专利名称：一种短肽及含有其的免疫抑制剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药领域，特别涉及一种短肽及含有其的免疫抑制剂和应用。
背景技术：
抗体产生的自身免疫性疾病是一类由于自身抗体产生而导致组织、细胞损伤的自 身免疫性疾病。其包含多种疾病，如较为常见的有系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎，多发 性硬化,抗中性粒细胞抗体(Anti-NeutrophilCytoplasmic Antibody,ANCA)相关性小血管 炎。这些疾病都是一类慢性进展，预后较差的疾病。近年来，对于抗体产生的自身免疫性疾 病的发病机制还没有完全清楚。但是一些重要的受体及细胞通路在抗体产生的自身免疫性 疾病的发生发展中起着关键作用。如Fc γ受体(Fcy receptor, FcyR)是介导体液免疫 和细胞免疫的桥梁，即其介导了自身抗体导致的免疫细胞活化和组织、细胞的免疫损伤，导 致疾病的急性炎症反应及慢性进展。抗体产生的自身免疫性疾病的治疗，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性 硬化、ANCA相关性血管炎等，是近代医学的治疗难点，一旦诊断，往往预后较差。随着近年来 糖皮质激素及免疫抑制剂在抗体产生的自身免疫性疾病治疗中的广泛及正规应用，该类疾 病的预后获得了明显改善，尤其是患者的5年生存率，获得了显著提高。但是随着治疗及研 究的深入，糖皮质激素+免疫抑制剂的治疗方案的缺陷日益显露。其副作用大，如糖皮质激 素可以导致物质代谢和水盐代谢紊乱，诱发和加重感染(这是导致患者死亡的重要原因)， 引起各个系统的并发症，诱发精神异常，导致白内障青光眼等，而免疫抑制的副作用更不低 于糖皮质激素，尤其是在导致恶性肿瘤、造血系统功能异常、性腺抑制等。这些都大大的阻 碍了糖皮质激素+免疫抑制剂在治疗抗体产生的自身免疫性疾病上的应用。目前，如何降低糖皮质激素和免疫抑制剂在治疗抗体产生的自身免疫性疾病中产 生的副作用，是临床医生最为关注的问题。通过大量的临床试验，规范、合理应用糖皮质激 素和免疫抑制剂在一定程度上降低了其副作用，但是不能根本解决这个问题。因此，越来越 多的研究者开始关注特异性更强的生物型免疫抑制药物，如利妥昔单抗，阿巴西普等生物 型制药，都是特异性非常强的免疫抑制剂。这些药物逐步在自身免疫性疾病的治疗中获得 应用，而且表现出优秀的低毒性反应，高敏感性的特点。但是由于这些药物的专利大多由国 外掌握，且治疗费用昂贵，限制了这些药物在我国的广泛的应用。因此，开发新的治疗抗体 产生的自身免疫性疾病的药物成为一个急需解决的问题。由抗体产生的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮，过敏性紫癜，抗中性粒细胞胞 浆抗体相关性血管炎等自身免疫性疾病均存在大量自身抗体。其血清中抗体的滴度和疾病 的严重性相关，在疾病好转时抗体滴度下降，而复发时抗体滴度上升。Fc γ R是几乎所有免 疫细胞膜表面均表达的免疫球蛋白受体，参与一系列的生理和病理的免疫反应，在免疫系 统的调节中也起着关键作用。TG19320(—种能够通过结合IgG Fc段而拮抗Fc γ R和IgG 之间的相互作用的多肽)能够拮抗Fc γ R和IgG之间的相互作用，从而保护系统性红斑狼 疮小鼠的组织损伤，降低其死亡率(Nat Biotechnol, 2000,18(7) :735_739)。TG19320也
3能够干预抗中性粒细胞胞浆抗体对正常中性粒细胞的作用，降低抗中性粒细胞胞浆抗体诱 导的中性粒细胞凋亡和活化(中华肾脏病杂志，2006，22 (8) :483-487，中华风湿病学杂志， 2007，11 (5) 267-270)。但是Fc γ R也担任着机体抵抗病原微生物入侵，保持内环境稳定的 作用，完全阻断Fc γ R的作用可能会导致严重后果。因而可以通过阻断部分Fc γ R与抗体 的结合，如特异性的阻断FcyRIIA与IgG的作用，来治疗自身免疫性疾病。FcyRIIA(即 FcyIIA受体)是Fc γ R中的一个亚型，是介导抗体产生的自身免疫性疾病的重要受体，在 疾病发生发展中起到重要作用。因此拮抗FcyRIIA和IgG之间的相互作用已成为治疗抗 体产生的自身免疫性疾病的重要靶点之一，拮抗Fc y RIIA和IgG的结合能够治疗或预防自 身免疫性疾病。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的治疗抗体产生的自身免疫性疾病 的药物中存在不易生产，生产成本高，价格昂贵的不足，提供一种新的治疗自身免疫性疾病 的药物，该药物能够特异性拮抗Fc y RIIA和IgG相互作用，从而预防或治疗抗体产生的自 身免疫性疾病。本发明人经过研究后发现，通过特异性拮抗免疫细胞膜的免疫球蛋白受体 Fc γ RIIA而不影响其他受体的功能，是治疗抗体相关的自身免疫性疾病的重要靶点。因此， 本发明人以Fc YRIIA蛋白的胞外段为靶标，设计并合成的一种短肽，发现该短肽可以特异 性拮抗IgG和Fc YRIIA的相互作用，从而完成了本发明。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种短肽，其是6肽，其氨基 酸序列是选自Thr (苏氨酸)，Pro (脯氨酸)，Ala (丙氨酸)，Ile (异亮氨酸)，Phe (苯丙氨 酸)，His(组氨酸)，Trp(色氨酸)，Tyr(酪氨酸)或Glu(谷氨酸)中的任意6种氨基酸 残基的任意顺序的组合。根据本发明，较佳的，所述的短肽的氨基酸序列为选自以下氨基酸序列中的 一种J-Pro-Ala-Pro-Ile-R，其中J代表Thr、His、Trp或Glu氨基酸残基，R代表 Phe或Tyr氨基酸残基；较佳地，所述的氨基酸序列为选自以下氨基酸序列中的一种 Thr-Pro-Ala-Pro-IIe-Phe， His-Pro-Ala-Pro-IIe-Phe, Trp-Pro-Ala-Pro-I1e-Phe, Trp-Pro-Ala-Pro-Ile-Tyr 禾口 Glu-Pro-Ala-Pro-IIe-Phe0根据本发明，较佳的，所述的短肽的氨基酸序列较佳的为选自以下氨 基酸序列中的一种:Pro-Ile-Phe-Ala-Pro-Thr, Phe-IIe-Pro-Pro-Thr-Ala, Pro-Phe-IIe-Ala-Thr-Pro 禾口 Pro_Pro_Phe_Thr_Ala_Ile0本发明短肽可采用现有技术中的公知方法获得。既可以用多肽自动合成仪进行化 学合成，又可以将短肽序列推导成核苷酸序列，然后克隆到表达载体中进行生物合成。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种免疫抑制剂，其活性成 分包括所述的短肽。本发明的免疫抑制剂含有治疗有效量的本发明短肽。需要的时候，也可以还含有 其他的活性成分。上述免疫抑制剂中还可以含有一种或多种药学上可以接受的载体。所述 载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表 面活性剂、吸附载体和润滑剂等。本发明的免疫抑制剂可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式，各种剂型均可以按药学领域的常规方法制备。本发明的短肽具有结合Fc YRIIA的活性，体外实验证实具有特异性拮抗 Fc y RIIA和IgG相互作用的能力，是Fc y RIIA拮抗剂。因此本发明的短肽可用于制备 拮抗FcyIIA受体(FcyRIIA)和免疫球蛋白G(IgG)相互作用的药物，特别是用于制备 Fc y RIIA拮抗剂。该药物通过对Fc y RIIA的拮抗作用而抑制抗体介导的自身免疫性疾病 的组织、细胞损伤及急性炎症状态，从而阻断抗体介导的自身免疫性疾病的进展，进而预防 或治疗抗体介导的自身免疫性疾病。因此本发明的短肽可用于制备预防或治疗自身免疫性 疾病的药物。所述的自身免疫性疾病较佳的为系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬 化和ANCA相关性血管炎等。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明的短肽具有特异性强，结构短 小，免疫原性低，合成简单，且具有较强的抑制IgG单体和Fc γ RIIA结合的能力。可用于制 备拮抗FcyRIIA和IgG相互作用的药物和制备自身免疫性疾病的药物。以本发明的短肽 为活性成分的药物，可以特异性拮抗Fc y RIIA和IgG之间的相互作用，而不拮抗Fc y RI和 IgG之间的作用。因此其副作用低。在制造新型免疫抑制剂中将会得到广泛应用，并且将会 带来巨大的社会及经济效益。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1为不同浓度的本发明的1号短肽对Fc γ RIIA和IgG相互作用的影响。图2为玫瑰花环形成实验显微镜下照片。图A为阳性对照组，图B为IgG组，图C 为1号短肽，图D为2号短肽，图E为3号短肽，图F为4号短肽，图G为5号短肽，图H为 6号短肽。图3为玫瑰花环形成实验中各组中玫瑰花环形成及未形成的Κ562细胞数。1 6 为1 6号短肽。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为10 25°C。实施例1短肽序列的设计和合成经过序列设计、优化和筛选后获得9个短肽，见表1。送交上海吉尔生化合成，纯度 均> 95%，用于以下实施例的试验。表1.经过设计、优化获得的短肽 实施例2本发明短肽化合物特异性拮抗Fc γ RIIA和IgG的相互作用所用的短肽为1 5号短肽。(1)细胞培养U937细胞(从上海中科院细胞库购买)，采用含10% (ν/ν)小牛血清的RMPI1640 培养液，在37°C，5% (v/v)C02培养。K562细胞(从上海中科院细胞库购买)，采用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的IMDM培养液，在37°C，5% (v/v) CO2培养。(2)短肽化合物拮抗Fc γ RIIA-IgG相互作用活性的测定利用流式细胞计数法计数细胞表面Fc γ R和IgG的结合情况。具体步骤取处于倍增期的细胞，无菌PBS洗3次，用PBS重悬浮至1 X IO6/ ml。阴性对照组不加人IgG和短肽，以等体积的PBS为阴性对照。阳性对照组加人 IgG(Sigma)SOygAil,室温下孵育30min，PBS洗2次。短肽干预组先加人工合成短肽 200 μ g/ml室温孵育30分钟，再加人IgG50 μ g/ml，再室温下孵育30min，PBS洗2次。最后 3组各加FITC标记的抗人IgG Fab段抗体(Sigma)室温下避光孵育30min，PBS洗2次，1 % (w/v)多聚甲醛-PBS固定。流式细胞计数仪计数荧光阳性的细胞数。每个样本计数10000 个细胞，取阳性细胞和总计数细胞的百分比表示阳性率，每个样本设3个复孔，重复实验1 次，统计采用卡方检验。(3)结果流式细胞计数仪计数细胞阳性率见表2。阴性对照组和其他组相比，差异均具有 统计学意义。在k562细胞组中，阳性对照组和1号、5号短肽相比，差异具有统计学意义(P < 0. 05)，和其他组相比，差异不具有统计学意义，但是2号短肽组的阳性细胞数仍较阳性 组要低。在U937细胞组，阳性细胞组和其他短肽干预组均无统计学差异(P > 0. 05)。表2.流式细胞计数仪计数细胞阳性率
1号短肽 2号短肽 3号短肽 4号短肽 5号短肽 6号短肽 7号短肽 8号短肽 9号短肽 注a 和阴性对照组比差异具有统计学意义(P < 0. 05) ；b 和阳性对照组比差异 具有统计学意义(P < 0. 05)。U937细胞同时表达Fc y RI和Fc y RIIA受体，而Κ562细胞仅表达Fc y RIIA受体， 而且Fc y RI受体是高亲和力受体，能优先和IgG结合。U937细胞作为Fc y RI受体的载体 细胞，Κ562细胞作为Fc y RIIA受体的载体细胞，观察短肽对这两种受体的特异性阻断功 能。通过流式细胞计数阳性细胞占总细胞的比例，发现短肽能够阻断IgG和Κ562细胞的结 合而不能阻断IgG和U937细胞的结合，说明合成的新型短肽能够特异性阻断Fc γ RIIA受 体，而不能阻断Fc γ RI受体。实施例3短肽能够浓度依赖性得拮抗Fc γ RIIA-IgG之间的结合所用短肽为1号肽。(1)细胞培养Κ562细胞，采用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的 IMDM 培养液，在 37°C，5% (v/v) CO2 培养。(2) CELL ELISA验证短肽浓度依赖性拮抗Fc y RIIA-IgG之间作用96孔板用2 % (w/v) PBS-B (2 % (w/v) PBS-B,是用2g的牛血清白蛋白(BSA)溶解 到IOOml PBS中，下面均类似)封闭，4°C过夜或室温2h。取对数生长期的K562细胞用 (w/v) PBS-B洗3次。1% (w/v) PBS-B重悬浮K562细胞，调浓度至6X 106/ml，每孔加K562 细胞100 μ 1，离心后去上清。IgG组直接加入IgG的浓度梯度，分别是5000 μ g/ml, 1000 μ g/ πιΙ,ΙΟΟμ g/ml,50y g/mL·短肽组先加入短肽，浓度为分别为10 μ g/ml，100 μ g/ml，室温孵 育30分钟后，加相同的IgG浓度梯度，37°C孵育60min。用(w/v)PBS-B洗3次，加辣根 过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG抗体6土8111￡1)，371孵育30111土11。1% (W/v)PBS_B洗 3次，用ABTS显色试剂盒显色(上海生工)，具体显色步骤安说明书操作。BioTek酶标仪 405nm波长读取OD值。(3)结果IgG浓度梯度组未加任何短肽，10 μ g/ml短肽组加入10 μ g/ml短肽，100 μ g/ml 短肽组加入100 μ g/ml短肽。以纵坐标为405nm处吸光值，横坐标为IgG浓度的对数值绘图，结果见图1。从图中可以明显看出，在IgG组，随IgG的浓度增加，OD值明显上升，说明 IgG和Fc y RIIA的结合增加，呈浓度依赖性。在加入10 μ g/ml和100 μ g/ml的短肽组，发 现OD值仍随着IgG浓度的增高而增高，但是和IgG组相比，相同浓度下，其OD值下降，且短 肽100 μ g/ml组比短肽10 μ g/ml组OD值下降明显，说明短肽拮抗IgG和Fc y RIIA受体的 结合也具有浓度依赖性，随着短肽浓度的增高，拮抗能力增强。实施例4本发明短肽阻断Κ562细胞形成玫瑰花环实验所用短肽1 6号短肽。(1)细胞培养Κ562细胞，采用含10% (ν/ν)胎牛血清、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的 IMDM 培养液，在 37°C，5% (v/v) CO2 培养。(2) EA 的制备取4% (ν/ν)绵羊红细胞悬液加入试管中，再加等量的(1 1000)稀释的兔抗绵 羊红细胞抗体，混勻，置37°C水浴中15min，以Hank’ s液洗涤2次，再以等体积的Hank’ s 液重悬浮，为EA悬液。(3)玫瑰花环形成实验设3组，分别为阳性组，IgG组，短肽组。具体步骤取对数生长期的K562细胞，用HBSS洗3次，重悬浮，调细胞浓度为4X IO6细胞/ ml ο阳性组取K562细胞悬液0. Iml于EP管中，加入0. Iml的的EA悬液，混勻。IgG组取K562细胞悬液0. Iml于EP管中，先加入人IgG 20 μ g，再加入0. Iml的 EA悬液，混勻。短肽组取K562细胞悬液0. Iml于EP管中，先加入专利要求1短肽和专利要求2 短肽20 μ g，再加入0. Iml的EA悬液，混勻。4°0，21!静置，轻轻悬起沉淀细胞，取2(^1细胞悬液，用细胞计数板涂片，显微镜 下随机选取多个视野，计数玫瑰花环形成及未形成的K562细胞。(4)玫瑰花环形成实验结果用细胞计数板计数200个以上的K562细胞，以1个K562细胞上结合5个以上绵 羊红细胞为玫瑰花环阳性细胞，显微镜下照片见图2。计数玫瑰花环阳性细胞占总细胞数的 百分比，结果见图3。从图中可以看出阳性对照组的玫瑰花环阳性率高，且1个K562细胞周 围绕大量绵羊红细胞，而IgG组和1号、2号、5号、6号短肽组的玫瑰花环阳性细胞减少，且 大部分K562细胞结合的绵羊红细胞较阳性对照减少，这说明IgG组、1号短肽组，2号短肽 组、4号短肽组、5号短肽组、6号短肽组均能降低K562细胞的玫瑰花环形成率，可见本发明 的短肽具有拮抗Fc y RIIA和IgG之间的相互作用。
8
权利要求
一种短肽，其特征在于，其是6肽，其氨基酸序列是选自Thr，Pro，Ala，Ile，Phe，His，Trp，Tyr或Glu中的任意6种氨基酸残基的任意顺序的组合。
2.如权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述的氨基酸序列为选自以下氨基酸序列 中的一种J-Pro-Ala-Pro-Ile-R，其中J代表Thr、His、Trp或Glu氨基酸残基，R代表Phe 或Tyr氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的短肽，其特征在于，所述的氨基酸序列为选自以下 氨基酸序列中的一种Thr-Pro-Ala-Pro-Ile-Phe, His-Pro-Ala-Pro-11e-Phe, Trp-Pro-Ala-Pro-Ile-Phe, Trp-Pro-Ala-Pro-IIe-Tyr 禾口 Glu-Pro-Ala-Pro-Ile-Phe。
4.如权利要求1所述的短肽，其特征在于，所述的氨基酸序列为选自以下 氨基酸序列中的一种:Pro-Ile-Phe-Ala-Pro-Thr, Phe-IIe-Pro-Pro-Thr-Ala, Pro-Phe-IIe-Ala-Thr-Pro 禾口 Pro_Pro_Phe_Thr_Ala_Ile0
5.一种免疫抑制剂，其特征在于，其活性成分包括权利要求1 4任一项所述的短肽。
6.如权利要求1 4任一项所述的短肽在制备Fcy IIA受体拮抗剂中的应用。
7.权利要求1 4任一项所述的短肽在制备拮抗Fcγ IIA受体和免疫球蛋白G相互作 用的药物中的应用。
8.权利要求1 4任一项所述的短肽在制备治疗或预防自身免疫性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种短肽及其免疫抑制剂和应用。该短肽是6肽，其氨基酸序列是选自Thr，Pro，Ala，Ile，Phe，His，Trp，Tyr或Glu中的任意6种氨基酸残基的任意顺序的组合。该短肽可用于制备拮抗FcγIIA受体(FcγRIIA)和免疫球蛋白G(IgG)相互作用的药物和制备治疗或预防自身免疫性疾病的药物。具有特异性强，结构短小，免疫原性低，合成简单的特点。以本发明的短肽为活性成分的药物，可以特异性拮抗FcγRIIA和IgG之间的相互作用，而不拮抗FcγRI和IgG之间的作用，因此其副作用低。在制造新型免疫抑制剂中将会得到广泛应用，并且将会带来巨大的社会及经济效益。
文档编号A61K38/08GK101870723SQ20091004995
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者俞海瑾, 张骥, 朱维良, 王伟铭, 陈楠, 陈永熙 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院;中国科学院上海药物研究所