专利名称：：一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及来源于细菌的医药配制品，特别是来源于一株兼性厌氧海洋反硝化细菌培养物的活性提取物及其制法。
背景技术：
：海洋微生物来源的新药开发是二十一世纪世界范围的研究热点问题，以其新菌种来源、产生新结构活性物质、克服传统抗生素耐药性以及实现资源可持续等特点而为人们所普遍关注。目前己经从各类海洋微生物中分离到许多结构新颖的抗细菌抗生素、抗真菌抗生素、抗病毒抗生素、抗肿瘤抗生素以及一些抗炎症和镇痛的活性物质、酶抑制剂等。但目前新型生命活性物质的研发对象主要集中于易于研究的海洋好氧微生物，有大量报道从海洋好氧微生物中分离到新的药理活性成分。由于海水的物理阻隔作用，中下层海水中存在大量的兼性厌氧细菌和严格厌氧细菌，至今稀见有从这些类型细菌中分离到活性成分的报道。海水中的反硝化细菌属于兼性厌氧的细菌类群，这类微生物在好氧培养条件下进行有氧呼吸，在缺氧培养条件下进行硝酸盐呼吸，在其硝酸盐呼吸代谢途径中产生了许多不同于有氧呼吸的次级代谢产物，但迄今尚未见有报道从海洋反硝化细菌类群在缺氧培养物中分离提取到具有药理活性的组分。
发明内容本发明的目的在于提供一种反硝化细菌海洋菌株培养液的活性提取物。本发明的另一个目的是提供了该活性提取物的分离方法。本发明进一步的目的是提供了该活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。本发明涉及的一株兼性厌氧海洋细菌DN7是从中国渤海海域的海洋底泥中分离获得。该菌株合适的生长盐浓度范围为2.0%~5.0%;对铜绿假单胞菌和禾古草芽抱杆菌有抗性。依据《Bergy，smanualofsystematicalbacteriology》(vol.1.TheWilliamsandwilkinsCo.Baltimore.1984)，经鉴定为施氏假单胞菌尸化i^/omw2osWwweW，已于2008年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCCNo.2732。海洋菌株DN7具有下述性质革兰染色为阴性菌。短杆状，宽0.3pm0.5^im，长1.0^im1.5^im，无鞭毛。在有氧培养条件下进行氧呼吸，菌落为褐色，表面光滑，较粘稠，边缘规则；在缺氧培养条件下进行硝酸盐呼吸，产气，每一菌落将包围的营养琼脂胀裂，液体培养基中则产生连续而均匀的细小气泡。最佳生长温度范围3537。C，最佳生长pH为7.27.4。对有机碳源的利用情况如下在(1)乙酸盐，(2)酒石酸钾钠，(3)淀粉等条件下生长良好。海洋菌株DN7在缺氧培养条件下可产生抗菌活性物质，而在有氧培养条件下则检测不到抗菌活性物质的产生。海洋菌株DN7的16SrDNA序列(1451bp)己向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为EU873348。其全序列如下ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAAGAGCCACGGAGTGATTCATGACTGGG这种海洋菌株DN7可以利用常规的液体培养方式，可使培养基中含有用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。对光照、时间等培养条件并无严格的限制，以适宜于海洋菌株DN7生长为准，并以选择使培养物的活性提取物的收率最高的条件为好。当然这些培养基的组分、氢离子的浓度、培养温度、搅拌条件等均应根据所使用的菌株种类及外部条件等进行适当的调节，并获得最好的效果。由以上所得的培养物出发，通过一些适当的方法就能提取其中的活性组分，这些方法是常用于提取代谢物的方法，例如可利用活性提取物与其它杂质在溶解度、离子结合力、吸附亲和力及分子量等方面的差别进行提取，这些方法可以单独使用，也可以适当配合或反复使用。其中，以如下培养基、培养方法和提取方法来培养海洋菌株DN7产生抗生素最佳液体培养基为乙酸钠20.0g;認032.0g;K2HP040.5g;MgS040.2g;NaCl25.0g;MgS047H203.0g;CaCl22H200.05g;蒸馏水1000ml;用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2±0.2。本发明的液体培养基还可以用如下配方为酒石酸钾钠20.0g;KN032.0g;K2HP040.5g;MgS040.2g;人工海水(或陈海水)1000ml;用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.27.5。人工海水配方NaCl25.0g;Na2S04KC10.7g;NaHC030.20g;KBr0.10g;H3B03O.(Bg;NaF0.003g;1.0mol/LMgCl2溶液53mL;1.0mol/1CaCl2溶液10mL;0.1mol/LSr02溶液0.90ml;蒸馏水1000ml用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.27.5。A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中12rC、0.105Mpa灭菌20min;冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中3537"C下培养。培养时间为10~15天；B.扩大培养按体积比510%的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35~37"C下培养。培养时间为1520天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于5(TC减压浓縮至原体积的十分之一，浓縮液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次(即乙酸乙酯提取时分出乙酸乙酯提取液，剩余物用正丁醇提取)，7将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于50。C减压蒸干，得一份干固体；D.提纯将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲烷甲醇三乙胺=3:1:0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用Cw反相柱，用体积浓度为5~100%的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100%甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组zvw、vfr—hm瑜m仏扭兹厶v、/pBnr黄工伯twt/八r^ra析古力口、jvyu"兀Y仪ra/!M:符然/)c'i人v9V上^i，口d形j木。本发明中从海洋菌株DN7中提取得到的活性提取物，通过抗菌模型筛选，采用琼脂稀释法(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.2000.Approvedstandard:M2A7，7thed.NCCLS，Wayne,Pa.)测定对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的正丁醇提取相具有抗菌活性制备出的活性组分抗铜绿假单胞菌的MIC值为0.64ng/mL，抗枯草芽孢杆菌的MIC值为1.28|ag/mL。利用本发明的活性提取物中的有效组分，可以用于制备抗菌的药物。以下用实施例对本发明作进一步说明。具体实施例方式实施例l.液体培养基为用浓度为O.lmol/L的氢氧化钠调节pH为7.2±0.2。A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中121'C、0.105Mpa灭菌20min;冷乙酸钠20.0g;2,0g;0.5g;0.2g;25.0g;3.0g;0.05g;KN03K2HPQMgS04NaClMgS047H20CaCl22H20蒸馏水1000ml;却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中3537"C下培养。培养时间为10~15天；B.扩大培养按体积比5~10%的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中3537'C下培养。培养时间为1520天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于5(TC减压浓縮至原体积的十分之一，浓縮液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于5(TC减压蒸干，得一份干固体；rj庐企Ttr争收"去工ra/7irzv幼1始"hn,K县m崎被在sr^烊工zv太p;开U7::t始、強曰促^t::^nr丄^cui问rf乂j刀'jyi。j/jh:^里t白T^仓;a卞，at、1卞j乂jDi^t^'n土"人f守/石板上，选用体积比为二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用C,8反相柱，用体积浓度为5100%的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用1,00%甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。实施例2.液体培养基为酒石酸钾钠20.0g認032,0gK2HP040.5gMgS040.2g人工海水(或陈海水)1000ml用浓度为0.3mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2~7.5。人工海水配方NaCl25.0gNa2S044.0gKC10.7gNaHC030.20gKBr0.10gH3B030.03g9NaF0.003g1.0mol/LMgCl2溶液53mL1.0mol/1CaCl2溶液10mL0.1mol/LSr02溶液0.90ml蒸馏水1000ml用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2~7.5。A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中12rC、0.105Mpa灭菌20min;冷土n1=古玄宋出、)^、、,关齒嫂ry\T，卄m工齒+立羊"^^U兹ite"圭tfei区^rT4宏^".i|々rfn、)垂ifer盟"h乂口J女l卞74f"Y卞四'PFd丄、/，7Trn乂Li四+口开巫TrYra，"Wi皿wc尔'i、A6i、；dT皿iR力a且于恒温培养箱中3537'C下培养。培养时间为1015天；B.扩大培养按体积比5~10%的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35~37"C下培养。培养时间为1520天；C.提取将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于5(TC减压浓縮至原体积的十分之一，浓縮液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于5(TC减压蒸干，得一份干固体；D.提纯将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点。再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱。洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用ds反相柱，用体积浓度为5100%的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100%甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。实施例3.活性组分活性测定结果采用琼月旨稀释》去(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards.2000.Approvedstandard:M2A7，7thed.NCCLS，Wayne,Pa.)测定对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的MIC值，证实其培养液的乙酸乙酯提取相具有抗菌活性制备出的活性组分抗铜绿假单胞菌的MIC值分别为0.64pg/mL,抗枯草芽孢杆菌的MIC值为1.28吗/mL。序列表SEQUENCELISTING〈110〉大连交通大学〈120〉一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途<160>1<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1451〈213〉海洋菌株DN7的16SrDNA序列〈400〉1acgctggcggcaggcctaacacatgc犯gtcgagcggatgaagagagcttgctctttgat60tcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtsgtgggggacaacgtttc,120gEm3gg認gctaataccgcatacgtcctacggg卿卿caggggaccttcgggccttg180cgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgsggt33tggCtcaccaaggct240acgatccgta3ctggtctgag鄉atgatcagtcacactgg已actgagacacggtccaga300ctcctacggg已ggcagcagtggggaatattggscaatgggcgaaagcctgatccagccat360gccgcgtgtgtga卿aggtcttcggattgtaaagcqctttaagttgggaggaagggcat420taacctaatacgttagtgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaacttcgtgc■cagcagccgcggtaatacgaagggtgc朋gcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgc540gcgtaggtggtttgttaagttgaatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatcc600aaaactggcaagctagagtatggc卿gggtggtggaatttcctgtgtagcggtg^atg660gga3ggaacaccagtggcgaaggcgaccacctgggctaatactgacactg720gcgtggggagt已gataccctggtagtccax;gccgtaaacg780atgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcatt已agtcga840ccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaa■gcggtggagcatgtggtttaattcga已gca已cgcgaag33ccttaccaggccttgacatg960cagagaactttCCagELg已tggattggtgccttcgggaactctgacacaggtgctgcatgg1020ctgtcgtcagctcgtgtcgtg卿tgttgggttaagtcccgt犯cgagcgcaacccttgt1080ccttagttaccagcacgtta郷tgggcactct^ggagactgccggtgacaaaccggag114011<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌DN7CGMCCNo.2732培养液的活性提取物。2.根据权利要求1所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物，其特征在于为缺氧培养条件下培养物的正丁醇提取物，对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗性。3.根据权利要求1或2所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于包括下列步骤'A.种子培养将液体培养基灌装到血清瓶中，瓶中留2cm高的空隙，血清瓶盖微旋紧以利透气，于高压消毒器中12rC、0.105Mpa灭菌20min;冷却后接种海洋菌株DN7，并用无菌培养基补满，瓶盖旋紧不透气；将血清瓶置于恒温培养箱中3537。C下培养，培养时间为1015天；B.扩大培养按体积比510%的种子培养液接种，利用密封培养容器，采取类同种子培养的过程大量培养海洋菌株DN7菌液，于恒温培养箱中35~37"C下培养。培养时间为1520天；所述种子培养和扩大培养中，液体培养基组成为乙酸钠雄g認032.0gK2HP040.5gMgS040.2gNaCl25.0gMgS047H203.0gCaCl22H200.05g蒸馏水1000ml用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节使其pH为7.2±0.2;C.提取将完成扩大培养过程的菌液用旋转蒸发仪于5(TC减压浓縮至原体积的十分之一，浓縮液过滤，滤液依次分别用等体积的乙酸乙酯、正丁醇连续抽提3次，将正丁醇提取液用旋转蒸发仪于5(TC减压蒸干，得一份干固体;D.提纯将上述干固体分别滴加少量甲醇溶解，点样于分析型硅胶薄层板上，选用体积比为二氯甲垸甲醇三乙胺=3:1:0.02的展开剂展开，采用薄层层析生物自显影活性测试法和纸片法追踪活性斑点；再将样品分别点样于制备型硅胶薄层板，用上述展开剂展开，将活性条带刮下，用甲醇洗脱；洗脱相蒸干后通过HPLC进一步纯化，使用ds反相柱，用体积浓度为5100%的甲醇水作为流动相，进行30分钟梯度洗脱，再用100%甲醇洗脱20分钟，检测254nm紫外吸收，通过逐步活性追踪，制备出活性峰组分，将含活性组分的洗脱液用旋转蒸发仪减压蒸干，得两份白色粉末。4.根据权利要求3所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于所述种子培养和扩大培养中，液体培养基组成为酒石酸钾钠20.0gKN032.0gK2HP040.5gMgS040.2g人工海水或陈海水1000ml用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.27.5;所述人工海水组成为NaCl25.0gNa2S044,0gKC10.7gNaHC030.20gKBr0.10gH3B030.03gNaF0.003g1.0mol/LMgCl2溶液53mL1.0mol/lCaCl2溶液10mL0.1mol/LSrO溶液0.90ml蒸馏水1000ml用浓度为0.10.5mol/L的氢氧化钠调节pH为7.2~7.5。5.根据权利要求4所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物的制备方法，其特征在于所述人工海水用陈海水代替。6.权利要求1或2所述的海洋菌株DN7培养液的活性提取物在制备抗细菌药物中的应用。全文摘要一株兼性厌氧海洋施氏假单胞菌的活性提取物及其制法和用途，从中国渤海分离获得的海洋菌株DN7，鉴定为施氏假单胞菌Pseudomonasstuszeri。DN7缺氧条件下扩大培养后的培养液，其正丁醇提取相经硅胶薄层层析和反相高效液相色谱分离，得到两个有效部分的白色粉末，对铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌有抗菌活性，具有作为抗菌药物的潜在用途。文档编号A61P31/04GK101496820SQ200910010499公开日2009年8月5日申请日期2009年2月26日优先权日2009年2月26日发明者付步飞,翼张,军穆,董学伟,顾晓洁申请人:大连交通大学