中任一项所述的试剂盒，其中所述检测试剂包含与结合剂结合 的报告基团。
29.如权利要求26或27中任一项所述的试剂盒，其中所述结合剂选自抗免疫球蛋白、 蛋白G、蛋白A和凝集素。
30.如权利要求26或27中任一项所述的试剂盒，其中所述报告基团选自放射性同位 素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
全文摘要
本发明通常涉及由合成的基因构建体产生的融合蛋白，所述合成的基因构建体包含来源于利什曼原虫属抗原K26、K39和K9的元件。所述融合蛋白在利什曼病的诊断中，特别是在诸如人和犬的动物中的内脏利什曼病的诊断中是特别有用的。
文档编号C07K14/44GK102083853SQ200980125647
公开日2011年6月1日 申请日期2009年7月2日 优先权日2008年7月3日
发明者史蒂文·G·里德, 阿贾伊·巴蒂亚 申请人:传染性疾病研究院