专利名称：：树莓叶提取物及其在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药，具体地说是一种树莓叶水或醇水提物及该提取物用于抗凝血和抗血栓的新医药用途。
背景技术：
：血栓是血流在心血管系统血管内面剥落处或修补处的表面所形成的小块。在可变的流体依赖型(variableflowdependentpatterns)中，血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成.血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统(纤维蛋白溶解系统)。凝血系统和纤维蛋白溶解系统的动态平衡，即保证了血液有潜在的可凝固性又始终保证了血液的流体状态。然而，有时在某些能促进凝血过程的因素作用下，打破了上述动态平衡，触发了凝血过程，血液便可在心血管腔内凝固，形成血栓。血栓发病率高，危害更甚。资料统计，因血栓栓塞性疾病导致的死亡已占到全球总死亡人数的51%，远远超过肿瘤传染疾病、呼吸系统疾病等造成的死亡。每年，我国以血栓栓塞为主要表现的脑卒中和心肌梗塞所导致的死亡人数为260万，平均每12秒就死亡1人。血栓病是严重危害人类健康的疾病之一，也是世界各国医药学家研究的热点。从天然产物中寻找新的活性成分，并进而研制新的药物也是当今攻克临床顽疾的重要途径，本发明应用最新科技手段，结合现代分离鉴定方法，通过对树莓叶进行系统的化学成分及其活性研究以期为寻找新的抗血栓病的药物提供科学依据。红树莓于中药学中又称之为覆盆子，覆盆子具有补肾固精、助阳缩尿的功效，用于肾虚遗精、滑精、阳痿、遗尿、尿频等证，为常用温肾助阳中药。还可用于食疗和保健。药理实验证明，覆盆子具有抗诱变，改善学习记忆能力，延缓衰老，增强免疫的作用(谢一辉等，覆盆子化学成分的研究，中药材2005，Vol.21(2)99-100)。目前国内、外对覆盆子果实的报道、研究较多，而对其叶的研究较少。本发明开发了对覆盆子叶化学成分进行研究。此外，覆盆子主治肾虚遗精、滑精、阳痿、遗尿、尿频等证。目前国内、外在其对凝血系统及血栓模型的作用研究未见报道。
发明内容为了满足临床需要，解决上述问题，本发明的目的是提供一种树莓叶提取物及其在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用；树莓叶提取物可作为活性成份用于制备抗凝血和抗血栓作用的药物中，即可用于预防和/或治疗冠心病、心绞痛、脑血栓或肺栓塞等疾病的药物中。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为树莓叶提取物，其为树莓叶的水或醇水的提取物。所述树莓叶的水或醇水的提取物具体制备过程为1)将树莓叶与树莓叶体积的5-25倍的水或体积含量在1%-70%的醇水溶液混合，于60-100°C浸提或回流提取一次或一次以上，过滤收集滤液；每次浸提的提取时间通常为1-24小时；所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+10H，η为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4。2)将收集的树莓叶水或醇水提取物的滤液通过大孔吸附树脂，采用水_醇溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂中醇的体积含量从0-95%变化，收集水-醇混合溶剂中醇所占的体积百分含量在5%-95%之间的洗脱溶剂所洗脱下的洗脱物，洗脱物经减压浓缩回收溶剂；所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+10H，η为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4。3)所述洗脱物经减压浓缩回收溶剂后可采用浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥方法干燥为固体粉末，得到具有抗凝血和抗血栓活性的植物提取物。所述植物提取物用于制备预防和/或治疗为目的的抗凝血和/或抗血栓药物、抗凝血和/或抗血栓的预防性保健食品或食品添加剂。所述制备预防和/或治疗抗凝血和/或抗血栓的药物是指将权利要求1其所制成的药物剂型可为丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、颗粒剂或注射剂。所述预防和/或治疗为目的的抗凝血和/或抗血栓药物是将所述植物提取物作为活性成分与药物学上可接受的载体作为赋形剂相结合，按照常规方法制成口服给药的内用齐U型或非口服给药的注射剂；即可制备成为治疗冠心病、心绞痛、脑血栓或肺栓塞等疾病的丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、颗粒剂、注射剂等各种剂型的药物；保健食品形态可以是液体的比如像清凉饮料，乳酸饮料，调味品，作为添加剂，比如加入到面食类，果冻，冰淇淋，腌制品，火腿，点心等。本发明具有如下优点该发明工艺简单，操作方便，生产成本较低，原料来源广泛，安全、无毒副作用，可信度高，得到的树莓叶活性提取部位具有显著的抗血栓和抗凝血活性，药用效果显著。具体实施例方式1.树莓叶提取物的制备以红树莓(红树莓于中药学中又称之为覆盆子)的叶为原料，采用溶剂提取法、树脂吸附法，并结合浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥等常用干燥方法，得到树莓叶的水或醇水提取物。所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+10H，n为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4。红树莓叶水或醇水提取物通过大孔吸附树脂经水_醇混和溶剂洗脱得到不同比例水_醇混和溶剂洗脱物的过程为经过溶剂提取法得到的提取物装入径高比为1:3-1:7的大孔吸附树脂柱，经含不同比例的水-醇混合溶剂洗脱而得到的洗脱物；所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+10H，η为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4；在洗脱溶剂中，醇所占的体积百分含量在5-95%之间。树脂包括非极性大孔吸附树脂、弱极性大孔吸附树脂、极性大孔吸附树脂、强极性大孔吸附树脂。其洗脱物已在动物实验中证实具有抗凝血和抗血栓活性。1)制备例大孔吸附树脂法制备红树莓叶有效部位将红树莓叶1300克加入到8000毫升的水中，经加热回流提取，过滤除去药渣；红树莓叶滤渣再加入到8000毫升的水中加热回流提取，过滤除去药渣；红树莓叶共加热回流提取2次，每次2小时，合并两次水提液，50-90°C经减压浓缩至1200毫升即得到红树莓叶水提浓缩液。取上述红树莓叶水提浓缩液800毫升，将提取物通过非极性大孔吸附树脂HPD-100，上柱床体积为1700毫升，分别以水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇梯度洗脱，洗脱体积分别为5100毫升。洗脱物经减压回收溶剂，浓缩干燥，得到红树莓叶，水洗脱物166.23克，30%乙醇洗脱物49.7克，70%乙醇洗脱物14.84克，95%乙醇洗脱物1.28克。2)采用LC-MS方法对红树莓叶活性提取物中化学成分的鉴定固定相Thermo反相0DS柱(150X4.6mm,5um)流动相0-15min，甲醇-水2575(vv)；15_40min，甲醇-水2872(vv)；40-50min,甲醇-水3070(vv)；50_60min，甲醇-水3565(vv)；60_70min，甲醇-水4060(vv)；70-80min,甲醇-水4555(vv)；80_90min，甲醇-水5050(vv)。波长:256nm；进样量5u1；流速0.5ml/min；柱温:40°C；离子源:ESI；经鉴定，红树莓叶活性提取物主要色谱峰为椴树苷(Tiliroside)，12，18-二烯-28-葡萄糖苷-2a，30，23-三羟基乌苏里酸，12-烯-28-葡萄糖苷-2a，30，19a-三羟基-23-甲基乌苏里酸，2，7_二乙基氧雄甾烯，12-烯-28-葡萄糖苷-2a，30，19a-三羟基乌苏里酸，11，13-二烯-28-葡萄糖苷-2a，3a，19a-三羟基齐墩果酸。以上6个化合物即可能为具有抗凝血和/或抗血栓的药物活性组份。2.红树莓叶抗凝血和抗血栓的医药活性将红树莓叶100g经水回流提取，提取物经非极性吸附大孔树脂，用不同比例的水及醇的混合溶剂洗脱，得到不同比例的水_醇混合溶剂洗脱部位，将其洗脱部位进行血浆复钙凝血时间测定的实验。将红树莓叶100克加入到1000毫升的水中，经加热回流提取，过滤除去药渣；红树莓叶滤渣再加入到1500毫升的水中加热回流提取，过滤除去药渣；红树莓叶共加热回流提取2次，每次1小时，合并两次水提液，70°C经减压浓缩至500毫升即得到红树莓叶水提浓缩液。取上述红树莓叶水提浓缩液30毫升通过非极性大孔吸附树脂HPD-100，上柱床体积为1700毫升，分别以水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇梯度洗脱，洗脱体积为180毫升。洗脱物经减压回收溶剂，浓缩干燥，得到红树莓叶，水洗脱物5.181克，30%乙醇洗脱物1.68克，70%乙醇洗脱物0.3731克，95%乙醇洗脱物0.0315克。将红树莓叶3095%(V/V)乙醇浓度的洗脱部位的红树莓叶的水提取物进行以下实验；2.1体外活性实验对血浆复钙时间的影响取小鼠三十只，随机分为三组，每组10只，生理盐水组，给药组和丹参组。每只眼眶取血1ml，加入放有3.8%枸橼酸钠0.lml的离心管内，混勻后以lOOOr/mirT1离心lOmin。取内径8mm试管10支，分别加入混合血浆(血液放入含有3.8%枸橼酸钠的离心管内，离心)和NS(生理盐水)各0.1ml，随即放入37°C水浴中温浴lmin，加入2.775g.L-1的CaCl2溶液0.1ml，混勻，仍放入37°C水浴中，同时开始用秒表计时，直到用竹签检测到纤维蛋白丝时停止计时。重复10次，计算10次平均值，即为对照组血浆复钙时间。将NS换成待测溶液，按相同方法求出待测组血浆复钙时间。结果见表1。表1红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位对血浆复钙时间的影响(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与对照组相比*P<0.05结论通过体外活性测试结果表明红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位能够显著延长血浆复钙时间，体外抗凝血作用良好，可能用于治疗以凝血为病机的多种疾病。2.2体内活性实验对ADP诱发小鼠急性肺栓塞的影响雄性昆明种小鼠40只，体重18-22克，按体重均衡随机分为四组，每组10只。ADP为中国医药(集团)上海化学试剂公司产品。给药组分别灌胃红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位低剂量(26.8mg/kg)和红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位高剂量(53.6mg/kg)，阳性对照组灌胃丹参粗提物(相当于生药量的1.418g/kg)，阴性对照组灌胃相同容积的生理盐水(NS)，每日1次，连续4d。末次给药lh后，分别尾静脉注射ADP生理盐水溶液200mg/kg，小鼠随即发生呼吸喘促，不能活动。记录注射诱导剂后至小鼠恢复自主活动的时间，结果见表2。红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位高低剂量组和丹参组均能显著缩短ADP诱导的血小板聚集肺栓塞所引起的呼吸喘促持续时间。表2红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位对ADP诱发小鼠急性肺栓塞形成的影响(n=10)组别对照组红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位低剂量红树莓叶30~95%醇浓度的洗脱部位高剂量_丹参与对照组相比*P<0.05结论红树莓叶3095%醇浓度的洗脱部位低剂量使用可使ADP诱发小鼠呼吸喘促时间明显缩短，活性强于阳性对照药丹参组，说明其对急性肺栓塞具有一定的治疗作用。2.3实验结果分析本发明红树莓叶具有抗凝血及抗血栓作用。红树莓叶提取物在体外可延长凝血时间。采用ADP形成血栓的方法，组织学上类似于人体的肺栓塞。目前认为ADP主要是通过和血小板表面的P2Y1受体结合，促进Ca2+内流，引起血小板聚集而形成血栓。而实验表明，6剂量(相当于生药量)ADP致呼吸喘促时间(x士s)(min)(mg/kg.d)1.418g/kg(min)，3.30±0.41*3.10±0.252.836g/kg1.418g/kg1.97±0.45*2.11±0.45氺红树莓叶可以延长血栓形成时间，从而起到抗血栓的药理作用。血栓形成主要包括三个阶段(1)血小板粘附和聚集(2)血液凝固(3)纤维蛋白的溶解。红树莓叶能抑制血小板的粘附与聚集，并能降低血液粘度，后者也直接影响到血栓形成的第一阶段。血小板的减少将延长血凝时间，从而也影响到血栓的形成。权利要求树莓叶提取物，其特征在于其为树莓叶的水或醇水的提取物。2.根据权利要求1所述树莓叶提取物，其特征在于所述树莓叶的水或醇水的提取物具体制备过程为，将树莓叶与树莓叶体积的5-25倍的水或体积含量在-70%的醇水溶液混合，于60-100°C浸提或回流提取一次或一次以上，过滤收集滤液，得具有抗凝血和抗血栓活性的的植物提取物。3.根据权利要求2所述树莓叶提取物，其特征在于每次浸提或回流提取的时间为1-24小时；所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+1OH，η为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4。4.根据权利要求2所述树莓叶提取物，其特征在于将收集的树莓叶水或醇水提取物的滤液通过大孔吸附树脂，采用水-醇溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂中醇的体积含量从0-95%变化，收集水-醇混合溶剂中醇所占的体积百分含量在5%-95%之间的洗脱溶剂所洗脱下的洗脱物，洗脱物经减压浓缩回收溶剂，得到具有抗凝血和抗血栓活性的植物提取物。5.根据权利要求4所述树莓叶提取物，其特征在于所述洗脱物经减压浓缩回收溶剂后可采用浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥方法干燥为固体粉末，得到具有抗凝血和抗血栓活性的植物提取物。6.树莓叶提取物在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其特征在于所述树莓叶提取物用于制备预防和/或治疗为目的的抗凝血和/或抗血栓药物、抗凝血和/或抗血栓的预防性保健食品或食品添加剂；所述树莓叶提取物为权利要求1所述树莓叶的水或醇水提取物。7.按照权利要求6所述树莓叶提取物在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其特征在于所述树莓叶的水或醇水的提取物具体制备过程为，将树莓叶与树莓叶体积的5-25倍的水或体积含量在-70%的醇水溶液混合，于60-100°C浸提或回流提取一次或一次以上，过滤收集滤液，得具有抗凝血和抗血栓活性的的植物提取物。8.按照权利要求7所述树莓叶提取物在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其特征在于每次浸提或回流提取的时间为1-24小时；所述醇为具有以下通式的饱合一元醇CnH2n+10H,η为1、2、3或4，或不饱合一元醇CnH2lriOH,η为2、3或4。9.按照权利要求7所述树莓叶提取物在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其特征在于将收集的树莓叶水或醇水提取物的滤液通过大孔吸附树脂，采用水_醇溶剂进行梯度洗脱，洗脱溶剂中醇的体积含量从0-95%变化，收集水-醇混合溶剂中醇所占的体积百分含量在5%-95%之间的洗脱溶剂所洗脱下的洗脱物，洗脱物经减压浓缩回收溶剂，洗脱物经减压浓缩回收溶剂后可采用浓缩干燥、冷冻干燥或喷雾干燥方法干燥为固体粉末，得到具有抗凝血和抗血栓活性的植物提取物。10.按照权利要求6所述树莓叶提取物在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其特征在于所述制备预防和/或治疗为目的的抗凝血和/或抗血栓药物是指将权利要求1所述树莓叶提取物作为活性成分与药物学上可接受的载体作为赋形剂相结合，其所制成的药物剂型可为丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、颗粒剂或注射剂。全文摘要本发明涉及生物医药，具体地说是树莓叶提取物及其在制备抗凝血和抗血栓药物中的应用，其为树莓叶的水的提取物，得到的树莓叶活性提取部位具有抗血栓和抗凝血活性。该发明生产工艺简单，操作方便，生产成本较低。文档编号A61K127/00GK101822731SQ200910010568公开日2010年9月8日申请日期2009年3月4日优先权日2009年3月4日发明者冯松元申请人:冯松元