专利名称：人转录因子hmbox1基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人转录因子賴仿aw基因的应用，特别是HMB0X1基因过表达后对自然杀伤细 胞调控的应用，属于功能基因组学技术领域。
背景技术：
自然杀伤(NK)细胞是三大类淋巴样细胞之一，属于天然免疫系统， 一直被誉为是机体 抗癌、抗病毒的前哨，而且活化的NK细胞还可以通过分泌细胞因子等方式，来调节其他细 胞的特异性和非特异性免疫反应，因此又被称为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。NK细 胞的活化与否，以及其后续的功能活性，是由其表达的活化性受体和抑制性受体所决定，例 如最重要的NKG2家族，目前对NK细胞受体的功能研究较多，但是至今有关NK细胞受体表 达调控的机制尚未得到阐明。
HMB0X1 (homeobox containing 1)基因位于人染色体8p12. 3和8p21. l的交界处，全长 1263bp，是homeobox家族成员之一。由其经典的Horaeobox DNA结合结构域和报告基因实验初 步预测为转录抑制因子。该家族其他成员在NK细胞的发育成熟过程中起关键作用。但HMB0X1 的具体功能尚未见报道，属于新的功能未知蛋白。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种人转录因子HMB0X1基因及其编码蛋白的应用。 并以NK细胞的功能实验为基础，阐明人转录因子HMB0X1在NK细胞中的功能。由于其所在 蛋白家族的重要性，对HMB0X1具体功能的研究，不仅揭示这个新基因的功能，而且为进一 步了解NK细胞发育和功能调节过程奠定基础。
发明概述
本发明利用分子克隆方法构建HMB0X1基因真核过表达载体。通过电转方法将质粒导入 NK细胞，经G418筛选建立稳定的NK-HMB0X1过表达细胞株。应用MTT法、流式细胞术、 Real-time PCR技术，分别对NK细胞的增殖、杀伤、脱颗粒能力以及活化/抑制性受体、细 胞因子和杀伤颗粒表达水平进行检测。研究HMB0X1对NK细胞的功能调节作用。 发明详述
人转录因子HMB0X1基因在调控自然杀伤(NK)细胞功能方面的应用，通过如下步骤构 建过表达载体，并使过表达载体表达来实现
(1) HMB0X1基因cDNA克隆及过表达载体构建
提取NK-92细胞的RNA，逆转录成cDNA，扩增HMB0X1 cDNA全长1263bp，设计引物，引 物设计时根据pcDNA3. 1-myc/his (-)载体说明书，起始密码子前加K0ZAK序列增强蛋白表 达，终止密码子由TAA点突变为TGA，使后续的myc和his标签能正常表达。PCR扩增，PCR 产物凝胶回收后，连接入T载体，经测序证明序列完全正确；然后用限制性内切酶BamHI和 EcoRI将全长片段切下，凝胶回收后链接到pcDNA3.1-myc/his (-)载体上，经测序验证，即 得HMB0X1基因过表达载体pcDNA3， 1- HMB0X1，序列如SEQ ID NO. 1所示；(图1)
(2) Western blot鉴定HMB0X1表达载体在HEK293中的表达
将步骤(1 )制得HMB0X1基因过表达载体pcDNA3. 1- HMB0X1通过脂质体 Liptofectamin2000转染入HEK293细胞中，24小时后提取细胞总蛋白，并做SDS-PAGE和 Western blot，用抗标签蛋白myc抗体检测HMB0X1蛋白的表达。(图2)
上述步骤(1)中的引物序列为5， CGGCTAGCGCACCATGGCGATGCTTAGTTCCTTTCCAGTG 3， 和5' CCGAAGCTTGAGTCATCATCCAGGGCCT 3，。上述步骤(1)中的PCR扩增，反应条件如下95°C， 5分钟，l个循环；94°C， 1分钟， 60°C， l分钟，72°C， 90秒，35个循环；72°C， IO分钟，1个循环。
经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后不影响NK细胞的增殖(图4)。
经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞对耙细胞H印G2和K562的杀伤能 力显著下降，NK细胞的脱颗粒能力也明显下降(图5、 6)。
经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞表面活化受体NKG2D表达下降，并 且NKG2D和其接头蛋白DAP10的mRNA水平也有下降。但NK细胞表面表达的其他杀伤相关受 体NKG2A、 CD54、 FasL、 NKp46、 TRAIL没有明显变化(图7、 8、 9)。
经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞表达细胞因子TNF-a和IFN y的 mRNA水平下降，IFNY的蛋白水平下降显著(图10、 11)。
经检测上述表达载体在NK细胞中过表达后，NK细胞杀伤相关分子perforin、 Grazyme family (A， B, K， M， H)的mRNA水平有不同的变化，perforin和Grazyme K有显著下降。 perforin的蛋白水平也有轻微的下降(图12、 13)。
通过上述检测可以得知基因可以通过下调NK细胞表面重要的活化识别受体 NKG2D的表达，抑制NK细胞脱颗粒能力及细胞因子分泌，实现对NK细胞的杀伤功能的抑制。 因此可以用于对人类自身免疫病和肿瘤的基因诊断和基因治疗。还可以针对HMB0X1基因进 行新药设计与开发。
图1. pcDNA3. 1-HMBOXl-myc/his载体构建模式图。
图2. Western blot鉴定构建重组载体在HEK293细胞中的表达情况。
图3.将载体转入NK细胞系，经稳定筛选后，HMB0X1基因的过表达水平。
NK-3. 1表示NK细胞转染了空载体pcDNA3. 1的对照组；NK-HM表示转染表达载体 pcDNA3. 1-HMB0X1的实验组。
图4.用MTT法检测HMB0X1过表达后，NK细胞的增殖情况。
A. NK-92细胞
B. NKL细胞
图5.用MTT法检测HMB0X1过表达后，NK细胞对靶细胞H印G2和K562的杀伤能力。
A. NK-92细胞
B. NKL细胞
图6. HMB0X1过表达后，NK细胞的脱颗粒能力。
图7.流式细胞术检测HMB0X1过表达后，NKL细胞表面NKG2D受体表达情况。
A. 流式直方图。
B. 平均荧光强度(MFI)四次统计分析图。
图8.流式细胞术检测HMB0X1过表达后，NKL细胞表面其他杀伤相关受体表达情况。 图9. Real-time PCR检测HMB0X1过表达后，NKL细胞NKG2D、 DAP10 mRNA水平变化。 图10. Real-time PCR检测HMB0X1过表达后，NKL细胞抗肿瘤细胞因子TNF- a和IFN- y的 mRNA水平。
图11.流式细胞术检测HMB0X1过表达后，ML细胞活化后胞内IFN- y的蛋白水平。
图12. Real-time PCR检测HMB0X1过表达后，NKL细胞杀伤相关分子perforin、 Grazyme
family (A, B， K, M, H)的mRNA水平。
图13.流式细胞术检测HMB0X1过表达后，NKL细胞活化后胞内perforin的蛋白水平。
具体实施例方式
1、 HMB0X1基因cDNA克隆及过表达载体构建。
用invitrogen公司Trizol提取NK-92细胞的RNA，逆转录成cDNA。用TAKARA高保真Taq酶扩增HMB0X1 cDNA全长1263bp ，引物序列5， CGGCTAGCGCACCATGGCGATG CTTAGTTCCTTTCCAGTG 3'和5' CCGAAGCTTGAGTCATCATCCAGGGCCT 3'。PCR产物凝胶回收后，连接入T载体，经测序证明序列完全正确。然后用限制性内切酶 BamHI和EcoRI将全长片段切下，凝胶回收后链接到pcDNA3. 1-myc/his (-)载体上，再经测 序验证正确，HMB0X1基因过表达载体pcDNA3. 1- HMBOXl构建成功。pcDNA3. 1-HMBOXl-rayc/his 载体测序结果如图2所示。2、 Western blot鉴定HMBOXl表达载体在HEK293中的表达情况。将表达载体pcDNA3. 1- HMBOXl通过脂质体Liptofectamin2000转染入HEK293细胞中， 24小时后提取细胞总蛋白，并做SDS-PAGE和Western blot,用抗标签蛋白myc抗体检测 HMBOXl蛋白的表达情况，来验证所构建的重组载体是否能表达HMBOXl蛋白。3、 RNA提取及Real-time PCR检测基因mRNA表达水平。按试剂说明书，用invitrogen公司Trizol提取各组NK细胞的总RNA,再用invitrogen 公司M-MLV逆转录酶合成cDNA。 cDNA稀释10倍后用于下步PCR反应。Real-time PCR所用 试剂为TransStart SYBR qPCR Kit (购自TransGen公司)，反应体系20 u 1，含SYBR Green mix lOixl， cDNA2ti1， passive enhancer 0. 4u 1，上下游引物各lul， ^<6. 6pl。引物 序列见附表l。用Bio-Rad公司myiQ PCR仪检测，得到各基因的相对表达强度。如图3所 示。HMBOXl转入NK细胞中，经筛选后可稳定表达。如图10， 11， 13所示。NK细胞过表达 HMBOXl后，其活化受体NKG2D和NKG2D的接头蛋白DAP10的mRNA水平降低，细胞因子IFN-Y 、 TNF- a和杀伤相关分子Perforin、 Grazyme K的mRNA表达水平下降，Grazyme A, Grazyme B， Grazyme M， Grazyme H未有显著变化。4、 MTT法检测细胞增殖。各组NK细胞离心收集，计数，6000个细胞/孔，4复孔接入96孔细胞培养板中。37°C， 5% C02条件下培养0h、 24h、 48h、 72h。各时间点前2h加入10nl MTT(50ug/ml)/孔，继续 培养4h后，2500rpm离心25min,去净培养基，加200ul 二甲基亚砜(DMSO)溶解甲瓒颗粒， 混匀后用酶标仪检测OD570/680nm吸光值，做增殖曲线，如图4所示。由图4可以看出，HMBOXl 在NK细胞中过表达后不影响NK细胞的增殖。5、 MTT法检测NK细胞杀伤能力将靶细胞H印G2和K562接入96孔板中，10X105/孔。待H印G2贴壁后，收集各组NK细胞， 以效耙比(E:T) 10:1和5:1的比例加入耙细胞中，设只加效应细胞和只加耙细胞对照组。培 养6h后，加入20ul MTT(50ug/ml)/孔，继续培养4h，检测活细胞数量，同细胞增殖法。所 得数值按下列公式计算杀伤率(％) =[1-(ODE+T-ODE)/ODT]X100%。 ODE+T为效应细胞和靶 细胞混合的杀伤组，ODE为只加效应细胞对照组，ODT只加靶细胞对照组，如图5所示。6、 流式细胞术检测NK细胞脱颗粒能力。收集各组NK细胞和靶细胞K562细胞，二者按10:1混合，加入CD107a抗体(BD pharmagene) 20pl/ml, 37°C、 5% 0)2条件下共同培养lh，加入莫能霉素(6ug/ml)和蓝 菌素(10ug/ml)，再培养3h。收集细胞，PBS缓冲液洗涤，用CD56抗体标记NK细胞后， 用流式细胞仪检测NK细胞的CD107a分子表达情况，反应NK细胞脱颗粒能力，即杀伤能力。 如图6所示。由图5、图6可以看出，HMB0X1在NK细胞中过表达后，NK细胞对耙细胞H印G2 和K562的杀伤能力显著下降，NK细胞的脱颗粒能力也明显下降，CD107a阳性率从25W下降 至12%。7、 流式细胞术检测NK细胞表面受体及胞内分子。表面受体标记收集各组NK细胞，经PBS缓冲液洗涤两次，用100ulPBS缓冲液悬起， 分别加1 U 1流式抗体(NKG2D， NKG2A, CD54, FasL， NKp46, Trail),混匀，4。C孵育30min， PBS 缓冲液洗涤两次后，用流式细胞仪检测各个分子的表达情况。如图8、 9所示。由图8可以看出，HMB0X1在NK细胞中过表达后，NK细胞表面活化性受体NKG2D的表达下降。图9可以 看出，NK细胞表面的其他杀伤和活化相关受体NKG2A、 CD54、 FasL、 NKp46、 Trail未见明 显变化。所以HMB0X1很可能是通过影响NK细胞的活化，进而影响其对靶细胞的杀伤能力。胞内分子标记:各组NK细胞按相同浓度接12孔板,加入丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)50ng/ml 和离子霉素10y g/ml进行活化，培养lh后加入莫能霉素(6u g/ml)和蓝菌素(10n g/ml)， 再培养4h。收集细胞，PBS缓冲液洗涤两次，去净PBS缓冲液，用多聚甲醛固定液固定细胞， 4。C孵育30miri。皂素穿膜液洗涤两次，用100 u 1穿膜液悬起细胞，4。C孵育30min，加入1 ul IFN-Y或Perforin抗体，4'C孵育2h或过夜。PBS缓冲液洗涤细胞两次后，用流式细 胞仪检测胞内分子的表达情况。如图12、 14所示。由图12、图14可以看出，HMB0X1在NK 细胞中过表达后，NK细胞分泌细胞因子IFN- Y以及杀伤分子Perforin的能力明显降低。实施例中所用引物，参照现有技术设计，也可参见附表l。表l基因引物序列产物长度(bp)GAPDHforward, GAAGGTGAAGGTCGGAGT reverse, CATGGGTGGAATCATATTGGAA155HMBOX1forward, AACCCTGGCGCTACACTAAG reverse, TCCTTTCTCCAGGTAAATCGAC140NKG2Dforward, TGCATGCAAAGGACTGTGTAAAG reverse, GCAGTGTTACCGCTGGTGTAATC86DAP 10forward, TCCATCTGGGTCACATCCTCTTCC reverse, AAGAGCCTGAAGTGCCAGGGTAAAAG112歴-Yforward, CTTGGCTTTTCAGCTCTGCATC reverse, CTTCAAAATGCCTAAGAAAAGAGTTCC151TNF-aforward, ATCTTCTCGAACCCCGAGTGA reverse, CGGTTCAGCCACTGGAGCT83Perforinforward, AGTACAGCTTCAGCACTGACA reverse, ATGAAGTGGGTGCCGTAGTT175Grazyme-Aforward, TCAGGTTGATTGATGTGGGACAG reverse, GACCATGTAGGGTCTTGAATGAGGA163Grazyme-Bforward, GCGGTGGCTTCCTGATACAAG reverse, CCCCCAAGGTGACATTTATGG82Grazyme-Hforward, TGGCGGCATCCTAGTGAGAA reverse, GCCCCCAAGGTGACATTTATG81Grazyme-Kforward, ATCAACACATTTCATCTGGGCTTC reverse, AAACGTGATGTCCGCCATACTG197Grazyme-Mforward, GGACACCCGCATGTGTAACAAC reverse, GATGTCAGTGCAGACCCTGGAG1876SEQUENCE LISTING〈110〉 山东大学〈120〉人转录因子HMBOXl基因的应用〈160〉 1〈170〉 Patentln version 3.5<210〉 1〈211> 1447〈212〉 DNA〈213〉 人〈400〉 1ggagscccaa gctggctagc gttta犯cgg gccctctaga ctcgagcggc cgccactgtg GOctggatatct gcagaattcg attaagtatg cttagttcct ttccagtggt tttgctggaa 120accatgtctc attatacaga tgagcccaga tttaccatag agcagataga tctgcttcag 180cgacttcggc gtactggaat gactaaacat gaaattctcc atgccttgga aactttggac 240cgtcttgatc aagagcatag tgacaagttt ggaagaaggt ccagctatgg aggaagttca 300tatgggaata gtactaacaa tgtcccagca tcttcctcta cagctacagc 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1、一种人转录因子HMBOX1基因过表达对自然杀伤性细胞调控的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于HMB0X1基因在自然杀伤性细胞中过表达后 不影响NK细胞的增殖。
3、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于HMB0X1在自然杀伤性细胞中过表达后，自 然杀伤性细胞的杀伤能力显著下降。
4、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于HMB0X1在自然杀伤性细胞中过表达后，自 然杀伤性细胞表面活化受体NKG2D表达下降。
5、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于HMB0X1在自然杀伤性细胞中过表达后，自 然杀伤性细胞表达细胞因子IFN y的水平下降。
6、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于HMB0X1在自然杀伤性细胞中过表达后，自 然杀伤性细胞杀伤分子perforin表达下降。
7、 一种如权利要求1所述的人类转录因子HMB0X1基因通过调控自然杀伤细胞，在制备 抗肿瘤和抗自身免疫病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及人转录因子HMBOX1基因的应用，特别是HMBOX1基因过表达后对自然杀伤细胞调控的应用，属于功能基因组学技术领域。本发明利用分子克隆方法构建HMBOX1基因真核过表达载体。通过电转方法将质粒导入NK细胞，经G418筛选建立稳定的NK-HMBOX1过表达细胞株。研究HMBOX1对NK细胞的功能调节作用。由于其所在蛋白家族的重要性，对HMBOX1具体功能的研究，不仅揭示这个新基因的功能，而且为进一步了解NK细胞发育和功能调节过程奠定基础。
文档编号A61K48/00GK101555486SQ200910015259
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者吴龙妍, 建 张, 田志刚 申请人:山东大学