专利名称：一种卡拉八糖的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
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本发明涉及生物化学、微生物和酶工程领域，具体涉及利用卡拉胶降解酶生产聚合度为 3-6的卡拉胶寡糖的方法，尤其涉及利用卡拉胶酶生产聚合度为4的卡拉八糖的方法，该方法 制备的卡拉八糖具有具有抑制肿瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治疗糖尿病的作用。
背景技术：
卡拉胶是一种来源于海洋红藻的以1，3-P -D半乳糖和1,4-a -D半乳糖交替连接形成骨架 的硫酸半乳聚糖，由于卡拉胶带有大量的硫酸根，表现出很多生理活性，例如抗病毒作用、 抗溃疡、抗凝和抗血栓作用等。但是由于卡拉胶属于高分子化合物，粘度大，扩散困难，很 难吸收，且有一定的毒性，因此严重限制了卡拉胶在生物医药领域的应用。因而通过制备卡 拉寡糖，降低分子量，提高产品的稳定性和安全性，增强其生物活性和溶解性，可作为开发 海洋功能食品、海洋新药的重要资源，增加产品的技术含量和附加值，对促进海藻化学工业 的蓬勃发展、海洋经济发展、提高海洋生物产业技术水平具有重要意义。
但目前卡拉胶的降解有化学法和酶法两种，其中化学法降解产物不均一，工艺难以控制， 因此难以产业化；酶法降解虽然专一性较强，反应条件温和，工艺易于控制，产业化前景好， 但是目前酶解产物多是聚合度较低的卡拉二糖和卡拉四糖，而且由于酶活性较低，产物得率 低。
发明内容
本发明的目的是提出一种降解专一性较强、反应条件温和、工艺易于控制、产业化前 景好，产物得率高的一种卡拉八糖的酶法制备方法。
本发明的原理是利用卡拉胶降解酶为工具，该酶可专一性作用于卡拉胶的1,a-3,(3糖苷 键，降解卡拉胶获得产物均一的卡拉寡糖，主要为卡拉八糖，分离后得到卡拉八糖纯品。
本发明的技术方案是 一种卡拉八糖，其分子结构式如下其中n代表卡拉胶寡糖的聚合度，n=4，分子量为1642。 上述卡拉八糖的制备方法，具体步骤如下
(1) 培养微生物N52 24小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；
(2) 将粗酶按照粗酶蒸馏水=1:10 50的体积比稀释，调pH为6. 0-7. 0，制备酶解工
作液；
(3) 按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例向酶解工作液中加入卡拉胶，然 后在35'C下进行酶解，酶解效果与酶解时间相关，时间越长酶解效果越好，酶解半小时后体 系中就出现卡拉八糖的产物，酶解24小时后，卡拉胶完全被降解为卡拉八糖。酶解过程中可 以通过控制酶解时间获得不同分子量的产物；
(4) 酶解完成后，用95%的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95%以上的产物是卡拉八 糖；或者7(TC减压浓縮后，将浓縮液冷冻，然后冷冻干燥，收集粗品，粗品中95%以上的产物 是卡拉八糖；
(5) 对步骤(4)收集的沉淀物或粗品进行分离纯化，获得卡拉八糖纯品。 本发明制备的卡拉八糖具有抑制肿瘤血管生成、抗菌、抗氧化和降血糖的作用。 本发明的有益效果是卡拉胶降解酶活性较高，专一作用于卡拉胶的l,a-3,p糖苷键，生
成产物均一，制备方法简单易行、可产业化；该制备方法获得的卡拉八糖具有非常广阔的医
药领域应用前景。
图1是卡拉胶降解酶降解卡拉胶的情况示意图中A、 B、 C、 D、 E分别代表卡拉胶酶作用于卡拉胶24、 12、 6、 3、 0. 5小时的薄层 结果，l代表卡拉八糖的薄层结果。图2是卡拉八糖抑制肿瘤细胞培养液诱导血管内皮细胞迁移的结果。
图中A:没有肿瘤细胞培养液诱导；B:存在肿瘤细胞培养液的诱导作用；C:卡拉八 糖抑制肿瘤细胞培养液的诱导作用。
图3是卡拉八糖抑制肿瘤血管生成的结果。
图中A:阴性对照；B:阴性对照小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，箭头所示为毛细血 管；C:经卡拉胶八糖(200mg/Kg)干预后，小鼠肿瘤表面情况；D:经卡拉胶八糖干预后 (200mg/Kg)，小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片。
图4是卡拉八糖对小鼠SOD活性的影响。
图5是卡拉八糖对小鼠血液MDA含量的影响。
图6是卡拉八糖对小鼠血液中GSH-Px活性的影响。
图7是卡拉八糖对小鼠血糖浓度的影响。
具体实施例方式
实施例1
卡拉八糖的制备
以海洋微生物N52分泌的卡拉胶降解酶为工具，培养微生物N52 24小时，5000转离心 去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；将粗酶按照粗酶:蒸馏水=1: 50的体积比稀释， 调pH为6. 0-7. 0，制备酶解工作液；按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例向酶 解工作液中加入卡拉胶，然后在35'C下进行酶解，降解时间为24小时，95%的乙醇沉淀降解 产物，收集后冷冻干燥，以DNS法检测分子量为1642，经薄层层析检测，降解产物均一，经 spei-dexG250分离可获得纯品，结果见图1，由图1町以看出半小时后在卡拉胶酶的作用下， 卡拉胶降解产物已经出现，主要为卡拉胶八糖，同时还有很多卡拉胶没有被降解，随着时间 的延长，卡拉胶被酶降解的程度增强，24小时后卡拉胶基本上被卡拉胶酶降解完全，产物均 一，主要是卡拉胶八糖。
实施例2:
卡拉八糖抑制肿瘤血管生成的作用以实施例1中获得卡拉八糖体外作用于血管内皮细胞，通过划痕实验发现卡拉八糖具有 抑制血管内皮细胞迁移的作用结果见图2;由图2可以看出，A:没有肿瘤细胞培养液诱导， 血管内皮细胞迁移效果较小；B:在肿瘤细胞培养液的诱导作用下，细胞迁移效果明显；C:
在肿瘤细胞培养液存在的同时，加入200ug/mL卡拉八糖，明显抑制了血管内皮细胞的迁移。 以肺癌细胞对小鼠进行荷瘤，通过给小鼠用200mg/Kg的卡拉八糖灌胃进行干预，发现卡 拉八糖具有抑制肿瘤小鼠血管生成的作用，结果见图3，由图3可以看出，A:阴性对照未用
卡拉八糖进行干预的小鼠皮下的乳腺癌肿瘤，瘤体表面长满血管；B:阴性对照未用卡拉八糖 进行干预的小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，箭头所示为毛细血管；C:经卡拉胶八糖干预后， 肿瘤表面没有血管存在；D:经卡拉胶八糖干预后，小鼠皮下乳腺癌肿瘤的组织切片，几乎看 不到血管的存在。
实施例3
卡拉八糖的抗氧化作用
以不同剂量的卡拉八糖灌胃小鼠，连续灌胃30天后，以溴化苯对小鼠造成损伤，12小时 后，处死小鼠，检测小鼠血液中丙二醛的含量、超氧化物歧化酶的活性和谷胱甘肽过氧化物 酶的活性，发现卡拉胶八糖具有降低小鼠血液中丙二醛含量、提高超氧化物歧化酶和谷胱甘 肽过氧化物酶活性的作用，表现出抗氧化的作用，结果见图4、 5、 6。由图4可以看出卡拉八 糖可以显著的提高动物血液中SOD的活性，其中卡拉八糖剂量为50mg/Kg时的作用最强，可以 将小鼠血液中S0D活性提高40yc，随着浓度的增高，这种作用逐渐降低；由图5可以看出卡拉八 糖可以显著降低小鼠血液中丙二醛的含量，表现出抗氧化的作用，其中卡拉八糖剂量为 50mg/Kg时的作用最强，相对于对照组可以使血液中丙二醛的含量降低40%;由图6可以看出卡 拉八糖可以显著提高小鼠血液中GSH-Px的活性，表现出较强的抗氧化能力，这种提高GSH-Px 活性的作用随剂量的增高而增高。
实施例4
卡拉八糖的降血糖作用通过四氧嘧啶处理小鼠，建立糖尿病小鼠模型，以实施例1制备的卡拉八糖灌胃糖尿病 小鼠14天后，通过O-TB法检测小鼠血液中的血糖含量，结果标明卡拉八糖具有降低小鼠血 糖含量的作用，结果见图7。由图7可以看出模型小鼠的血糖相对于对照未处理的空白小鼠 的血糖明显升高，血糖值达空白小鼠的160%，不同剂量卡拉八糖都可以显著降低模型小鼠的 血糖含量，表现出降血糖作用，其中卡拉八糖剂量为25mg/Kg时的作用最好，处理后小鼠血 糖值几乎恢复正常。
权利要求
1、一种卡拉八糖，其特征在于，分子结构式如下其中n代表聚合度，n＝4，分子量为1642。
2、 权利要求l所述的一种卡拉八糖的制备方法，其特征在于，该方法歩骤如下(1) 培养微生物N52 24小时，5000转离心去掉微生物，收集上清，作为粗酶液使用；(2) 将粗酶按照粗酶:蒸馏水=1:10 50的体积比稀释，调pH为6. 0-7. 0，制备酶解工作液；(3) 按照每100毫升酶解工作液加入1克卡拉胶的比例，向酶解工作液中加入卡拉胶， 然后在35'C下进行酶解，酶解效果与酶解时间相关，时间越长酶解效果越好，酶解半小时后 体系中就出现卡拉八糖的产物，酶解24小时后，卡拉胶完全被降解为卡拉八糖，酶解过程中 可以通过控制酶解时间获得不同分子量的产物；(4) 酶解完成后，用95%的乙醇沉淀，收集沉淀物，沉淀物中95%以上的产物是卡拉八 糖；或者7(TC减压浓縮后，将浓缩液冷冻，然后冷冻干燥，收集粗品，粗品中95%以上的产物 是卡拉八糖；(5) 对步骤(4)收集的沉淀物或粗品进行分离纯化，获得卡拉八糖纯品。
3、 权利要求1所述的一种卡拉八糖的应用，其特征在于，具有抑制肿瘤血管生成、抗菌、 抗氧化和降血糖的作用。
全文摘要
本发明涉及生物化学、微生物和酶工程领域，具体涉及一种卡拉八糖的制备方法及其应用。本发明是利用卡拉胶降解酶作为工具，该酶可专一性的作用于卡拉胶1，α-3，β糖苷键，降解卡拉胶获得产物均一的聚合度为4的卡拉八糖，其分子结构式如上。本发明制备的卡拉八糖具有具有抑制肿瘤血管生成、抗血栓、抗衰老和治疗糖尿病的作用。
文档编号A61P35/00GK101602811SQ20091001238
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月4日 优先权日2009年7月4日
发明者吴海歌, 姚子昂 申请人:大连大学