专利名称：：棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物
技术领域：
，涉及一种新的棘豆埃里格孢菌(^^e7^'w'a0〃tropis)，具体涉及一种能够合成疯草主要毒素苦马豆素(Swainsonine，SW)的棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc，还涉及该菌的制备及其应用。
背景技术：
：疯草(Locoweed)是豆禾斗棘豆属(Cb^/rap&)禾口黄芪属(^y/raga/zw)有毒植物的总称，也是世界范围内危害草原畜牧业最严重的一类毒草。在我国，疯草广泛分布于西北、华北和西南的广大草原，危害面积达1100万hm2，占全国草场面积的2.8%。黄花棘豆是我国西部草原上生长的主要有毒植物之一，主要危害马、牛、羊等家畜，不仅引起中毒死亡，还会导致家畜生殖功能发生障碍，影响畜种改良，是我国西部地区危害最大的毒草之一。。黄花棘豆的主要毒性成份是苦马豆素(Swainsonine，SW)，化学名称为1,2,8-三羟基八氢吲哚里西啶(trihydroxyoctahydro-indolizidine)。苦马豆素可抑制哺乳动物细胞的溶酶体a-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶II的活性，导致低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍，从而引起动物组织器官功能紊乱。动物采食黄花棘豆等后，会发生中毒，导致大批家畜死亡，给畜牧业造成巨大损失。黄花棘豆是豆科草本植物，具有丰富的营养价值，据报道，其干物质含量为87.5%，粗蛋白含量为20%，营养价值与优良牧草苜蓿相当。如果能采取相应的措施将毒草变为可利用的牧草资源，既可以保护生态环境，防止草地退化，又可促进当地畜牧业的发展，对社会、牧民、生态都有着深远的意义。近年来，在黄花棘豆的危害、有毒成分、毒理机制、防除和利用等方面的研究取得了重要进展，但迄今还没有控制黄花棘豆蔓延和防止动物采食黄花棘豆中毒的特效方法，致使动物黄花棘豆中毒问题日趋严重，成为草原畜牧业的大患。对于黄花棘豆中毒病的治疗目前尚无特效疗法，关键在于预防。其预防和治疗方法与其他疯草相同。国内学者曾尝试用人工挖除、焚烧、应用除草剂、浸泡、生物控制、生态控制、免疫注射、饲料添加剂、投放缓释丸等。但仍然在特定地区或季节实施，尚未大面积推广应用，对主要毒性成份的合成机理和导致动物中毒的分子机理仍不清楚，因而不能从根本上防除动物中毒。研究发现，一些植物中的有毒成分与其内部寄生的内生真菌、病原真菌或污染的霉菌有关，通过控制植物中的这些微生物可以防止动物中毒。如麦角菌寄生在牛尾草和黑麦草中，产生很高含量的麦角生物碱，致使家畜中毒，造成严重的经济损失。人们通过改良这种牧草，推出不含麦角菌的牛尾草和黑麦草，从根本上解决了动物牛尾草和黑麦草中毒的问题。通过抑制黄花棘豆中合成苦马豆素的内生菌的生长来降低植物的毒性，不仅能从根本上解决动物黄花棘豆中毒问题，还可以为防治动物疯草中毒病提供借鉴，对草原毒草的生物学控制利用和草原生态学研究起到积极作用，具有很好的经济效益和社会效益。苦马豆素具有抗肿瘤作用，不仅能抑制实体瘤的生长和转移，具有免疫刺激功能和抗辐射作用，还能减轻化疗和放疗对机体造成的不良影响，从而促进机体的抗肿瘤免疫功能，加拿大己用于in期临床试验。苦马豆素具有开发抗肿瘤新药的良好前景，然而苦马豆素的来源却十分匮乏，价格昂贵，远远不能满足人们研究和临床医疗的需要。因此，挖掘苦马豆素的资源，开辟生产苦马豆素的新途径是解决苦马豆素匮乏的关键环节。
发明内容针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种能够有效的合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌(^7&/7&&ozy^ropj's)FEL4-00c，它为彻底解决黄花棘豆的毒害奠定基础，也为研制抗癌新药提供材料。为实现上述目的，本发明的技术方案如下一种合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌(v5^e7h's^oxj^rop&)FEL4-OOc，于2008年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M208143，保藏地址中国武汉武汉大学。本发明的另一目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的制备方法，包括下列1)采自宁夏回族自治区海原县南华山草地上生长的整株黄花棘豆，用去离子水对其表面进行清洗后，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花、种分离，然后将叶、茎、花、种分别用纱布包扎，进行表面消毒。2)用灭菌滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，再将叶、茎、花、种分别剪成3mn^大小的组织块，然后将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18'C黑暗培养。3)待菌丝从组织块边缘长出时，挑取菌落边缘的菌丝接种于富集培养基表面，置18。C培养箱中进行富集培养。收集富集培养的真菌菌丝，提取其生物碱并应用薄层色谱法和气相色谱法检测，用苦马豆素标准品作对照，检测菌丝生物碱中是否含有苦马豆素，最后筛选得到可以合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c。所述表面消毒的方法为首先用体积分数为75%的乙醇浸泡20s;再用有效氯含量为l%的次氯酸钠溶液浸泡叶、花2min，浸泡茎、种4min;最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次1min。所述的富集培养基的组分及配比为.'葡萄糖20g，MgS04'7H200.5g，KC10.5g，FeS04.7H200.Olg，K2HP04lg，大豆蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，琼脂13g，pH为66.5，121。C高压灭菌20min。本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc在合成苦马豆素中的应用。本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc在研制抗癌药中的应用。.本发明还有一个目的是提供棘豆埃里格孢菌FEL4-00c在制备预防动物疯草中毒药物中的应用。棘豆埃里格孢菌FEL4-00c菌株寄生于黄花棘豆的叶、茎、花、种的组织内部，与黄花棘豆共生并且不会引起黄花棘豆发生病害，经体外培养发现FEL4-OOc能够产生SW，说明其参与着黄花棘豆中SW的生物合成，与黄花棘豆的毒性紧密相关，通过抑制FEL4-00c在黄花棘豆中的生长可以降低黄花棘豆中SW的含量，达到减少动物黄花棘豆中毒的目的。棘豆埃里格孢菌FEL4-00c菌株经体外培养能够大量繁殖扩增，并能在人工培养的条件下合成抗肿瘤活性物质SW，为研制抗癌药提供了新材料。图1FEL4-00c菌株的单个菌落形态照片。图2FEL4-00c菌株的分生孢子的电子显微镜图。图3利用MEGA软件构建系统进化树结构图。图4苦马豆素(SW)标准品的气相色谱图。图5FEL4-00c菌丝提取物的气相色谱图。具体实施方式以下结合发明人给出的附图和具体试验例及具体实施例来进一步说明本发明菌棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的有益效果和制备方法。实施例1:棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的分离1)将采自宁夏海原县南华山上生长的整株黄花棘豆用去离子水洗去黄花棘豆表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花、种分离，然后将叶、茎、'花、种分别用纱布包扎，进行表面消毒。，2)用灭菌滤纸将经表面消毒的植物组织上的水分吸去，再将叶、茎、花、种等分别剪成3mm2大小的组织块，然后将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18'C培养。3)待菌丝从组织块边缘长出时，挑取菌落边缘的菌丝接种于富集培养基表面，置18'C培养箱中进行富集培养；收集富集培养的真菌菌丝，提取其生物碱并应用薄层色谱法和气相色谱法检测，用苦马豆素标准品作对照，检测菌丝生物碱中是否含有苦马豆素，最后筛选得到可以合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c。实施例2:棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的鉴定1、形态学特征FEL4-00c菌株的菌落呈圆形，培养初期为白色，随着培养时间的延长逐渐转变为灰色、灰绿色、黑色，中央略突起(图1)。菌丝体具横隔，无纵隔，部分老龄菌丝生出分生孢子梗，分生孢子梗有分支。分生孢子及分生孢子梗具横隔，无纵隔，分生孢子的横隔膜较厚，横隔数为25个不等，孢子呈长棒状，近圆柱形，分生孢子大小为3090PmX510"m(图2)。2)培养学的特征该菌株在在PDA、PCA、Cz即ek等培养基上生长非常缓慢，其生长速度分别为0.59，0.46和0.42mm/d，最适生长温度为18°C，当温度高于25。C时生长受到抑制。所述的PDA、PCA、Czapek培养基的组分及配比为PDA培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂13g，蒸馏水1000mL，pH为67，121。C高压灭菌20min。PCA培养基去皮马铃薯20g,胡萝卜20g，琼脂13，蒸馏水1000mL，pH为67，12rC高压灭菌20min。Czapek培养基葡萄糖20g，MgS04.7H200.5g，KC10.5g，FeS04.7H200.Olg，K2HP04lg，NaN032g，蒸馏水lOOOmL，琼脂13g，pH为66.5，121。C高压灭菌20min。3)分子生物学鉴定FEL4-OOc菌株ITS-5.8SrDNA序列已在GenBank公开，登录号为EU604067。将FEL4-OOc菌株的5.8SrDNA-ITS序列用BLAST与Genbank中的5.8SrDNA-ITS序列进行同源性比较，以假球壳科(尸/eo^orace^)的链格孢属(v4tew"n'(3)、匍柄霉属(Stemp;^/ww)、假格孢属(iWwa)、埃里格孢属(五w&〃Wa)、细基格孢属(Woc/aWww)、突脐蠕孢属(五xsm/2z7wm)、平脐蠕孢属(A)7o/an;s)、弯孢属(Cwrvw/arz'a)、内脐蠕孢属(Dwc/w/era)等菌株序列构建系统发育树。应用ClustalX1.83version和MEGA4.0软件采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统发育树(图3)，FEL4-00c菌株的遗传进化距离与埃里格孢属最近，与ySz6e2h'w'aa^力ro;H'sstrainDAOM237697同源性最高，说明该菌在分子系统发育分类学上为棘豆埃里格孢。根据形态学特征、培养特性、系统发育分析，并结合文献报道，确定该菌为棘豆埃里格孢菌FEL4-00c。试验例l:棘豆埃里格孢齒FEL4"00c合成苦马豆素的试验将FEL4-00c菌株接种于富集培养基表面，置18。C培养30d，然后将菌丝刮下，50。C烘干，然后称量菌丝。将干燥的菌丝研磨成粉后，用滤纸将其包裹放入索氏提取器中用甲醇70。C加热提取24h，将甲醇提取液浓縮挥干得残渣。用去离子水将残渣溶解，加入5on长的AG50W阳离子交换树脂柱。先用去离子水洗脱树脂柱，再用氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，并将其浓縮挥干，用甲醇将SW标准品、FEL4-00c中提取的生物碱溶解，并分别点样于硅胶薄层板上，用薄层色谱法检测。若菌丝生物碱经薄层色谱分离后具有与SW标准品的颜色和位移相同的斑点，即可确定其对应的真菌可以合成SW。应用气相色谱法检测菌丝中SW的含量为571.11pg/g，其气相色谱图如图5所示。试验例2:几种杀菌剂对棘豆埃里格孢菌FEL4-00c抑菌试验1)供试菌棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc。2)供试杀菌剂50°/。多菌灵，70%甲基托布津，70%百菌清，50%福美双，45%万霉灵，25°/。丙环唑。3)抑菌试验采用菌丝生长速率测定法测定不同杀菌剂对FEL4-OOc的生长抑制作用。在15mL的灭好菌的PDA培养基中分别加入不同的杀菌剂，配制成含不同杀菌剂的培养基平板。然后将直径为6mm的菌苔接入含有杀菌剂的培养基平板上，置于18。C下培养，以不加杀菌剂的处理作对照。培养15d后测量菌落生长直径，计算生长抑制率，每个处理重复6次。为了测试不同浓度杀菌剂对FEL4-OOc的影响，每种杀菌剂采用2种浓度:500吗/mL或l000吗/mL。菌丝的生长抑制率按下面公式进行计算菌丝生长抑制率(％)=(对照菌落生长直径一处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径XIOO。4)不同杀菌剂对病原菌生长的抑制作用6种供试杀菌剂对棘豆埃里格孢菌FEL4-OOC的菌丝生长均有一定程度的抑制作用(表l)。其中25%丙环唑是6种供试杀菌剂中效果最好的，当供试浓度为500ng/mL或1000ug/mL时，25°/。丙环唑对FEL4-OOc菌丝的生长都有很强的抑制作用；70%甲基托布津的抑制作用略低于25%丙环唑，但仍可以达到比较好的效果，随着浓度的升高，抑制作用越明显；50%多菌灵，45%万霉灵的效果较差，且不同浓度之间的抑制效果无显著性差异;70%百菌清和50%福美双抑制率最弱。表l不同杀菌剂对棘豆埃里格孢菌FEL4-OOc菌丝生长的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表l可以看出25%丙环唑是6种供试杀菌剂中效果最好的，当供试浓度为500lig/mL或l000Ug/mL时，25。/。丙环唑对FEL4-OOc菌丝的生长都有很强的抑制作用；70%甲基托布津和45%万霉灵的抑制作用略低于25%丙环唑，但仍可以达到比较好的效果，随着浓度的升高，抑制作用越明显；50%多菌灵和70%百菌清的效果较差，且不同浓度之间的抑制效果无显著性差异；50°/。福美双抑制率最弱。权利要求1.棘豆埃里格孢菌(Embellisiaoxytropis)FEL4-OOc，保藏号为CCTCCNOM208143。2.权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的制备方法，其特征在于，包括下列步骤1)将采自宁夏回族自治区海原县南华山草地上生长的整株黄花棘豆用去离子水洗去表面的尘土，用灭菌的镊子将植物的叶、茎、花、种分离，然后分别将叶、茎、花、种用纱布包扎，进行表面消毒；2)用灭菌滤纸吸去经表面消毒的植物组织上的水分，再将叶、茎、花、种分别剪成3mr^大小的组织块，然后分别将各组织块接种于水琼脂培养基表面，置培养箱中18"C黑暗培养；3)待菌丝从组织块边缘长出时，挑取菌落边缘的菌丝接种于富集培养基表面，置18。C培养箱中进行富集培养；收集培养的真菌菌丝，提取其生物碱；4)应用薄层色谱法和气相色谱法对菌丝中提取的生物碱进行检测，检测菌丝生物碱中是否含有苦马豆素，筛选得到能够合成苦马豆素的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c。3.根据权利要求2所述棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的制备方法，其特征在于，所述表面消毒的方法为先用75X的乙醇浸泡20s;再用有效氯含量为1%的次氯酸钠溶液浸泡叶、花2min，浸泡茎、种4min;最后用灭菌的去离子水冲洗2次，每次1min。4.根据权利要求2所述棘豆埃里格孢菌FEL4-00c的制备方法，其特征在于，所述的富集培养基的组分及配比为葡萄糖20g，MgS04.7H200.5g，KC10.5g，FeS04.7H20O.Olg，K2HP04lg,大豆蛋白胨5g，蒸馏水1OOOmL，琼脂13g，pH为67，12rC高压灭菌20min。5.权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c在合成苦马豆素中的应用。6.权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c在研制抗癌药中的应用。7.权利要求1所述的棘豆埃里格孢菌FEL4-00c在制备预防动物疯草中毒药物中的应用。全文摘要本发明公开了棘豆埃里格孢真菌FEL4-OOc，于2008年10月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号CCTCCNOM208143。该菌株的菌落呈圆形，边缘规则，培养初期为白色，随着培养时间的延长，菌落逐渐转变为灰色、灰绿色、黑色，中央略突起。菌丝体具横隔，无纵隔，较为密集。部分老龄菌丝生出分生孢子梗，分生孢子梗有分支。分生孢子较少，呈褐色，单一、散在分布。分生孢子具横隔，无纵隔，横隔膜较厚，横隔数为2～5个不等，孢子呈长棒状，圆柱形，大小为30～90μm×5～10μm；该菌株从黄花棘豆的叶、茎、花或种子中经人工分离、筛选而得，该菌株具有合成黄花棘豆的主要毒素—苦马豆素的功能。文档编号A61K31/4353GK101544952SQ200910021078公开日2009年9月30日申请日期2009年2月10日优先权日2009年2月10日发明者余永涛,王建华,王建娜,耿果霞,赵清梅申请人:西北农林科技大学