专利名称：一种提取灵芝菌丝体胞内多糖的工艺和方法
技术领域：
本发明涉及生物制药生产技术，具体地说是一种提取灵芝菌丝体胞内多糖 工艺及其确定方法
背景技术：
灵芝是我国传统中药，中医上有滋补强壮，扶正固本的作用，至今已有2000 多年的使用历史。科学研究认为，灵芝具有双向免疫调节、降血脂、抗衰老和 抗肿瘤等多种作用，这些功能来自于灵芝的多种生物活性物质，灵芝多糖就是 其中的主要成分。
灵芝多糖广泛应用在医药、食品等领域，市场需求量与日俱增，但目前灵 芝多糖的生产几乎都是从子实体中提取，灵芝野生资源缺乏，人工栽培的周期 长(2-3个月以上)，占地面积大，又受季节限制，从而影响了灵芝的充分利用。 利用深层发酵技术生产灵芝菌丝体多糖，其生物功效和灵芝子实体多糖几乎相 同，而其生产周期短(7—10天)、成本低、产量大，具有工业化的生产前景。
在深层发酵中形成的灵芝菌丝体多糖分胞外多糖和胞内多糖两部分，而胞 内多糖占了60-90%，是灵芝多糖菌丝体多糖的主要来源。常用的提取多糖方式 有热水浸提法、酸浸提取法、碱提取法、酶提取法等。由于菌丝体细胞壁的存 在，细胞内的组分难以顺利释放到胞外，细胞内外的果胶质和蛋白质等非多糖 物质也使多糖的提取效率和纯度受到影响，传统的一些提取多糖方式致使灵芝 多糖的提取过程耗时长、提取率低、提取物中多糖含量相对较低，或者因化学 试剂的反应而破坏了多糖的分子活性构像。因此，寻找高效的多糖提取方法是 发展灵芝菌丝体多糖是这一领域的关键。天然药用成分大多为细胞内产物，提取时多需进行细胞破碎，而现有的机械和化学方法有时难于取得理想的破碎效果。将超声波技术应用于灵芝菌丝体多糖的提取，是利用超声波产生的强烈振动、高加速度、强烈的空化效应、搅拌等作用，加速有效成分进入溶剂，从而提高浸出率，縮短提取时间，同时可避免对提出成分的影响。此技术在中药有效成分提取、分离与制备工艺中已被广泛应用。
在菌丝体多糖的提取过程中，还可利用合适的酶，在较温和的条件下将细胞组织分解，加速有效成分的释放，从而提高多糖得率。将纤维素酶、果胶酶及蛋白酶组成的复合酶用于多糖的提取，以除去细胞壁胞和细膜上的果胶、纤维素及蛋白质等成分，使得菌丝体细胞顺利破裂,有利于促进胞内多糖的溶出，以达到提高提取率、縮短提取时间、减少能耗和有效保存多糖生物活性的目的。但由于加酶提取会提高生产成本，同时也给产物的分离带来困难，在添加量上要严格控制。
发明内容
本发明的目的在于，利用超声波作为辅助手段对灵芝菌丝体组织进行处理，同时以纤维素酶、果胶酶及蛋白酶组成的复合酶对灵芝菌丝体水浸液酶解获得灵芝多糖，提供一种具有比常规方法更佳的提取效果，以较低的成本提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺及其确定方法。
本发明的技术方案是 一种提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺组合，料液比按质量比为l: 10— 1: 60，复合酶加入量在原料质量的0.5%—5.0%之间，超声波功率范围值为100 W - 500 W之间，酶解时间范围值为40 min - 100 min之间，酶解温度范围值为30。C-60 。C之间，酶解pH值范围值为4.0-8.0之间。所述的提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺和方法为
1) 选取优质的菌丝体深层发酵所得的菌丝体干粉
2) 确定料液比
将步骤1)选定的菌丝体干粉充分溶入水中，灵芝菌丝体合理料液比在1:
10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之间；在该料液比条件下，进行热水浸提多糖实验，控制浸提温度为50 95 °C、浸提pH值4.0 7.5、浸提时间40 min 120 min范围内；浸提液蒸发浓縮5 15倍后，加入4倍体积的95%乙醇沉淀，2000rmp离心后去除上清液，真空干燥至恒重，称量；通过比较，确定热水浸提获得的灵芝菌丝体胞内多糖提取率最高的料液比，就是本品种的最佳料液比。3)确定复合酶的添加量
根据上面步骤2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的复合酶量，范围在浸提液原料质量的0.5%—5.0%之间；在合适的酶解条件下，进行单因素实验，确定最适的复合酶的添加量；在该复合酶的添加量条件下，控制浸提温度为40 65 。C、浸提pH值4.0 6.5、浸提时间40min 80min范围内；浸提液蒸发浓縮5 15倍后，加入4倍体积的95%乙醇沉淀，2000rmp离心后去除上清液，真空干燥至恒重，称量；通过比较，确定灵芝菌丝体胞内多糖提取率最高的复合酶的添加量，既为本品种的最佳复合酶的添加量。
4)确定超声波-复合酶解法提取本菌丝体干粉多糖的最佳提取工艺组合在超声波辅助作用下进行灵芝发酵菌丝体多糖的复合酶解提取；在步骤2)和3)的料液比和复合酶添加量的条件下，以超声波功率(因素A)、酶解时间(因素B)、酶解温度(因素C)、酶解pH值(因素C)为分析对象，进行4因素3水平正交实验，获得最佳提取工艺组合；根据前期实验结果，因素A的实验范围值为IOO W - 500 W之间，因素B的实验范围值为40 min - 100 min之间，因素C的实验范围值为30°060 。C之间，因素D的实验范围值为4.0-8.0之间；在该提取组合工艺条件下，进行菌丝体多糖提取，浸提液蒸发浓縮5 15倍后，加入4倍体积的95%乙醇沉淀，2000rmp离心后去除上清液，真空干燥至恒重，称量；通过比较，确定灵芝菌丝体胞内多糖提取率最高的工艺组合，既为本菌丝体干粉的最佳提取工艺组合。
本发明与现有技术相比，具有以下优点
1、 利用超声波产生的强烈振动、超高的速度、强烈的空化效应，可加速药物有效成分进入溶剂。
2、 复合酶的加入，有效地分解了这些非多糖组分，在超声波机制的协同作用下，可更加彻底地提高多糖的得率，縮短提取时间，节约溶剂，有利于保护多糖有效成分。
3、 技术在灵芝菌丝体多糖的提取工艺改造中，可显著降低生产成本，提高分离效率，并适合在工业化生产中推广应用。
具体实施方式
实施例l、
灵芝菌赤芝22号菌株(浙江省林业科学研究院提供)菌丝体深层发酵所得的菌丝体干粉多糖提取工艺组合，其组成是料液比按质量比为l: 30，复合酶加入量为2%，超声波功率为200W ，酶解时间50min，酶解温度55'C，酶解pH值5.0时。
所述的提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺的确定方法为
1)选用灵芝菌赤芝22号菌株(浙江省林业科学研究院提供)菌丝体深层发酵所得的菌丝体干粉。
2) 确定料液比
通过热水浸提法提取多糖。选取步骤1)的菌丝体干粉100g，以加水倍数
为分析因素，设置IO、 20、 30、 40、 50、 60倍(质量倍数)，加热至9(TC维持3小时，过滤。将滤液在旋转蒸发器浓縮至100ml，冷却至常温。力n400ml的959&乙醇于浓縮液中，同时用玻璃棒搅拌10分钟，将混合液1000rmp离心2分钟，去除上清液，得菌丝体多糖沉淀，真空干燥至恒重后称量。发现加入30倍重量(3000g)的水后，再增加水的倍数提取获得多糖量变化不大，故确定料液比为l: 30。3) 确定复合酶的添加量
通过复合酶解法提取多糖。以复合酶制剂添加量为实验因素，在料液比为l:30，温度45'C， pH6.5，酶解时间80min的条件下，复合酶添加量设置为O. 5°/0、1.0%、 1.5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5% (相对菌丝体干粉的质量百分比)，酶解时间80min后，95r加热灭酶5min， 8CTC热水继续浸提60min，过滤后滤液处理步骤同l，获得的灵芝菌丝体胞内多糖，称量。发现复合酶添加量设置为2.0%以后，再增加复合酶添加量，酶解浸提获得的灵芝菌菌丝体胞内多糖变化不大，故确定复合酶添加量为2. 0%。
4)确定本菌丝体干粉的最佳提取工艺组合
通过超声波-复合酶解法提取多糖。在料液比为l: 30，加酶量2.0%的条件下，以超声波功率(因素A)、酶解时间(因素B)、酶解温度(因素C)、酶解pH值(因素C)为分析对象，进行4因素3水平正交实验，正交因素水平表如下影响因素水平l水平2水平3
超声波功率(A)100W200W300W
酶解时间(B)50min70min90min
酶解温度(Q35 °C45 °C55 °C
酶解pH值(D)5.06.07.0
在各个正交组合条件下的超声波-复合酶解法操作后，酶解时间95"C加热灭 酶5min， 8(TC热水继续浸提60niin，过滤后滤液处理步骤同l，获得的灵芝菌菌丝 体胞内多糖，称量。
试验结果表明，在A必C3Di的工艺组合条件下，菌丝体胞内多糖提取率最高， 即当料液比为l: 30，加酶量2.0%条件下，超声波功率为200W ，酶解时间50min， 酶解温度55X:，酶解pH值5.0时，菌丝体胞内多糖提取率最高。
实施例2、
灵芝菌赤芝38号菌株(浙江省林业科学研究院提供)菌丝体深层发酵所得 的菌丝体干粉多糖提取工艺组合，其组成是料液比按质量比为l: 40，加酶量3.0% 条件下，超声波功率为150W ，酶解时间40min，酶解温度45。C，酶解pH值7.0。
所述的提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺的确定方法为
1) 选用灵芝菌赤芝38号菌株(浙江省林业科学研究院提供)菌丝体深层发 酵所得的菌丝体干粉
2) 确定料液比
通过热水浸提法提取多糖。选取步骤l)的菌丝体干粉100g，以加水倍数为 分析因素，设置20、 30、 40、 50、 60倍(质量倍数)，加热至90。C维持3小时，过滤。将滤液在旋转蒸发器浓縮至100ml，冷却至常温。力n400ml的95y。乙醇于浓 縮液中，同时用玻璃棒搅拌10分钟，将混合液1000rmp离心2分钟，去除上清液， 得菌丝体多糖沉淀，真空干燥至恒重后称量。发现加入40倍重量(4000g)的水 后，再增加水的倍数提取获得的多糖量增加量不大，故确定料液比为l: 40。 3)确定复合酶的添加量
通过复合酶解法提取多糖。以复合酶制剂添加量为实验因素，在料液比为l: 40，温度45。C， p朋.5，酶解时间80min的条件下，复合酶添加量设置为O. 5%、 1.0%、 1,5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5% (相对菌丝体干粉的质量百分比)，酶 解时间80min后，95匸加热灭酶5min， 8CTC热水继续浸提60min，过滤后滤液处理 步骤同l，获得的灵芝菌丝体胞内多糖，称量。发现复合酶添加量为3.0%的条件 下，再增加酶的添加量酶解浸提获得的灵芝菌菌丝体胞内多糖变化不大，故确 定复合酶合理添加量为3. 0%。
4)确定本菌丝体干粉的最佳提取工艺组合
通过超声波-复合酶解法提取多糖。在料液比为l: 40，加酶量3.0%的条件下， 以超声波功率(因素A)、酶解时间(因素B)、酶解温度(因素C)、酶解pH值 (因素C)为分析对象，进行4因素3水平正交实验，正交因素水平表如下
影响因素
水平l 水平2 水平3
超声波功率(A) 酶解时间(B) 酶解温度CC)
100W 150W 250W
50min 70min 90min
35 。C 45 °C 55 °C
酶解pH值(D)
5.0 6.0 7.0
在各个正交组合条件下的超声波-复合酶解法操作后，酶解时间95'C加热灭酶5min， 80。C热水继续浸提60min,过滤后滤液处理步骤同l，获得的灵芝菌菌丝
体胞内多糖，称量。
试验结果表明，在A2BiC2D3的工艺组合条件下，菌丝体胞内多糖提取率最高， 即当料液比为l: 40，加酶量3.0%条件下，超声波功率为150W ，酶解时间40min， 酶解温度45。C，酶解pH值7.0时，菌丝体胞内多糖提取率最高。
权利要求
1、一种提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺组合，其特征在于各组分为液比按质量比为1∶10-1∶60，复合酶加入量在原料质量的0.5％-5.0％之间，超声波功率范围值为100W-500W之间，酶解时间范围值为40min-100min之间，酶解温度范围值为30℃-60℃之间，酶解pH值范围值为4.0-8.0之间。
2、 一种按照权利要求l所述的提取灵芝菌丝体胞内多糖的工艺和方法，其特 征在于1) 选取优质的菌丝体深层发酵所得的菌丝体干粉2) 确定料液比将步骤1)选定的菌丝体干粉充分溶入水中，灵芝菌丝体合理料液比在1: 10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之间，在该料液比条件下，进行热水浸提多糖 实验，控制浸提温度为50 95 °C、浸提pH值4. 0 7. 5、浸提时间40min 120min范围内，浸提液蒸发浓縮5 15倍后，加入4倍体积的95%乙醇沉淀， 2000rmp离心后去除上清液，真空干燥至恒重，称量，通过比较，确定热水 浸提获得的灵芝菌丝体胞内多糖提取率最高的料液比，就是本品种的最佳 料液比；3)确定复合酶的添加量根据上面步骤2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的复合 酶量，范围在浸提液原料质量的0.5%—5.0%之间，在合适的酶解条件下， 进行单因素实验，确定最适的复合酶的添加量，在该复合酶的添加量条件 下，控制浸提温度为40 65 °C、浸提pH值4. 0 6. 5、浸提时间40 min 80 min范围内，浸提液蒸发浓缩5 15倍后，加入4倍体积的95%乙醇沉淀，2000rmp离心后去除上清液，真空干燥至恒重，称量，通过比较，确定灵芝 菌丝体胞内多糖提取率最高的复合酶的添加量，既为本品种的最佳复合酶 的添加量；4)确定超声波-复合酶解法提取本菌丝体干粉多糖的最佳提取工艺组合 在超声波辅助作用下进行灵芝发酵菌丝体多糖的复合酶解提取，在步骤2) 和3)的料液比和复合酶添加量的条件下，以超声波功率(因素A)、酶解 时间(因素B)、酶解温度(因素C)、酶解pH值(因素C)为分析对象，进 行4因素3水平正交实验，获得最佳提取工艺组合，根据前期实验结果，因素 A的实验范围值为IOO W - 500 W之间，因素B的实验范围值为40 min - 100 min 之间，因素C的实验范围值为3(TC-60 "C之间，因素D的实验范围值为4. 0-8.0 之间，在该提取组合工艺条件下，进行菌丝体多糖提取，浸提液蒸发浓縮5 15倍后，加入4倍体积的95。/。乙醇沉淀，2000rmp离心后去除上清液，真空干 燥至恒重，称量，通过比较，确定灵芝菌丝体胞内多糖提取率最高的工艺组 合，既为本菌丝体干粉的最佳提取工艺组合。
全文摘要
一种提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺组合，料液比按质量比为1∶10-1∶60，复合酶加入量在原料质量的0.5％-5.0％之间，超声波功率范围值为100W-500W之间，酶解时间范围值为40min-100min之间，酶解温度范围值为30℃-60℃之间，酶解pH值范围值为4.0-8.0之间。所述的提取灵芝菌丝体胞内多糖工艺和方法为选取优质的菌丝体深层发酵所得的菌丝体干粉；确定料液比；确定复合酶的添加量；确定超声波-复合酶解法提取本菌丝体干粉多糖的最佳提取工艺组合。
文档编号A61P3/06GK101560260SQ200910007918
公开日2009年10月21日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者李卫旗 申请人:浙江大学