专利名称：：Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，具体地说，涉及一种人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，及其制备与应用。
背景技术：
：传统的肿瘤治疗方法包括放射治疗、化学治疗、生物因子治疗等。但这些治疗方法都不是特异性地针对肿瘤细胞，即缺乏耙向性。药物在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也产生广泛毒性。致使药物利用度有限，副作用大，使用剂量受限。因此，需要一种有效的靶向给药系统使药物到达肿瘤区。这种系统不仅可以提高药物在肿瘤区的浓度，更有效地杀伤肿瘤细胞，而且可以减小对正常细胞、组织的损害。细胞表面具有受体，理论上，可以与特异性配体结合。由于这种结合特异性很强，我们可以利用配体的向导作用，将药物定向引导至目的组织或细胞，发挥药效，实现靶向治疗。Trastuzumab是一种抗HER2抗原的人源化单克隆抗体，可以特异性地识别并结合于细胞表面的人表皮生长因子受体-(HER2)(参见专利JP3502885、US5677171、WO2004008099)。已有文献报道HER2在许多实体瘤中高表达，如结子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等(参见文献HynesNE,StemDRThebiologyoferbB隱2/neu/HER-2anditsroleincancer.BiochemBiophysActa1198,1994，165-184.)。目前，生物蛋白类药物治疗肿瘤的常用方法是免疫毒素治疗。免疫毒素是一种由毒素蛋白和靶向性配体(抗体或抗体片断)经基因工程技术组合形成的融合蛋白。其杀伤肿瘤细胞的机制是通过靶向性配体特异结合细胞上的受体，免疫毒素被细胞内吞后，毒素蛋白促使肿瘤细胞凋亡。然而，免疫毒素临床治疗肿瘤的效果并未达到令人满意的程度，多数免疫毒素停止于临床i、n试验。主要原因如下首先，毒素蛋白的非特异性肝毒性及血管毒性，可以产生血管渗漏综合征(vls)，由此导致治疗剂量受到限制。其次，由于免疫毒素有很强的免疫原性，给药后人体内会迅速出现抗毒素中和性抗体，从而限制了其临床的重复应用。因此，在制备免疫毒素时，如何降低毒素蛋白非特异性毒性、以及降低其免疫原性的敏感性也是亟待解决的问题。另外，蛋白类药物具有分子量大及空间结构复杂的特点，在药物投递过程中极易受到复杂的生理环境影响(特别是大量酶类物质的作用)，而使蛋白的结构受到破坏，导致其活性丧失。通过制备纳米粒，将蛋白包裹起来可以有效解决这些问题。本申请人已于2008年4月8日递交了专利申请号为CN200810035706.6，发明名称为"人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的耙向纳米粒及其制备与应用"的中国发明专利申请。后续研究发现，通过选择具有良好的生物相容性的脂质材料，将毒素蛋白包裹起来制备成脂质体，可形成主动靶向性，并也能有效解决毒素蛋白非特异性毒性、免疫原性的敏感性，以及毒素蛋白的活性丧失等问题。美国FDA已批准阿霉素脂质体制剂用于多发性骨髓瘤的联合治疗，并有多种抗肿瘤脂质体制剂也已应用于临床。
发明内容本发明目的是提供一种特异性靶向HER2高表达的肿瘤细胞的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，使包裹的毒素蛋白的非特异性毒性和免疫原性的敏感性降低、并保持毒素蛋白在应用过程中结构不受破坏、活性不会丧失。本发明的另一目的是提供上述免疫脂质体的制备。本发明的另一目的是提供上述免疫脂质体的应用。靶向肿瘤细胞的载药脂质体，其结构通常应包括(1)配体，可以识别并结合肿瘤细胞表面特异性受体，易被细胞内吞；(2)生物相容性的脂质材料制备的脂质体，包裹并运载抗肿瘤药物；(3)连接基团，连接所述配体与脂质体。本发明在纳米粒表面联接人源化单克隆抗体Trastuzumab，该抗体可以与肿瘤细胞表面HER2抗原结合并发生细胞内吞。通过抗体的引导作用，PEG化的免疫脂质体原则上可以应用于所有HER2过度表达的肿瘤。本发明选择具有良好的生物相容性的脂质材料即EPC(eggphosphatidylcholine,蛋黄卵磷脂)、CHOL(cholesterol,胆固醇)、mPEG2000-DSPE(l，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine[methoxy(polyethyleneglycol)-2000]，甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)，禾口PDP-mPEG2000-DSPE(l，2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine[pyridyldithioproprionatemethoxy(polyethyleneglycol)-2000]，卩比啶二硫代丙酰胺-甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)作为制备脂质体的生物相容性脂质材料。本发明提供了一种人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，包括以下结构-——配体，为人源化单克隆抗体Trastuzumab，该配体可以选择性地识别并结合于肿瘤细胞表面的人表皮生长因子受体-(HER2);——生物相容性脂质材料制备的脂质体，脂质体中包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白药物，所述的生物相容性脂质材料为EPC、CHOL、mPEG，。-DSPE和PDP-mPEG2000-DSPE以摩尔比为2:1:0.08:0.02混合—；以及-连接基团，为巯基禾QSMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate，N-琥珀酰亚胺基-4-对马来酰亚胺苯基丁酸盐)，连接所述配体与表面带有巯基的脂质体。另外，脂质体的粒径大小也会影响药物的靶向性，如果粒径过大，则在血液循环中很容易被网状内皮系统(RES)吞噬，导致药物迅速清除，无法实现靶向肿瘤细胞。本发明的特异性靶向肿瘤细胞的载药脂质体的粒径优选范围为100-200纳米，可以有效减少RES的吞噬，提高药物制剂的靶向性。上述的脂质体中包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白药物是水溶性的抗肿瘤毒素蛋白，具体是指细菌毒素(如白喉毒素DT及假单孢菌外毒素PE)或植物毒素(如蓖麻毒素Ricin)以及它们的突变体。本发明还提供了上述人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体的制备方法，包括以下步骤(A)采用薄膜分散法，制备包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的含PDP基团的PEG化脂质体，制备脂质体的材料为EPC、CHOL、mPEG，o-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩尔比为2:1:0.08:0.02混合；(B)釆用化学偶联方法，将人源化单克隆抗体Trastuzumab与包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的脂质体连接，连接基团为巯基和SMPB。具体步骤如图2所示(A)含PDP基团的PEG化脂质体的制备将EPC、CHOL、mPEG2000-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩尔比为2丄0.08:0.02，溶于适量的氯仿溶液，制成脂质薄膜。将所制得的脂质薄膜以抗肿瘤毒素蛋白溶液充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过膜，然后过柱将未被包裹的抗肿瘤毒素蛋白除去，将收集到的样品浓縮后得到脂质体混悬液。(B)抗体的修饰及修饰后的抗体与脂质体的连接t艮据文献Allen,T.M.,Brandeis,E.,Hansen,C.B.，a/.Anewstrategyforattachmentofantibodiestostericallystabilizedliposomesresultinginefficienttargetingtocancercells.Biochim.Biophys.Acta"1995;1237:99-108.所公开的化学偶联方法，将抗体与脂质体连接。先将抗体以SMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate,N-琥拍酰亚月安基-4-对马来酰亚胺苯基丁酸盐)修饰制得MPB-Ab，然后在DTT(dl-d池iothreitol,二硫苏糖醇)的作用下将PDP基团还原制备成含SH(巯基)的脂质体，载药脂质体表面上的巯基与MPB-Ab反应，将配体与载药脂质体连接，制得PEG化免疫脂质体。上述偶联反应，将抗体与脂质体连接时，采用巯基和N-琥珀酰亚胺基-4-对马来酰亚胺苯基丁酸盐(SMPB:)。上述偶联反应的温度以10-30。C为宜。本发明的免疫脂质体与单纯的PEG化脂质体相比，以PDP-mPEG2。。。-DSPE为脂质原料进行修饰后制备成的免疫脂质体，可形成主动耙向性。本发明将毒素蛋白包裹于脂质体中，毒素蛋白与正常组织接触的机会将大大降低，从而降低毒素蛋白非特异性毒性；同时包裹又可以减少毒素蛋白与机体产生的中和性抗体的接触，可进一步降低其免疫原性的敏感性。本发明还提供了上述人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质休在制备抗肿瘤药物中的应用。特别是特异性耙向抗原HER2高表达的肿瘤细胞，如结子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌细胞等。本发明的脂质体经体外杀伤肿瘤细胞实验，结果证明生物革巴向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著；同时对正常细胞毒性作用很小。图1为本发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体的粒径分布图。图2为本发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体的制备示意图。图3为本发明的包裹PE38KDEL的PEG化脂质体体外累积释放时间曲线图。图4为本发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体体外细胞毒实验图，其中A:各制剂对HER2抗原高表达的SK-BR3细胞的杀伤；B:各制剂对HER2抗原较低表达的MDA-MB-231细胞的杀伤；C:各制剂对HER2抗原低表达的MCF-7细胞的杀伤。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1:抗肿瘤毒素蛋白PE38KDEL分离纯化PE38是细菌毒素中假单孢菌外毒素(pseudomonasextoxin,PE)的一种，分子量为38KD，PE38KDEL是优选的PE38突变体，具有非特异性毒性小的优点(第二军医大学肿瘤研究所提供)。参K、文献SongS,XueJ,FanK,efa/.PreparationandcharacterizationoffUsionproteintruncatedPseudomonasExotoxinA(PE38KDEL)inEscherichiacoli.ProteinExprPurif2005;44:52-57.方法，首先构建PE38KDEL的pET(Novagen)表达载体，然后转入工程菌BL21(DE3)(Novagen)中，利用诱导剂IPTG(isopropy-P-D-thiogalactoside，异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)诱导表达出PE38KDEL毒素蛋白。然后，通过镍柱亲和层析的方法来得到在细菌中可溶性表达的PE38KDEL。最后通过兔网织红细胞裂解物体外蛋白翻译系统，细胞杀伤实验来证实PE38KDEL的活性(见参考文献GaoJ，KouG,WangH,aa/.PE38KDEL-loadedanti-HER2nanoparticlesinhibitbreasttumorprogressionwithreducedtoxicityandimmunogenicity.BreastCancerRes.Treat,doi:10.1007/sl0549-008-0043-0.)。实施例2:包裹抗肿瘤毒素蛋白PE38KDEL的PEG化脂质体的制备用MicroBCA法(Pierce公司)精密测定分离纯化后毒素蛋白PE38KDEL的水溶液的浓度，浓度范围在2-10mg/ml为宜。将EPC、CHOL、mPEG，『DSPE(2:1:0.08，摩尔比)溶于23ml的氯仿溶液，将该溶液加入到梨形烧瓶中，充氮气三次，然后在真空条件下以旋转蒸发仪完全挥去有机溶剂。将所制得的脂质薄膜以2mg/ml的PE38KDEL溶液充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器分别过800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯膜，然后以PBS(pH7.4)为洗脱液过SepharoseCL-4B柱将未被包裹的PE38KDEL除去，将收集到的样品以1000，000Da的超滤离心管在2000rpm，6°C条件下浓縮后得到磷脂浓度为20pmol/ml的脂质体混悬液。粒径分布范围为100-200nm，如图1所示。实施例3:抗体的修饰及修饰后的抗体与脂质体的连接(1)MPB-Ab(maleimidophenylbutyrate-HER2)的制备将Ab(抗体Trastuzumab，商品名Herceptin，购买于Genentech公司)溶解在HEPES缓冲液中(25mMHEPES，140mMNaCl,pH7.4)，制备成10mg/ml的Ab溶液。将25mM的SMPB(N-succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrate,N-琥珀酰亚胺基-4-对马来酰亚胺苯基丁酸盐)溶于DMF(二甲基甲酰胺溶液)，然后缓慢地加入到上述Ab溶液中(SMPB与Ab的摩尔比为20:1)，室温下反应30分钟。然后以HEPES和MES(25mMHEPES，25mMMES，140mMNaCl，pH6.7)为洗脱液过SephadexG50柱将未结合的SMPB除去，将收集到的样品以3,000Da的超滤离心管在2000rpm，6"条件下浓缩后得到10mg/ml的MPB-Ab溶液，同法制备MPB-BSA(牛血清白蛋白)作为对照。(2)抗体的结合PEG化的免疫脂质体的制备如下。首先以EPC/CHOL/mPEGM00-DSPE/PDP-PEG2000-DSPE(2:1:0.08:0.02，摩尔比)的脂质体处方制得脂质薄膜(PEG总的摩尔数为磷脂的5。/c)。然后将所制得的脂质薄膜以2mg/ml的PE38KDEL溶液充分水化后，在室温条件下，以20mM的DTT(二硫苏糖醇)将脂质体外部的吡啶二硫基还原30分钟。然后以HEPES禾口MES(25mMHEPES,25mMMES,140mMNaCl，pH6.7)为洗脱液过SephadexG50柱除去DTT。巯基化的脂质体(20mM磷脂)与MPB-Ab在室温下孵育过夜，Ab与磷脂的摩尔比为1:1330。以PBS(pH7.4)为洗脱液将制得的脂质体过SepharoseCL-4B柱除去未结合的MPB-Ab。MPB-Ab未结合的量通过MicroBCA法进行测定。制得的PEG化免疫脂质体以1000,000Da的超滤离心管在2000rpm，6"C条件下浓縮至54mM后，充N^密闭保存或冷冻干燥即可。本发明的制备方法详见图2。实施例4:发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体的体外释放实验精密称取4个不同批次的包裹PE38KDEL的脂质体10.0210.07mg分别置于1000，000Da的20ml超滤离心管中，加入适量pH7.4的PBS缓冲液(含0.02%叠氮钠作为抑菌剂)为释放介质，置于恒温水浴摇床中，在100rpm振荡速度、37。C士0.5。C温度条件下进行包裹PE38KDEL脂质体的体外释放度测定。分别在1、2、4、6、9、12和24h取出超滤离心管，于在2000rpm，4。C条件下离心20min，吸出下清液，然后以释放介质将超滤离心管中的释放介质补足，再以MicroBCA法测定下清液中PE38KDEL的含量。在不加mPEG2,-DSPE的情况下，以与实施例2相同方法制备的普通脂质体作为对照。如表1所示，PE-Liposomes(包裹毒素蛋白的PEG化脂质体)和PE-HER-Liposomes(Ab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体)在包封率和载药量方面无明显差异(P>0.05)，此外Ab的结合干扰PE38KDEL体外释放的定量，因此我们用PE-Liposomes，而不是PE-HER-Liposomes来进行PE38KDEL的体外释放实验。表l包裹PE38KDEL的PEG化脂质体的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果普通脂质体在各取样点的累积释放百分比依次为25.14±3.41，44.72±4.99，56.28±6.36，69.57±5.80，80.06±5.35，86.97土7.13，99.23土0.52(n=4);PEG化脂质体在各取样点的累积释放百分比依次为5.18±0.62，10.27±1.84，13.65±3.11，16.41±3.46，19.50±4.29，23.14±4.88，33.07±5.73(n=4)，详见图3。由图可见所制备的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体制剂可满足作为有效释放系统的需要。实施例5:发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹PE38KDEL的PEG化免疫脂质体的体外杀伤肿瘤细胞实验细胞毒性实验通过制造商(Promega，Madison,WI)的实验设计以细胞滴定96孔的非放射性细胞增殖测定试剂盒进行测定(Chen,H.，Gao，丄，Lu,Y.,"a/.PreparationandcharacterizationofPE38KDEL-loadedanti-HER2nanoparticlesfortargetedcancertherapy.J.Control.Release,2008;128:209-216.)。在PEG化脂质体(实施例2制备的)、PEG化的免疫脂质体(实施例1-3制备的)、游离PE38KDEL(实施例1制备的)或各空白脂质体的条件下，将乳腺癌细胞(lxl04)于37。C，C02孵育器孵育两天。该法中PE38KDEL的测定浓度从1到加,000pM(等于0.1mg/ml的总脂浓度)。将没有PE38KDEL的空白PEG化的脂质体和PEG化的免疫脂质体在最高总脂浓度(0.1mg/ml)条件下的孵育两天来测定细胞毒性，然后将20(^1MTS/PMS溶液补充到每个孔里。在3"7。C条件下孵育2小时，在490nm波长以全自动定量绘图酶标仪测定每个孔中样品的吸收度。结果显示，PEG化的免疫脂质体对SK-BR3的杀伤优于PEG化的脂质体和游离的PE38KDEL,详见图4;没有PE38KDEL的空白PEG化的脂质体和PEG化的免疫脂质体在最高总脂浓度(0.1mg/ml)条件下无细胞毒性。权利要求1、人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，包括以下结构，且粒径范围为100-200纳米配体，为人源化单克隆抗体Trastuzumab；包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的脂质体，制备脂质体的材料为EPC、CHOL、mPEG2000-DSPE和PDP-mPEG2000-DSPE以摩尔比为2∶1∶0.08∶0.02混合；以及连接基团，为巯基和SMPB，连接所述配体与表面带有巯基的脂质体。2、根据权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，其特征在于其中的抗肿瘤毒素蛋白是细菌毒素或植物毒表i)J古们的空亦拔<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3、根据权利要求2所述的人源化单克隆抗体Tmstuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，其特征在于其中的细菌毒素是白喉毒素或假单孢菌外毒素。4、根据权利要求2所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，其特征在于其中的植物毒素是蓖麻毒素。5、一种如权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体的制备方法，包括以下步骤(A)采用薄膜分散法，制备包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的含PDP基团的PEG化脂质体，制备脂质体的材料为EPC、CHOL、mPEG2oQ()-DSPE、PDP-mPEG2000-DSPE以摩尔比为2:1:0.08:0.02混合；(B)采用化学偶联方法，将人源化单克隆抗体Trastuzumab与包裹并运载抗肿瘤毒素蛋白的脂质体连接，连接基团为巯基和SMPB。6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于具体步骤如下(A)将EPC、CHOL、mPEG扁『DSPE、PDP-mPEG2,-DSPE以摩尔比为2:1:0.08:0.02溶于氯仿溶液，制成脂质薄膜，将所制得的脂质薄膜以抗肿瘤毒素蛋白溶液充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过膜，然后过柱将未被包裹的抗肿瘤毒素蛋白除去，浓縮；(B)将人源化单克隆抗体Trastuzumab以SMPB修饰制得MPB-Ab，然后在DTT的作用下将PDP基团还原制备成含巯基的脂质体，脂质体表面上的巯基与MPB-Ab反应，将配体与脂质体连接；反应温度为1(K3(TC。7、一种如权利要求1所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。8、根据权利要求7所述的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用，其中的肿瘤是子宫内膜癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或膀胱癌。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，传统的肿瘤治疗方法如放射治疗、化学治疗、生物因子治疗等缺乏靶向性，免疫毒素治疗又存在着毒素蛋白的非特异性毒性和免疫原性的敏感性等问题。本发明的人源化单克隆抗体Trastuzumab修饰的包裹毒素蛋白的PEG化免疫脂质体，在脂质体表面连接抗体，可与肿瘤细胞表面HER2抗原结合并发生细胞内吞；毒素蛋白包裹于脂质体中，可降低毒素蛋白非特异性毒性和免疫原性的敏感性。本发明还提供了上述脂质体的制备与应用。本发明经体外杀伤肿瘤细胞实验，结果证明生物靶向性良好，体外杀伤靶肿瘤细胞作用显著；同时对正常细胞毒性作用很小。文档编号A61K38/16GK101536982SQ20091005003公开日2009年9月23日申请日期2009年4月27日优先权日2009年4月27日发明者刘青锋,周闺臣,霁孙,孙治国,宣吉明,翮张,晨方,李博华,王明娟,王江峰,豪邹,郭亚军,威钟,钟延强,婷陈,洁高,莹鲁申请人:中国人民解放军第二军医大学