用于蛋白质、肽和其他分子的改进的f-18标记方法和组合物的制作方法

专利名称：用于蛋白质、肽和其他分子的改进的f-18标记方法和组合物的制作方法
技术领域：
在某些实施方式中，本发明涉及用F-18标记肽的简单方法，其可用于体内成像。 施用于受试者时，F-18标记肽的优选比活性为约1，000至2，OOOCi/mol。也可使用100至 数万Ci/mmol范围内的比活性。虽然在某些成像应用中优选更高比活性，但是在其他替代 实施方式中，可以使用较低比活性的而14(1，4，7-三氮杂-环壬烷4』，，『-三乙酸)或 另一螯合部分与金属-F-18络合物，例如，肾血流成像剂或用于对血流成像的心脏和脑成 像剂。优选地，F-18标记的完成不需要纯化步骤来从标记的肽分离未标记的肽。更优选地， F-18标记的肽在体内状况下是稳定的，诸如在人血清中。
背景技术：
正电子成像术(PET)成像提供了高分辨率和从PET图定量。肽或其他小分子可用 正电子发射体(仅举几例，18F,64Cu,fi6Ga,fi8Ga,76Br,94mTc，86Y和124I)标记。从同位素的核发 射的正电子根据使用的同位素以不同能量喷射。当正电子与电子反应时，两种511keVY射 线以相反的方向发射。喷射的正电子的能量控制正电子在其通过撞击电子而被湮灭之前飞 行平均距离。喷射能越高，正电子与电子碰撞前飞行的越远。希望PET同位素具有低喷射 能，以使正电子在其产生被PET照相机成像的两种511keVY射线前从靶位点飞行的距离最 小。发射正电子的许多同位素在其衰变链中也具有其他发射，诸如Y射线、α粒子或β粒 子。希望具有纯的正电子发射体的PET同位素，以便将任何发射量测定问题减至最小。同位素的半衰期也是重要的，因为半衰期必须足够长，以便将同位素连接至靶向 分子、分析产物、将其注射于患者、允许产物定位、从非靶组织中清除和然后成像。如果半衰 期太长，则比活性可能不够高以获得足够的光子来得到清晰的图，而如果半衰期太短，则生 产、商业分配和生物分配需要的时间可能不够。F-18(0+635keV 97%,t1/2 110分钟)由于 它的低正电子发射能、无侧向发射和合适的半衰期，而成为最广泛使用的PET发射同位素 之一。产生的F-18具有高比活性。当同位素连接至分子用于靶向时，通常需要一些未反应 的靶向剂来完成，其经常相比于放射性标记的产物是以摩尔过量形式存在的。通常，标记产 物和未标记产物在体内对同一靶点存在竞争，因而冷的靶向剂可以降低靶向剂的有效比活 性。如果将F-18连接至具有非常高吸收的分子(诸如2-氟-2-脱氧葡萄糖(FDG))，则比 活性就不是那么重要了。不过，如果技术人员用标记的肽靶向受体或用有限量的有效结合 位点进行免疫PET预靶向研究，则当冷的靶向剂过量存在时，其能够潜在地阻断发射标记 剂的吸收。
肽的常规F-18标记包括标记具有低比活性的试剂和HPLC纯化剂，然后与目标肽 缀合。缀合获得所需比活性的标记肽后，通常缀合物需要再提纯。一个实例是Poethko等 人的标记方法(J. Nucl. Med. 2004 ；45 :892-902)，其中首先合成和纯化了 4-[18F]氟苯甲醛 (Wilson等人，J. LabeledCompounds and Radiopharm. 1990 ；XXVIII :1189-1199)，然后将其 与肽缀合。然后通过HPLC纯化肽缀合物，以除去用来驱动缀合完成的多余的肽。如果F-18 具有长的半衰期，所述两个反应和纯化不会成问题。但是，F-18的半衰期只有2小时，因此 将F-18连接至肽需要的所有操作是很显著的负担。这些方法进行时间长，并且需要使用特殊设计的设备来产生标记的产物和/或专 业化学家的努力。它们不是可以在临床环境中常规使用的试剂盒制剂。需要一种快速、简 单的18-F-标记靶向部分如蛋白质或肽的方法，获得具有合适的比活性和在体内检测和/ 或成像的稳定性，同时对特殊设备或专门人才的需求降至最低限度，以及减少操作人员受 到的高强度辐射的靶向构建体。进一步需要预先包装好的试剂盒，用于提供实现所述新方 法所需的组成成份。

发明内容
氟化物与事实上所有其他元素结合，并且其中的一些键相对稳定。已知携带金属 结合配体的肽稳定地且以非常高的比活性结合放射性金属。本方法采用的途径是首先使 F-18与金属结合，然后用肽上的配体螯合F-18金属络合物。那么问题就是选择哪种金属 (或其他元素，例如硼)。根据对文献的快速检索，IIIA族的元素(硼、铝、镓、铟和铊)成 为首选。也可以使用镥。另外，技术人员可首先将金属或其他原子连接至肽，然后加入F-18。对于例如氟化 硼连接，第二个方法可能更加有效。已报道氟化铝络合物在体外稳定(Martinez等人，Inorg. Chem. 1999 ；38 4765-4660 ；Antonny 等人.J. Biol. Chem. 1992 ；267 :6710-6718)。将氟化铝掺入骨和牙 齿的釉质，则所述络合物在体内也是稳定地(Li，Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003 ； 14 100-114)。熟练的技术人员将理解，几乎任何递送分子都可连接F-18用于成像目的，只要其 含有可被修饰而不影响递送分子与细胞或组织靶受体之间的配体-受体结合相互作用的 可衍生基团。虽然下面的实施例涉及F-18标记的肽部分，但是许多其他类型的递送分子均 可被F-18标记并用于成像目的，其他类型的递送分子诸如寡核苷酸、激素、生长因子、细胞 因子、趋化因子、血管生长因子、抗血管生成因子、免疫调节剂、蛋白质、核酸、抗体、抗体片 段、药物、白细胞介素、干扰素、寡糖、多糖、脂质等。相似地，可被成像的疾病或病症的类型 仅受合适靶向与疾病或病症相关的细胞或组织的递送分子有效性的限制。许多这样的递送 分子是已知的，在下述实例中举例说明。例如，任何与疾病组织或靶点如癌结合的蛋白质或 肽可利用已知的方法用F-18标记，用于检测和/或成像。在某些实施方式中，这样的蛋白 质或肽可以包括但不限于结合肿瘤-相关抗原(TTAs)的抗体或抗体片段。任何已知的 TTA-结合抗体或片段通过描述的方法用F-18标记，并用于肿瘤的成像和/或检测，例如通 过PET扫描或其他已知技术。在下面的某些实施例中，示例性的F-18标记的肽可作为使用双特异性或多特异性抗体或抗体片段的预靶向方法中的可靶向的构建体用于成像目的。这种情况下，抗体或 抗体片段将包含针对与疾病或病症相关的靶的一个或多个结合位点，所述靶诸如肿瘤-相 关抗原或自身免疫疾病相关抗原或由病原生物(诸如病毒、细菌、真菌或其他微生物)产生 或展示的抗原。第二个结合位点将特异性结合可靶向的构建体。使用双特异性或多特异性 抗体的预靶向方法是本领域公知的(参见，例如美国专利第6，962，702号，其完整内容通过 引用并入本文)。相似地，与可靶向的构建体结合的抗体或其片段也是本领域公知的(同 上)，诸如与HSG(组胺琥珀酰甘氨酸)结合的679单克隆抗体。一般而言，在预靶向方法 中，首先施用双特异性或多特异性抗体，并让其与细胞或组织靶抗原结合。经过合适量的时 间让未结合的抗体从循环中清除后，例如F-18标记的可靶向的构建体施用于患者并与定 位至靶细胞或组织的抗体结合，然后例如通过PET扫描拍摄图像。在示例性实施方式中，诸如叶酸的非肽受体靶向剂可与DOTA缀合，然后用例如 与NOTA结合的F-18金属络合物标记。此类非肽受体靶向剂可包括，例如TA138(整联蛋 白α γ β 3受体的一种非肽拮抗剂)(Liu等，2003，Bioconj. Chem. 14 =1052-56)。本领域已 知的可与DOTA、NOTA或F-18金属络合物的另外的螯合剂缀合的相似的非肽靶向剂可用于 要求保护的方法。其他受体靶向剂是本领域已知的，诸如生长抑素受体靶向剂^-DTPA奥 曲肽(TYCO )。如下文所述，F-18金属络合物可潜在地使用DTPA螯合并用于成像目的。 N0DAGAT0C肽可以A1F-18进行标记用于生长抑素受体靶向(Eisenwiener等人，Bioconj. Chem. 2002，13(3) :530-41)。使用金属螯合物的受体靶向成像的其他方法是本领域已知的， 并可用于实施要求保护的方法(参见，例如Andre等人，2002，J. Inorg. Biochem. 88 :1_6 ； Pearsonet al.，1996，J. Med.，Chem. 39 :1361-71)。用于通过PET扫描的F-18成像的成像技术和装置也是本领域公知的(参见， 例如美国专利第 6，358，489 ;6，953，567 号；Page 等人，NuclearMedicine And Biology, 21 :911-919,1994 ；Choi ^ 人，Cancer Research55 :5323_5329，1995 ;Zalutsky 等人， J. Nuclear Med. ,33 =575-582,1992)且可使用任何此类已知的PET成像技术活装置。虽然下述实施例表明F-18金属络合物可用于PET成像，然而技术人员将意识到稳 定的金属-氟络合物诸如非放射性的A1-27和F-19络合物也可以连接至NOTA或其他螯合 剂和连接至肽或其他靶向剂用作MRI造影剂。所述AlF NOTA络合物还可连接至聚合物而 用于MRI成像。所述A1FN0TA衍生物也可用作PARACEST MRI成像剂(ffoessner et al.， Magn. Reson. Med. 2005，53 :790-99)。



的范围(

包括下列图以说明本发明的特定实施方式，但其并不意味着限制要求保护的主题
图1.示例性肽IMP272。 图2.示例性肽IMP^8。 图3.示例性肽IMP326。 图4.示例性肽IMP329。 图5.示例性肽IMP331。 图6.示例性肽IMP332。
图7.示例性肽IMP333。
图8.示例性肽IMP334。
图9.示例性肽IMP349。
图10.示例性肽IMP368。
图11.示例性肽IMP375。
图12.示例性肽IMP384。
图13.示例性肽IMP386。
图14.示例性肽IMP389。
图15.示例性肽IMP449。
图16.附加的示例性肽IMP422、IMP426、IMP428。
图17.示例性NOTA衍生物。
图18.示例性NODA-肽结构。
图19.具有或不具有TF2双特异性抗体的h-111和F-
中的比较生物分布。图20.利用具有或不具有预靶向TFlO双特异性抗MUC-I抗体的111In-标记的双 HSG肽(IMP 288)在体内的肿瘤成像。图21.利用124I-标记肽和TF2双特异性抗-CEA抗体预靶向在裸鼠的肺中微转移 人类结肠癌的PET成像。图22A-22D.附加的示例性用于F_18标记的螯合部分。
具体实施例方式在下面的描述中，使用了大量术语，提供以下定义以便于理解本文的公开内容。未 明确定义的术语根据其明显的和普通含义使用。如本文所用，“一个”或“一种”可指一个/ 一种或多于一个/ 一种。如本文所用，术语“和”和“或”可用于指合取的或析取的。即除非另外声明，两个 术语均应理解为等同于“和/或”。如本文所用，“约”指数字的加或减10%的范围内。例如，“约100”是指90至110
之间的任何数字。如本文所用，“肽”指长度介于2个和100个氨基酸残基之间、更优选地长度介于2 个和10个氨基酸残基之间、更优选地长度介于2个和6个氨基酸残基之间的天然存在或非 天然存在的氨基酸的任何序列。“氨基酸”可以是L-氨基酸、D-氨基酸、氨基酸类似物、氨 基酸衍生物或氨基酸模拟物。如本文所用，部分地或全部地从未标记的分子中分离得到的所述标记分子是“纯 化的”，因而所述标记分子级分相对于起始混合物而言是富集的。一种“纯化的”标记分子可 以是包括几乎任何比率的标记和未标记分子的混合物，包括但不限于约5 95；10 90; 15 85 ；20 80 ；25 75 ；30 70 ；40 60 ；50 50 ；60 40 ；70 30 ；75 25 ； 80 20 ；85 15 ；90 10 ；95 5 ；97 3 ；98 2 ;99 1 或 100 0。如本文所用，术语“病原体”包括但不限于真菌、病毒、寄生虫和细菌，包括但不限 于人免疫缺陷病毒(HIV)、疱症病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼 吸道合胞病病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺 病毒、人T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎 病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒、无乳链球菌、嗜肺 军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆 菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分支杆菌、流产布鲁杆菌、结核分枝杆 菌和破伤风梭菌。如本文所用，“辐射分解保护剂”是指任何分子、化合物或组合物，其可被添加到 F-18标记络合物或分子中，以减低F-18标记的络合物或分子被辐射分解的速度。可以使用 任何已知的辐射分解保护剂，包括但不限于抗坏血酸。靶向的构建体肽在某些实施方式中，F-18标记的部分可以包含肽或其他可靶向的构建体。F-18标 记的肽(或蛋白质)可被选择直接与靶向细胞、组织、病原生物或其他用于成像和/或检测 的靶点结合。在其他实施方式中，F-18标记的肽可被选择间接结合，例如利用双特异性抗体 与一个或多个针对可靶向的构建体肽的结合位点，和与一个或多个针对与疾病或病症相关 的靶抗原的结合位点。双特异性抗体可以用于例如预靶向技术中，其中抗体可先施用于受 试者。需要充足的时间以使双特异性抗体与靶抗原结合以及使未结合抗体从循环中清除。 可靶向的构建体如F-18标记的肽可施用于受试者，并可与双特异性抗体结合，定位在病态 细胞或组织中，然后F-18标记的可靶向的构建体的分布可以通过PET扫描或其他已知技术 进行测定。这些可靶向的构建体可以具有多种结构，其选择不仅根据抗体或片段与可靶向的 构建体的高亲和力结合的有效性，而且根据当用于预靶向方法和双特异性抗体(bsAb)或 多特异性抗体时能快速从体内消除。疏水剂在引起强免疫应答方面最佳，而亲水剂是快速 体内消除所优选的。因此，建立了疏水和亲水特性之间的平衡。这可以部分地通过使用亲 水螯合剂以抵消许多有机部分固有的疏水性来实现。另外，可选择具有相反溶解性质的可 靶向的构建体的亚单元，例如选择含有氨基酸的肽，氨基酸中的一些是疏水性的、一些是亲 水性的。除了肽以外，还可以使用糖类。可使用具有至少两个氨基酸残基的肽，优选地为2至10个残基，也可将肽与诸如 螯合剂的其他部分偶连。接头应是低分子量缀合物，优选具有低于50，000道尔顿的分子 量，并且有利地低于约20，000道尔顿、10，000道尔顿或5，000道尔顿的分子量(包括螯合 物中的金属离子)。更常见地，可靶向构建体肽将具有四个或更多残基，诸如肽DOTA-Phe-Lys (HSG) -Tyr-Lys (HSG) -NH2 (SEQ ID NO 1)，其中 DOTA 是 1，4，7，10-四氮杂环十二烷四乙 酸，而HSG是组胺琥珀酰甘氨酰基团。另外，DOTA可被N0TA(1，4，7-三氮杂-环壬烷-N， N，，N” -三乙酸)或TETA (对-溴乙酰氨基-苄基-四乙胺四乙酸)部分取代。可靶向的构建体还可在主链结构中包含非天然氨基酸(例如，D-氨基酸)以增加 肽在体内的稳定性。在可选的实施方式中，其他主链结构，诸如从非天然氨基酸和拟肽构建 的那些。使用固相支持体和重复正交脱保护和偶联的标准技术在自动肽合成仪上方便地 合成用作可靶向构建体的肽。肽中以后用于螯合物缀合的游离氨基用标准的保护基团(诸如Boc基团)有利地封闭，而N-末端残基可被乙酰化以增加血清稳定性。此类保护基团是 熟练的技术人员已知的。参见Greene和mits，有机合成中的保护基团，1999 (John Wiley and SonS，N. Y.)。当肽准备以后用于双特异性抗体系统时，它们被有利地从树脂中切割下， 产生相应的C-末端酰胺，以便抑制体内羧肽酶的活性。免疫原的半抗原包含免疫原识别部分，例如化学半抗原。使用化学半抗原，优选地 HSG半抗原，接头显示出对抗体的高特异性。HSG半抗原产生的抗体是已知的，并可容易地 掺入适当的双特异性抗体(参见，例如美国专利号6，962，702 ；7, 138，103和7，300，644，它 们的完整内容均通过引用并入本文)。因此，接头与连接的半抗原的结合是对抗体或抗体片 段高度特异性的。螯合部分在一些实施方式中，F-18标记的分子可包含一个或多个亲水螯合部分，其结合金 属离子并且还有助于确保快速的体内清除。螯合剂可根据其特定的金属结合性质进行选 择，并且可容易地被交换。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA和其单甲基和环己基类似物。诸 如ΝΟΤΑ (1，4，7-三氮杂-环壬烷-N，N，，N” -三乙酸)、D0TA和TETA (对-溴乙酰氨基-苄 基-四乙胺四乙酸)的大环螯合剂也可与可潜在地用作F-18缀合配体的多种金属一起使用。其中配体包括硬碱螯合功能诸如羧酸或胺基的DTPA和DOTA-型螯合剂对于螯合 硬酸阳离子、尤其是IIa族和IIIa族金属阳离子最为有效。通过调整目标金属的环的大小， 可使此类金属-螯合物络合物非常稳定。诸如大环聚醚的其他环型螯合剂由于稳定结合核 素而受到关注。卟啉螯合剂可与许多金属络合物一起使用。可将不止一种类型的螯合剂与 载体缀合以结合多种金属离子。诸如美国专利第5，753，206号中公开的那些螯合剂，尤其 是缩氨基硫脲基乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和缩氨基硫脲基乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯 合剂有利地用于结合Tc，Re, Bi和其他过渡金属元素、镧系元素和锕系元素的软酸阳离子， 所述软酸阳离子紧密地结合软碱配体。将不止一种类型的螯合剂与肽连接是有用的。由于 双-DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet等人，美国专利第5，256，395号)并且容易偶联至 靶向抗体形成双特异性抗体，因此，在预靶向实验方案中使用带有冷的双DTPA螯合剂和用 于结合F-18络合物的另一螯合剂的肽半抗原是可能的。此类肽的一个实例是Ac-Lys (DTP A) -Tyr-Lys (DTPA) -Lys (Tscg-Cys) -NH2 (SEQ IDNO :2)。其他硬酸螯合剂(诸如 DOTA、TETA 等)可取代DTPA和/或Tscg-Cys基团，并且可使用用来产生抗-双-DTPA Mab的技术类 似的技术来产生特异于这些硬酸螯合剂的Mab。另一种有用的螯合剂可含有NOTA-型部分，例如，如Chong等人(用于抗体靶向的 发射癌症疗法的双模态双功能配体的合理设计和产生，J. Med. Chem.，电子出版于12_7_07， 通过引用并入本文)中所公开的。Chong等人公开了基于NOTA结构的双功能C-NETA配体 的产生和用途，所述配体在与mLu或-Bi络合时显示在血清中高达14天的稳定性。应理解，可将两种不同的硬酸或软酸螯合剂(例如具有不同的螯合环大小)掺入 可靶向的构建体，以优先结合两种不同的硬酸或软酸阳离子(根据阳离子的不同大小、螯 合环的几何学和阳离子的优选络合物离子结构)。这将允许两种不同的金属(其中一种或 两种可与F-18连接)掺入可靶向的构建体，以被预靶向的双特异性抗体最终捕获。
施用方法在不同的实施方案中，双特异性抗体和可靶向的构建体可用于成像正常或病 态组织和器官(参见，例如美国专利第6，126,916 ；6, 077, 499 ；6, 010, 680 ；5, 776,095 ； 5，776，094 ；5，776，093 ；5，772，981 ；5，753，206 ；5，746，996 ；5，697，902 ；5，328，679 ； 5，128，119 ；5, 101，827 ；和4，735，210号，它们的完整内容均通过引用并入本文)。双特异性抗体(bsAb)和F-18标记的可靶向构建体的施用可通过在施用可靶向的 构建体之前某些时间施用bsAb抗体来执行。试剂的剂量和施用时间可由熟练得技术人员 容易地设计，并依赖于所用试剂的具体性质。如果首先施予bsAb_F(ab’)2衍生物，则施用可 靶向构建体之前M-72小时(或者48-96小时)的等待时间将是适当的。如果IgG-Fab，bsAb 缀合物是最初的靶向载体，则施用可靶向的构建体之前将需要3-10天范围内的更长的等 待时间。经过充分的时间让bsAb靶向病态组织之后，施用F-18标记的可靶向的构建体。施 用可靶向的构建体之后，即可进行成像。某些实施方式涉及具有至少三个不同的靶结合位点的多价靶结合蛋白质的使用， 如序号为60/220，782的专利申请所述。已通过经由化学接头交联几个Fab-样片段制 备了多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5，262, 524 ；5, 091，542号和Landsdorp等人， Euro. J. Immunol.，16 :679-83(1986)。也已通过共价连接几个单链Fv分子(scFv)以形成 单个多肽来制备多价靶结合蛋白质。参见美国专利第5，892，020号。一种基本上是scFv 分子聚集体的多价靶结合蛋白质已公开于美国专利第6，025，165和5，837，242号。包含 三个scFv分子的三价靶结合蛋白质已公开于Krott等人ftOtein Engineering, 10 (4) 423-433(1997)。可选地，一种称为“对接和锁定”(DNL)的技术已被证实可以简单地和可重现地构 建各种多价络合物，包括含有2个或多个不同抗体或抗体片段的络合物。(参见，例如，2006 年3月M日提交的美国专利申请11/389，358 ；2006年3月28日提交的11/391，584 ;2006 年6月四日提交的11/478，021 ；2006年12月5日提交的11/633，729 ；和2007年10月洸 日提交的11/925，408，它们的完整内容均通过引用并入本文)。这些构建体也可应用于本 文所述要求保护的方法和组合物。可使用可在双特异性抗体(bsAb)和可靶向构建体的给药之间施予的清除剂。可 使用具有新机制作用的清除剂，即被靶向bsAb的疾病靶向臂的糖基化的抗基因型Fab’片 段。在一个实例中，施予抗CEA (MN 14ab)x抗肽bsAb，并允许其最大程度地附着于疾病靶 点。为了清除残留的bsAb，施予MN-14的抗基因型Ab (称为WI2)，优选地作为糖基化的Fab’ 片段。清除剂以单价方式与bsAb结合，而其附着的糖残基将整个复合物引向肝脏，在肝脏 中发生快速的代谢。然后将F-18标记的可靶向构建体施予受治疗者。bsAb的MN-14臂的 WI2Ab具有高亲和力，并且其清除机制不同于其他公开的机制(参见Goodwin等人，同上)， 原因是其不涉及交联，因为WI2-Fab’是单价部分。然而，可选的用于清除剂的方法和组合 物是已知的，并且可以使用任何已知的清除剂。制剂和施用F-18标记分子可以制备得到包含一种或多种药学上适当的赋形剂，一种或多种额 外成分或它们的混合物的组合物。这些组合物可采用已知的方法制成药学上有用的剂量， 使活性成份(即F-18标记分子)与一种或多种药学上适合的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸缓冲盐水是药学上适合的赋形剂的一例。现有技术中还有其他合适的赋形剂。参见， 例如Ansel等人，药品剂型与药物输送系统，第5版(Lea & Febiger 1990)和Gennaro (编 辑)，雷明顿的制药科学，第18版(Mack出版公司1990)及它们的修订版。本文所述的组合物的优选给药途径是parental注射。注射可以是静脉注射、动脉 注射、淋巴管注射、鞘内注射、腔内注射(即非口服注射)。非口服施用中，组合物与药学上 可接受的赋形剂被制成单元计量注射形式(例如溶液、悬浊液或乳剂)。这些赋形剂本身是 无毒和无疗效的。这些赋形剂例如盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液。也可以使 用无水赋形剂诸如固定油和油酸乙酯。优选赋形剂是5%葡萄糖盐水。所述赋形剂可以包 含少量添加剂，如提高渗透压和化学稳定性的物质，其包括缓冲剂和防腐剂。包括口服给药 的其他给药方式也在考虑范围内。包含F-18标记分子的制剂组合物可以通过例如团注或连续输注进行静脉给药。 注射用组合物可以添加防腐剂，在例如安瓿或多剂量容器中以单元剂量形式存在。组合物 也可以在油性或水性媒质中的悬浮液、溶液或乳液形式存在，且含有如悬浮剂、稳定剂和/ 或分散剂的成型剂。可选地，所述组合物可以以粉末形式在使用前与合适的媒质例如灭菌 无热原水混合。组合物可以以溶液形式给药。溶液的pH应当在pH 5至9. 5范围内，优选pH 6.5 至7. 5。因而制剂应当在含有适当的药学上可接受缓冲剂(例如磷酸、TRIS(羟甲基)氨 基甲烷-HCl或柠檬酸等)的溶液中。缓冲液浓度应当在1至IOOmM范围。制剂溶液也可 以含有盐，例如浓度50至150mM的氯化钠或氯化钾。还可以包含有效量的稳定剂，例如甘 油、白蛋白，球蛋白、去污剂、明胶、鱼精蛋白或鱼精蛋白的盐。组合物可以给药至哺乳动物 皮下、静脉内、肌肉内或其他非口服途径。此外，给药方式可以通过连续注输或通过单次或 多次团注。当施用双特异性抗体时，例如在预靶向技术中，人类给药抗体的剂量取决于各种 因素，例如患者的年龄、体重、身高、性别、日常身体状况和先前病史。典型地，为达到靶向的 目的，需要为受者提供一定剂量的双特异性抗体，其以约Img至200mg范围作为单次静脉 输注，也可根据情况指示施予更低或更高的剂量。典型地，需要提供受者一定剂量，即在约 IOmg每平方米体表面积或一般成年人17至18mg抗体的范围内，也可以根据情况施用更低 或更高的剂量。可以成像目的施用于人受试者的双特异性抗体剂量的例子为1 200mg，优 选1 70mg，最优选1 20mg，尽管可使用更高或更低的剂量。通常，施予F-18标记的剂量取决于各种因素，例如患者的年龄、体重、身高、性别、 日常身体状况和先前病史。优选地，施予患者F-18标记分子的饱和剂量。F-18标记分子的 给药剂量可以以毫居里来衡量。F-18成像研究的典型范围是5至IOmCi。肽的施用要求保护的方法和/或组合物的各种实施方式可以涉及待施予受试者的一种或 多种F-18标记肽。给药方式可以采用任何现有技术的方式，包括但不限于口服、经鼻、含 服、吸入、直肠、阴道、局部、正位、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉注射。例 如，当F-18标记肽在预靶向协议中施用时，肽优先以静脉注射方式给药。以口服方式施用于受试者的未修饰的肽可在消化道中降解，根据序列和结构可以 穿过肠道内膜表现出弱的吸收。然而，以化学的方式修饰肽使得它们受内源性蛋白酶降解的影响降低或通过消化道时吸收增加的方法是已知的(参见，例如，Blondelle等人，1995， Biophys. J. 69 :604-11 ；Ecker 禾口 Crooke，1995，Biotechnology 13 :351-69 ；Goodman 禾口 Ro， 1995,BURGER' S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISC0VERY，V0L·I，Wollf编，John Wiley & Sons ；Goodman 和 Shao，1996，Pure & Appl. Chem. 68 :1303-08)。用于制备肽类似物库的 方法，例如含有D-氨基酸的肽；由模拟肽结构的有机分子组成的肽模拟物；或类肽诸如插 烯加成的类肽，这些方法也已被描述，可以用于构建适合口服施用于受试者的基于F-18标 记分子的肽。在某些实施方式中，标准的肽键连接可以被一个或多个替代性连接基团所取代， 诸如CH2-NH, CH2-S, CH2-CH2, CH = CH, CO-CH2，CHOH-CH2等。用于制备肽模拟物的方法式已知 的(例如，Hruby, 1982，Life Sd 31 :189-99 ；HoIladay 等人，1983，Tetrahedron Lett. 24 4401-04 Jennings-White 等人，1982，^Tetrahedron Lett. 23 2533 ；Almquiest φ 人， 1980，J. Med. Chem. 23 1392—98 ；Hudson 等人，1979，Int. J. Pept. Res. 14 :177-185 ；Spatola 等人，1986，Life Sci 38 :1243-49 ；美国专利号 5，169，862 ；5，539，085 ；5，576，423， 5，051，448，5，559，103，分别通过引用并入本文)。肽模拟物可以表现出相比它们的肽类似 物更高的体内稳定性和/或吸收。可选地，利用给N端和/或C端加帽来阻止外肽酶活性，从而肽可以通过口服递送 给药。例如，C端可利用酰胺肽加帽，N端可通过肽的乙酰化作用加帽。肽也可以环化以阻 断外肽酶，例如形成环酰胺、二硫化物、醚类、硫化物等。肽的稳定性还可以通过将D-氨基酸替代天然形成的L-氨基酸，尤其是在内肽 酶会起作用的位置。内肽酶的结合和切割序列是现有技术已知的，制备和利用掺入D-氨 基酸的肽的方法已被描述(参见，McBride等人，2004年6月14提交的美国专利申请号 20050025709，其通过引用并入本文)。在某些实施方式中，通过与蛋白酶和/或肽酶抑制剂 联合制剂，肽和/或蛋白质可以口服给药。其它口服递送治疗肽的方法公开在Metha( “Oral delivery andrecombinant production of peptide hormones", 2004 年 6 月，BioPharmInternational)。月太与!!武 形剂以肠溶包衣固体剂型给药，所述赋形剂可以调节肠蛋白水解活性和提高肽转运穿 越肠壁。利用该技术的完整肽的相对生物利用度可达到给药剂量的至10%范围 内。胰岛素利用与胆酸钠和蛋白酶抑制剂的肠溶包衣微囊剂已经成功施用于狗(ZiV等 Α 1994, J. BoneMiner. Res. 18 (Suppl. 2) :792-94. Oral administration of peptides has beenperformed using acylcamitine as a permeation enhancer and an enteric coating (Eudragit L30D_55，Rohm Pharma Polymers，参见 Mehta，2004)。用于 口月艮给药的 肽的赋形剂通常包含一种或多种肠蛋白酶/肽酶抑制剂，并伴有去污剂或其他试剂以提高 肽的溶解性或吸收，其可被包装成肠溶包衣胶囊或药片(Mehta，2004)。有机酸可以包含在 胶囊中以酸化肠道，当胶囊溶解于肠道时抑制肠蛋白酶活性(Mehta，2004)。其余可选的用 于口服递送的肽可以包含与基于聚乙二醇(PEG)的两亲性寡聚物缀合，增加吸收和阻止酶 促降解(Soltero and Ekwuribe，2001，Pharm. Technol. 6 :110)。产生抗体的方法肽主链的Ab可通过公知的Ab生产方法产生。例如，向免疫活性动物中注射于完 全弗氏佐剂中的免疫原(诸如(肽)n_KLH(其中KLH是钥孔血蓝蛋白，并且n= 1-30)),接下来再两次注射悬于不完全弗氏佐剂中的同一免疫原，在静脉推注抗原后三天收获脾细 胞。然后将收获的脾细胞与Sp2/0-Agl4骨髓瘤细胞融合，并使用直接结合ELISA分析所得 克隆的培养上清液的抗肽反应性。产生的Ab的特异性可通过使用原始免疫原的肽片段进 行分析。这些片段可使用自动肽合成仪容易地制备。对于Ab生产，分离酶缺陷的杂交瘤以 便能够选择融合的细胞系。此技术也可用于产生针对包含可靶向构建体的一种或多种螯合 物(例如，In (III)-DTPA螯合物)的抗体。h (III) _双-DTPA的单克隆小鼠抗体是已知的 (Barbet，395 见上)。使用的靶向抗体，例如作为双特异性抗体的组分，可以对作为标志物质的多种细 胞表面或细胞内肿瘤相关抗原具有特异性。这些标志物可以是肿瘤产生的物质，或可以是 在肿瘤部位、在肿瘤细胞表面或在肿瘤细胞内(无论是在细胞质、核还是在各种细胞器或 亚细胞结构中)积累的物质。此类肿瘤相关标志物包括由He内erman，“Immunodiagnosis of Cacer”(癌症的免疫诊断)，Fleisher编，“The Clinical Biochemistry of Cancer”(癌 症的临床生物学)，第 347 页(American Association of Clinical Chemists, 1979)和在 美国专利第4，150，149 ；4, 361，544 ；和4，444，744号中公开的那些，分别通过引用并入本 文。关于肿瘤相关抗原的最新报道包括Mizukami等人(2005，Nature Med. 11 :992-97)； Hatfield 等人(2005，Curr. Cancer DrugTargets 5 :229-48) ；ValIbohmer 等人(2005， J. Clin. Oncol. 23 :3536-44)；和 Ren 等人(2005, Ann. Surg. 242 :55-63)，分别通过引用并 入全文。Herbeman (见上)已将肿瘤相关标志物分为许多类别，包括瘤胚抗原、胎盘抗原、 致癌或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异位激素和正常抗原或其变体。 有时，肿瘤相关标志物的亚基有利地用于产生具有更高肿瘤特异性的抗体，例如，人绒毛膜 促性腺激素(HCG)的β亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，其刺激对非肿瘤物质具有大大降 低的交叉反应性的抗体的产生，如美国专利第4，361，644和4，444，744号所公开。感兴趣的另一种标志物是跨膜激活剂及CAML-相互作用分子(TACI)。参见，Yu等 人Nat. Immunol.，1 :252-256 (2000)。简单地说，TACI是B细胞恶性肿瘤(例如，淋巴瘤) 的标志物。进一步，已知TACI和B细胞成熟抗原(BCMA)被肿瘤坏死因子同系物(一种增殖 诱导配体(APRIL))结合。APRIL刺激原B细胞和T细胞的体外增殖，并由于B细胞在体内 的积累而增加脾的重量。APRIL还与TALL-I (也称为Blys或BAFF)竞争受体的结合。可溶 性BCMA和TACI特异性防止APRIL的结合，并阻断APRIL-刺激的原B细胞的增殖。BCMA-Fc 还抑制小鼠中针对钥孔血蓝蛋白和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗体的产生，表明经由BCMA和 /或TACI的APRIL和/或TALL-I信号转导是产生体液免疫必需的。因此，APRIL-TALL-I 和BCMA-TACI形成参与B细胞和T细胞功能刺激的两配体-两受体途径。用于成像各种疾病或疾患(诸如恶性疾病、心血管疾病、传染病、炎性疾病、自身 免疫病或神经疾病)的示例性靶抗原可包括结肠特异性抗原-P(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、 CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、 CD80、HLA-DR、Ia、Ii、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、NCA(CEACAM6 或 CD66a_d 和 CD67 以及 CD138)、 EGFR、HER 2/neu、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-I、Le (y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、叶酸 受体、VEGFR、P1GF、ILGF-1、坏死抗原、IL_2、IL_6、T101、MAGE或这些抗原的组合。尤其是， 抗原可包括癌胚抗原(CEA)、腱糖蛋白、表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、血管内皮生长因子受体、神经节苷脂、HER/2neU受体和这些抗原的组
I=I O当涉及淋巴瘤、白血病或自身免疫失调的成像或检测时，靶向抗原可以选自CD4， CD5，CD8，CD14, CD15, CD 19，CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, B7, MUCl, la, Ii, HM 1. 24， HLA-DR，腱糖蛋白，VEGF，PlGF, ED-B纤连蛋白，癌基因，癌基因产物，CD66a_d，坏死抗原， IL-2, T 101，TAG, IL-6，MIF, TRAIL-Rl (DR4)和 TRAIL-R2 (DR5)。最初产生针对免疫原的抗体后，可对抗体进行测序，并随后通过重组技术制备。鼠 抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员公知的。例如，通过以下制备人源化单 克隆抗体将来自小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变链的小鼠互补决定区转移到人可变区， 然后在框架区内用鼠对应残基置换人残基。使用衍生自人源化单克隆抗体的抗体组分消 除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般技术描述 于例如以下出版物Orlandi 等人，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA, 86 :3833 (1989)，其通过引用 整体并入本文。生产人源化Mab的技术描述于例如Jones等人，Nature, 321 :522 (1986)， Riechmann 等人，Nature,332 :323(1988), Verhoeyen 等人，Science，239 :1534(1988), Carter 等人，Proc. Nat，IAcad. Sci. USA, 89 :4285 (1992)，Sandhu, Crit. Rev. Biotech.，12 437(1992)和Singer等人，J. Immun.，150 :2844(1993)，其每个通过引用整体并入本文。可选地，完全人抗体可从转基因非人的动物获得。参见，例如，Mendez等人，Nature Genetics, 15 :146-156(1997)；美国专利第5，633，425号。例如，可从具有人免疫球蛋白基 因座的转基因小鼠中回收人抗体。小鼠体液免疫系统通过灭活内源免疫球蛋白基因并引入 人免疫球蛋白基因座而被人源化。人免疫球蛋白基因座极其复杂，并包含总共占人类基因 组近0.2%的大量离散区段。为了确保转基因小鼠能够产生足够的抗体谱，必须将人重链和 轻链基因座的大部分引入小鼠基因组。这是以逐步过程实现的，开始于形成含有胚系构型 的人重链或轻链免疫球蛋白基因座的酵母人工染色体(YAC)。由于每个插入物的大小是大 约1Mb，YAC的构建要求免疫球蛋白基因座的重叠片断的同源重组。经由含有YAC的酵母球 芽与小鼠胚胎干细胞的融合，将两个YAC (—个含有重链基因座而一个含有轻链基因座)分 别引入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆微注射于小鼠胚泡。得到的嵌合雄性根据其通过其种 系递送YAC的能力进行筛选，并将其与具有鼠抗体产生缺陷的小鼠杂交。繁殖两个转基因 品系(一个含有人重链基因座而另一个含有人轻链基因座)产生响应于免疫接种而产生人 抗体的子代。未重排的人免疫球蛋白基因也可经由微细胞介导的染色体转移(MMCT)被引入小 鼠胚胎干细胞。参见，例如，Tomizuka等人，NatureGenetics，16 :133(1997)。在此方法中， 含有人染色体的微细胞与小鼠胚胎干细胞融合。转移的染色体被稳定地保持，并且成年嵌 合体显示适当的组织特异性表达。作为替代方案，抗体或抗体片段可从分离自组合免疫球蛋白库的人抗体片段衍 生。参见，例如，Barbas 等人，METHODS :A Companion to Methodsin Enzymology 2 (方法 与酶学方法的比较 2) :119(1991)，和 Winter 等人，Ann. Rev. Immunol, 12 :433 (1994)，其通 过引用并入本文。与通过B细胞永生产生单克隆抗体相关的许多困难可通过使用噬菌体展 示在大肠杆菌中改造和表达抗体片段来克服。
可采用相似的策略获得高亲和力scFv。参见，例如，Vaughn等人，Nat. Biotechnol，14 :309-314(1996)。通过使用对应于所有已知VH、VK和V80基因家族的PCR引 物从未免疫的人供体分离V基因，可构建大库藏的scFv库。扩增之后，Vk 库被合并 形成一个库。将这些片断连接入噬菌粒载体。然后将scFv接头(Gly4，Ser)3连接于噬菌 粒中\片段的上游。扩增Vh和接头片段并在Jh区上装配。将得到WVh-接头片段 连接于噬菌粒载体。可使用如上所述的过滤器或使用免疫管(NUNC ;MAXISORP )淘选噬菌粒库。相似的结果可通过从免疫的兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋 白库和通过在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达scFv构建体来实现。参见，例如， Ridder等人，Biotechnology, 13 :255-260 (1995)。另外，分离适当的scFv后，具有更高的 结合亲和力和更慢的解离速率的抗体片段可通过亲和力成熟过程(诸如⑶R3诱变和链改 组)获得。参见，例如，Jackson 等人，Br. J. Cancer, 78 181-188 (1998) ；Osbourn 等人， Immunotechenology, 2 181-196(1996)。抗体片段的另一形式是编码单个⑶R的肽。⑶R肽(“最小识别单位”)可通过构 建编码目标抗体的CDR的基因来获得。此类基因例如通过使用聚合酶链式反应来制备，以 从产生抗体的细胞的RNA合成可变区。参见，例如，Larrick等人，METHODS :A Companion to Methods inEnzymology 2 (方法与酶学方法的比较)2 :106 (1991) ；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”(单克隆抗体的遗传操作)，选自单 克隆抗体产生、改造和临床应用(MONOCLONALANTIBODIES PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION)，Ritter 等人(编)，第 I66-I79 页(Cambridge University Press 1995)；禾口 Ward 等人，"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies，，(抗体的 遗传操作和表达)，选自 MONOCLONAL ANTIBODIES PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS (单克隆 抗体原理和应用)，Brich 等人(编)，第 137-185 页(ffiley-Liss, Inc. 1995)。双特异性抗体可通过本领域已知的技术制备，例如，抗CEA肿瘤Ab和抗肽Ab 二 者分别用胃蛋白酶消化为它们各自的F(ab’)2片段。用半胱氨酸还原抗CEA-Ab-F(ab’ )2 以产生Fab’单体单元，其进一步与交联剂双(马来酰亚胺基)己烷反应以产生Fab’ -马 来酰亚胺部分。用半胱氨酸还原抗肽Ab-F (ab，)2，并且纯化的、回收的抗肽Fab，-SH与抗 CEA-Fab'-马来酰亚胺反应以产生Fab，χ Fab，双特异性Ab。可选地，抗肽Fab，-SH片段 可与抗CEA F(ab' )2偶联以产生F(ab，)2xFab'构建体，或与抗CEA IgG偶联以产生IgG χ Fab’双特异性构建体。在一个实施方案中，IgG χ Fab’构建体可如下以位点特异性的方式 制备将抗肽Fab’巯基与已用高碘酸盐氧化的抗CEAIgG重链碳水化合物连接，然后通过与 可商业化获得的酰胼-马来酰亚胺交联剂反应而活化。使用的组分Ab可通过已知技术被 嵌合或人源化。嵌合抗体是含有来自啮齿类动物抗体的可变区和互补决定区的重组蛋白， 而抗体分子的剩余部分衍生自人抗体。人源化抗体是其中单克隆抗体的鼠互补决定区被从 鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移至人可变区的重组蛋白。嵌合Ab是通过连接编码小鼠轻链可变区和重链可变区的cDNA片段与编码人抗体 C结构域的片段而构建的。由于C结构域不参与抗原结合，因此嵌合抗体将保留与原始小鼠 Ab相同的抗原特异性，但在序列上将更接近人抗体。不过，嵌合Ab仍还有一些小鼠序列，并 且仍可以是免疫原性的。人源化Ab仅含有识别抗原必需的那些小鼠氨基酸。此产物是通 过将小鼠互补决定区的氨基酸结合于人抗体框架内而构建的。
产生双特异性抗体的其他最近方法包括具有额外的半胱氨酸残基以便他们比 更常见的免疫球蛋白同种型更强地交联的改造的重组Ab。参见，例如，FitGerald等人， Protein Eng.，10 1221-1225，1997。另一途径是改造重组融合蛋白质，连接具有需要的双 特异性的两个或多个不同的单链抗体或抗体片段区段。参见，例如，Coloma等人，Nature Biotech.，5 :159-163,1997。使用分子工程可产生多种双特异性融合蛋白质。在一种形式 中，双特异性融合蛋白质是单价的，由例如具有一个抗原的单个结合位点的scFv和具有第 二抗原的单个结合位点的Fab片段组成。在另一种形式中，双特异性融合蛋白质是二价的， 由例如具有一个抗原的两个结合位点的IgG和具有第二抗原的两个结合位点的两个scFv 组成。功能性双特异性单链抗体(bscAb)(也称为双抗体)可使用重组方法在哺乳动物 细胞中产生。参见，例如，Mack 等人，Proc. Natl. Acad. Sci,92 :7021-7025,1995。优选的双特异性抗体是包括MAb Mu-9的Fv和MAb 679的Fv、或MAb MN-14的Fv 和MAb 679的Fv，及其人、嵌合化或人源化对应物的那些抗体。MN-14以及其嵌合化和人源 化对应物公开于美国专利第5，874，540号。另外优选的是包括Mu-9或679的一个或多个 ⑶R的双特异性抗体。抗体还可以是包括III类抗CEA抗体和679III类抗体的Fv的融合 蛋白质或双特异性抗体。包括III类抗CEA的III类抗体在美国专利第4，818，709号中详 细讨论。技术人员将意识到双特异性抗体可以结合任何现有技术中已知的抗体或片段，所 述抗体或片段具有已知与疾病情形或状况相关的靶抗原的结合特异性。这些已知抗体包 括但不限于LLl (抗-CD74)，LL2和RFB4(抗-CD22)，hA20 (抗-CD20)，RS7(抗上皮糖蛋 白-1 (EGP-I))，PAM-4和KC4 (均抗粘蛋白)，MN-14 (抗癌胚抗原(CEA，也称作CD66e))， MN-3或MN-15 (NCA或CEACAM6)，Mu-9 (抗结肠特异性抗原ρ)，Immu 31 (抗甲胎蛋白)， TAG-72 (如CC49)，Tn, J591 (抗-PSMA (前列腺特异性膜抗原))，G250 (抗碳酸酐酶IX MAb) 和L243(抗-HLA-DR).所述抗体在现有技术中已知(如美国专利号5，686，072 ；5，874，540 ； 6，107，090 ；6，183，744 ；6，306，393 ；6，653，104 ；6，730. 300 ；6，899，864 ；6，926，893 ； 6. 962，702 ；7，074，403 ；7，230，084 ；7，238，785 ；7，238，786 ；7，256，004 ；7，282，567 ； 7，300，655 ；7，312，318 ；和美国专利申请公开号 20040185053 ；20040202666 ；20050271671 ； 20060193865 ；20060210475 ；20070087001 ；全部内容通过引用并入本文)。这些已知抗 体用于检测和/或成像各种疾病情形或状况(例如hMN-14或TF2bsMAb (CEA-表达癌)， hA20bsMab (TF-4-淋巴瘤)，hPAM4 (TF-10胰腺癌)，RS7bsMAb (肺、乳腺、卵巢、前列腺癌)， hMN-15 或 hMN3bsMAb (炎症)，人类 gpl20 和 / 或 gp41bsMAbs (HIV)，抗血小板 bsMab 和抗凝 血酶bsMAb (凝块成像)，抗肌球蛋白bsMAb (心肌坏死))。候选的抗HIV 抗体包括 Johansson 等人(AIDS. 20060ct 3 ；20 (15) :1911-5)所 述的抗包膜抗体，和Polymun(Vienna，Austria)描述和销售的抗HIV抗体，以及美国专利 5，831，034，美国专利 5，911，989，和 Vcelar 等人，AIDS 2007 ；21 (16) :2161-2170 和 Joos 等 人，Antimicrob. Agens Chemother. 2006 ；50(5) :1773-9中描述的，全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，上面讨论的bsAb F-18标记的可靶向的构建体可用于手术中、 血管内和/或内窥镜肿瘤以及损伤检测、活组织检查和治疗，如美国专利第6，096，289号所述。用标记的分子成像利用标记分子的成像方法在现有技术中已知，且任何这样已知的方法可以使用本 文所述的氟-标记分子。参见，例如美国专利号6，241，964 ；6, 358，489 ；6, 953，567和公开 的美国专利申请公开号20050003403 ；20040018557 ；20060140936，全部内容通过引用并入 本文。也可参见，Page 等人，Nuclear Medicine And Biology, 21 :911_919，1994 ;Choi 等 人，CancerResearch 55 :5323-5329,1995 Jalutsky 等人，J. Nuclear Med. ,33 :575-582, 1992 ；Woessner 等人.Magn. Reson. Med. 2005，53 :790-99。在某些实施方式中，F-18标记分子可以用于正常或患病组织和器官的成像，例如 利用美国专利号 6，126，916 ；6，077，499 ；6，010，680 ；5，776，095 ；5，776，094 ；5，776，093 ； 5，772，981 ；5，753，206 ；5，746，996 ；5，697，902 ；5，328，679 ；5，128，119 ；5，101，827 和 4，735，210中所描述的方法，分别通过引用并入本文。其他的方法在1999年6月22日提交 的美国申请号09/337，756和2001年4月3日提交的美国申请号09/823，746中描述。所述 成像可以通过直接F-18标记合适的靶向分子或通过预靶向成像方法实现，如Goldenberg 等人 Q007，Update Cancer Ther. 2 :19-31) ；Sharkey 等人 Q008，Radiology246 497-507) ；Goldenberg 等人(2008，J. Nucl. Med. 49 :158-63) ；Sharkey 等人(2007, Clin.Cancer Res. 13 :5777s_5585s) ；McBride 等人(2006, J. Nucl. Med. 47 :1678-88)； Goldenberg等人(2006, J. Clin. Oncol. 24 :823-85)中所描述，也可参见美国专利申请号 20050002945, 20040018557, 20030148409 和 20050014207，分别通过引用并入本文。用标记肽或Mabs诊断成像的方法是已知的。例如，在免疫闪烁成像技 术中，配体或抗体以伽马射线放射性同位素标记和施用于患者。伽马射线照相 机用于检测伽马射线放射性同位素的位置和分布。参见，例如Srivastava(编 辑)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANHBODIES F0RIMAGING AND THERAPY(Plenum Press 1988), Chase, " MedicalApplications of Radioisotopes, " in REMINGTON ' S PHARMACEUTICALSCIENCES,18th Edition, Gennaro 等人(编辑)， pp. 624-652(Mack PublishingCo. ,1990)禾口 Brown， “ Clinical Use of Monoclonal Antibodies, “ inBIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto 等人(编辑)(Chapman & Hall 1993)。同样优选使用正电子发射放射性同位素(PET同位素)，诸如用511keV的 能量，如18F,68Ga,64Cu,和1241。这些放射性同位素可以通过众所周知的PET扫描技术进行成 像。实施例实施例1.肽IMP272的F-18标记使用的第一个肽是IMP272 DTPA-Gln-Ala-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)_NH2MH+1512乙酸盐缓冲溶液-乙酸1. 509g于 160ml水中稀释，并通过加入IMNaOH调节pH 然后稀释至250ml以获得pH 4. 03的0. IM溶液。乙酸铝缓冲溶液铝溶液通过将0. 1028g的AlCl3六水合物溶解于42. 6ml DI水 中来制备。細1等份的铝溶液与16ml的0. IM NaOAc溶液(pH 4)混合，以提供2mM Al贮存溶液。
IMP 272 乙酸盐缓冲溶液将肽 0. 0011g、7. ^Xl(T7molIMP 272 溶解于 364 μ L 的 0. IM ρΗ 4的乙酸盐缓冲溶液，以获得肽的2mM的贮存溶液。F-18标记IMP 272 :3 μ L等份的铝贮存溶液置于REACTI-VIAL 并与50 μ L F-18 (原始样品)和3 μ L的IMP 272溶液混合。溶液在加热器中于110°C加热15分钟，并 通过反相HPLC分析。HPLC谱图(未显示)显示93%的游离F-18和7%与肽结合的F-18。 向所述反应中加入另外10 μ L的IMP 272溶液，并再次加热和通过反相HPLC分析(未显 示)。HPLC谱图显示8%的F-18处于空体积，而92%的活性连接至肽。剩余的肽溶液在室 温下与150 μ L PBS温育 1小时，然后通过反相HPLC分析。HPLC (未显示)显示58%的 F-18未结合，而42%的F-18仍连接至肽。数据表明F-18-A1-DTPA络合物在与磷酸盐混合 时可能不稳定。反相HPLC 反相HPLC分析在下列条件下进行柱WATERSXTERRA MS C185 μ m，4· 6 X 250mm流速lmL/分钟梯度缓冲液缓冲液C，于DI水中的0. 1 % NH4OAc,缓冲液D，90%乙腈、10%水和 0. 1 % NH4OAc梯度100%缓冲液C至100%缓冲液D，使用30分钟的线性梯度。运行时间30分钟尺寸排阻HPLC 尺寸排阻HPLC在下列条件下进行柱BIORAD BIO-SIL SEC 250,300X7. 8mm梯度等度洗脱缓冲液0. 2M磷酸盐ρΗ 6. 8流速ImL/分钟运行时间30分钟所有放射谱图都是使用PERKINELMER 610Tr监测F-18的发射获得的。表1_3 分别列表呈现数据。表1F-18+IMP 272+AlCl3在110°C下加热15分钟，接着通过反相HPLC分析。区F-18检测器FSA
开始结束保留高度面积% ROI名称(分钟)(分钟)(分钟)(CPM)(CPM)(%)(%)Bkg 12. 202. 302. 20130. 0区12. 303. 302. 6085270. 0200050. 093. 1596.31Bkg 24. 404. 504. 40210. 0区28. 709. 809. 005590. 014720. 06. 857. 092个峰214770. 0100.00103. 40
表2F-18+过量IMP 272+AlCl3在110°C下加热15分钟，接着通过反相HPLC分析。区F_18检测器FSA
权利要求
1.一种用F-18标记分子的方法，其包括a)使F-18和金属反应形成F-18金属络合物；和b)将F-18金属络合物连接至分子，形成一种或多种可施用于受试者的F-18标记的分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述络合物连接至所述分子上的螯合部分。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述分子是蛋白质或肽。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述金属选自铝、镓、铟、镥和铊。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的F-18标记的分子在水溶液中稳定。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述的F-18标记的分子在血清中稳定。
7.如权利要求2所述的方法，其中螯合部分选自D0TA，TETA，NOTA，NETA或NOTA的衍 生物。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述肽是IMP449 (N0TA-ITC苄基-D-Ala-D-Lys (HS G)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2)。
9.如权利要求1所述的方法，其进一步包括不从未标记的分子中分离所述F-18标记 的分子而将所述F-18标记的分子施用于受试者。
10.如权利要求1所述的方法，进一步包括c)从未标记的分子中分离所述F-18标记的分子得到纯化的F-18标记的分子；和d)将纯化的F-18标记的分子施用于受试者。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述纯化的F-18标记的分子从所述方法一开始的 1小时内制备得到。
12.如权利要求10所述的方法，进一步包括利用PET扫描使受试者体内纯化的F-18标 记的分子的分布进行成像。
13.一种用F-18标记分子的方法，其包括a)使F-18和硼反应形成F-18硼络合物；和b)将F-18硼络合物连接至分子，形成一种或多种可施用于受试者的F-18标记的分子。
14.一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与金属结合的条件下将F-18添 加至所述金属标记的分子。
15.一种用F-18标记分子的方法，其包括在允许F-18与硼结合的条件下将F-18添加 至硼标记的分子。
16.一种F-18标记的蛋白质或肽，其包括连接至所述蛋白质或肽的F-18金属络合物。
17.如权利要求16所述的F-18标记的蛋白质或肽，其中所述的金属选自铝、镓、铟、 镥和铊。
18.—种F-18标记的蛋白质或肽，其包括连接至所述蛋白质或肽的F-18硼络合物。
19.一种通过正电子成像术(PET)的F-18成像方法，其包括a)使F-18和铝、镓、铟、镥或铊反应形成F-18络合物；b)将F-18络合物连接至分子，形成一种或多种F-18标记的分子；c)在其中所述标记的分子被定位至一种或多种细胞、组织或器官的条件下，将所述 F-18标记的分子施用于受试者；和d)通过PET扫描对所述F-18标记的分子的分布进行成像。
20.如权利要求19所述的方法，其中不从未标记的分子中分离所述F-18标记的分子而 将所述F-18标记的分子施用于受试者。
21.如权利要求19所述的方法，进一步包括e)在F-18标记的分子施用于受试者之前，将所述F-18标记的分子从未标记的分子中 分离得到纯化的F-18标记的分子。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子的成像分布可以表明是否存在疾病。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述疾病选自实体瘤(癌、肉瘤、黑素瘤、神经 胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、前列腺癌)、造血癌(白血病、淋巴瘤、 骨髓瘤)、自身免疫疾病、神经退行性疾病、阿尔茨海默病、心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰 竭、心肌坏死、血栓症、中风、炎症、动脉硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮、AIDS和病原体感^fe ο
24.如权利要求19所述的方法，其中所述的F-18标记的分子用于受体成像。
25.如权利要求M所述的方法，其中所述受体是血管形成受体，所述F-18标记的分子 是缀合 Al-18F 的 RGD-N0TA。
26.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子用于肿瘤成像。
27.如权利要求沈所述的方法，其中所述F-18标记的分子是F-18标记的蛙皮素。
28.如权利要求沈所述的方法，其中所述F-18标记的分子是抗体或其片段，选自如 hLLl、hLL2、hlmmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu_9、hMN_3、hMN-15 和 hL243。
29.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子是F-18标记的Ν0ΤΑ，所述 F-18标记的NOTA用于肾血流成像。29.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子使用抗体、抗体片段、或抗体 构建体靶向目标位点。
30.如权利要求19所述的方法，其中所述F-18标记的分子使用双特异性抗体靶向目标 位点。
31.如权利要求30所述的方法，进一步包括i)将双特异性抗体施用于受试者，所述双特异性抗体具有至少一个针对可靶向构建体 的结合位点和至少一个针对靶向抗原的结合位点，其中所述靶向抗原的存在指示疾病或病 症，所述可靶向构建体是F-18标记的分子；和 )在施用可靶向构建体之前，允许足量的时间以使未与靶向抗原结合的双特异性抗 体从循环中清除。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述靶向抗原是肿瘤相关抗原。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述靶向抗原存在于病原生物上。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌、酵母或微生物。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述病毒选自人免疫缺陷病毒(HIV)、疱症病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病 毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样 病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病病毒、小鼠乳癌病毒、水痘带状疱疹病毒、登革热病毒、风 疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病 毒；或所述细菌选自无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜 炎奈瑟菌、肺炎球菌、乙型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风 分支杆菌、流产布鲁杆菌、结核分枝杆菌和破伤风梭菌。
36.如权利要求32所述的方法，其中靶向抗原选自结肠特异性抗原-ρ(CSAp)、癌胚 抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、 CD66a-d、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD138、HLA-DR、Ia、Ii、MUC UMUC 2、MUC3、MUC 4、NCA、 EGFR、HER 2/neu 受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le (y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、 叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PWF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6、TlOl、MAGE 或这 些抗原的组合。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述的双特异性抗体包括抗体或其片段，选自 hLLl、hLL2、hlmmu31、hPAM4、hRS7、hA19、hA20、hMN-14、hMu_9、hMN_3、hMN-15 和 hL243。
38.一种用于F-18标记的试剂盒，包括a)金属或硼，以与F-18形成络合物；b)任选地，包含一个或多个螯合部分的靶向肽，以与F-18络合物结合。
39.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括一种或多种缓冲剂。
40.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括辐射分解保护剂。
41.如权利要求40所述的试剂盒，其中所述辐射分解保护剂是抗坏血酸。
42.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述肽是IMP449。
43.如权利要求38所述的试剂盒，其中所述金属是铝、镓、铟、镥或铊。
44.如权利要求38所述的试剂盒，进一步包括一种双特异性抗体，所述抗体具有一个 针对靶向肽的结合特异性和另一个针对靶抗原的结合特异性。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述靶抗原是肿瘤相关抗原。
46.如权利要求45所述的试剂盒，其中所述靶抗原选自结肠特异性抗原-ρ(CSAp)、癌 胚抗原(CEA)、CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、 CD66a-d、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD138、HLA-DR、la、Ii、MUC UMUC 2、MUC3、MUC 4、NCA、 EGFR、HER 2/neu 受体、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le (y)、S100、PSMA、PSA、腱糖蛋白、 叶酸受体、VEGFR、EGFR、PDGFR、FGFR、PWF、ILGF-1、坏死抗原、IL-2、IL-6, TlOU MAGE 或这 些抗原的组合。
47.如权利要求44所述的试剂盒，进一步包括从循环中清除未与靶抗原结合的双特性 抗体的清除剂。
全文摘要
本申请公开了用于例如PET成像技术的F-18标记分子的组合物和合成方法以及用途。在特定的实施方式中，标记的分子可以是肽或蛋白质，虽然其他类型的分子(包括但不限于核酸适体、寡核苷酸和核酸)可被标记并用于此类成像研究。在优选的实施方式中，F-18标记可通过形成金属络合物并将F-18-金属络合物结合至螯合部分(比如DOTA，NOTA，DTPA，TETA或NETA)而与靶向分子缀合。在其他的实施方式中，金属可首先与螯合基团缀合，随后F-18结合至金属。在其他优选的实施方式中，F-18标记的部分可包含可靶向的缀合物，其可与双特异性或多特异性抗体联合使用，以将F-18靶向至与疾病、医疗状况或病原体相关的细胞或组织上表达的抗原。示例性结果显示F-18标记的可靶向缀合物肽于37℃下可在人血清中稳定数小时，有足够的时间进行PET成像分析。
文档编号A61K51/00GK102123739SQ200880120434
公开日2011年7月13日 申请日期2008年4月30日 优先权日2007年12月19日
发明者D·M·戈德堡, W·J·麦克布莱德 申请人:免疫医疗公司