专利名称：三七三醇皂苷提取物及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药提取物及其制备，特别涉及中药三七的提取物三七三醇皂苷 提取物及其制备。
背景技术：
三七(Panax notoginseng,PN)是风干后的中国传统中药三七(Burk)F. H. Chen的 根。三七皂甙(也称为三七总皂苷，英文名Panax Notoginsenosides, PNS)是三七的主 要有效成份，由30余种不同的皂甙组成，临床上广泛用于治疗微循环障碍相关性疾病，如 心血管疾病和肝功能障碍。三七皂甙已经列入国家药典，有相应制剂产品上市，如注射用血塞通。三七皂苷 的主要成份为人参皂苷Rbl，人参皂苷Rgl，三七皂苷R1，其制备方法有多篇报道。三七三醇皂苷为三七皂甙的一种，对脑血管疾病有治疗作用。三七三醇皂苷也有多篇文献报道，如中国专利200410073881，公开了一种 三七三醇皂甙的制备方法，包括取三七粉碎，加浓度为60%的乙醇浸泡、渗漉，收集渗漉液， 渗漉液减压浓缩，浓缩液用蒸馏水稀释，缓慢加到大孔吸附树脂分离柱中，用40 %乙醇洗 脱，收集40%乙醇洗脱液，然后再精制得三七三醇皂甙。200510075040公开了一种三七三醇皂苷的生产制备方法及其应用，包括取三七粉 碎，加浓度为50-90%的乙醇浸泡、渗漉，收集渗漉液，渗漉液减压浓缩，浓缩液用蒸馏水稀 释，缓慢加到大孔吸附树脂分离柱中，用40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液，然后再精制
得三七三醇皂苷等步骤。以上方法均使用大孔吸附树脂分离，分离效果不佳，本发明人在对三七三醇皂苷 进行研究过程中，采用C18反相硅胶柱分离，试验出一组新的三七三醇皂甙提取物及其制备 方法，这些三七三醇皂甙提取物具有疗效高，纯度高，吸收好，质量稳定，同时制备方法分离 效果佳，含量高，工艺简单，操作方便，成本低廉，适合工业化生产。
发明内容
本发明提供一种三七三醇皂苷提取物的制备方法，所述制备方法步骤如下a.取三七；b.乙醇渗漉；C.渗漉液浓缩；d.分离出上清液；e.上清液上D941树脂柱，f.水洗；收集上样流出液和水洗液，g.洗脱液浓缩；h.经流动相溶解后上C18反相硅胶柱，I.乙腈和水混合液洗脱，
j.洗脱液浓缩得提取物。优选的本发明的制备方法步骤如下a.取三七，粉碎成粗颗粒； b. 3 10倍70%乙醇浸泡8小时，渗漉，收集20 40倍量70%乙醇渗漉液，渗漉 流速为lBV/hc.渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1. 5倍；d.离心，得上清液；e.上清液上D941树脂(树脂与药材0. 5 1 lg/g)上样流速为0. 5 1. 5BV/ h，5-10倍柱体积，流速1 1. 5BV/h,f.水洗；收集上样流出液和水洗液，g.洗脱液浓缩至干，h.经流动相溶解后上C18反相硅胶柱，填料粒径30 100 μ m，I.用30-60%的乙腈和水混合液洗脱，j.洗脱液减压浓缩干燥得提取物。本发明更详细的制备方法如下三七，粉碎成颗粒(过20目筛)，3 10倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉， 收集20 40倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70V以下减压浓缩至药 材的1.5倍，离心，上清液上D941树脂(树脂与药材0.5 1 lg/g)上样流速为0. 5 1. 5BV/h，5-10倍柱体积，流速1 1. 5BV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液。上样流出液 和水洗液70°C以下减压浓缩至干，备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18 反向填料粒径30 100 μ m)，用乙腈和水一定比例洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有 机溶剂至干。本发明的三七三醇皂苷提取物，最优选的制备方法见本发明实施例。本发明还包括用本发明的制备方法得到的提取物制备的药物组合物，所述药物组 合物是用上述三七三醇皂苷作为药物活性成分制备成的药物制剂。本发明的药物组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中三七三醇皂苷 作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0. 1-99.9%，其余为药物可接受的 载体。本发明的药物制剂组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单 位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、 薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸 齐 、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴 剂、贴剂。本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充 齐U、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。 适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、 聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。 适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂， 或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含 有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基 纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉 伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性 酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需 要，可含有常规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体 和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载 体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉 齐U、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这 种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐 酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA 二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋 酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、 麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及 其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性 齐IJ、聚乙二醇、环糊精、β _环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每 次1-20剂，如1-20袋或粒或片，每剂lmg-1000mg。以下通过实验数据说明本发明的有益效果。本发明的三七三醇皂苷提取物在LPS诱导的微循环障碍形成之后的作用对粘附于小静脉壁白细胞的数目的影响在LPS组，注射LPS20分钟(E)和LPS60分钟(F)导致了大量白细胞对血管壁的 粘附。在LPS+三七三醇皂苷提取物组，注射LPS之后20分钟导致了粘附于小静脉壁的白
细胞数目显著增加(H)，然后开始三七三醇皂苷后处理，导致了粘附白细胞数目的明显降低 ⑴。对照组60分钟的观察期只发现了少量粘附的白细胞。相反，LPS组粘附于 小静脉壁的白细胞数目进行性增加并和时间呈现线性关系，LPS注射后20分钟为 5. 6士0. 3cells/200ym，而在60分钟时高达13. 1 士 1. lcells/200 μ m。三七皂甙提取物后 处理30分钟显著改善了 LPS诱导的白细胞对血管壁的粘附。对肥大细胞脱颗粒作用的影响注射LPS60分钟之后脱颗粒的肥大细胞增加到52. 3士5. 21%。三七三醇皂苷提取 物后处理显著地抑制了 LPS诱导的肥大细胞脱颗粒，其值达到了 22. 56 士 5. 62 %。对中性粒细胞粘附分子⑶lib和⑶18的表达的影响LPS刺激之后⑶1 Ib和⑶18的荧光强度被明显提高，其值分别达到和 56. 33士4. 00和66. 85士3. 18。三七三醇皂苷提取物后处理抑制了⑶lib的荧光强度。
对血浆细胞因子浓度的影响LPS刺激之后所有测定的细胞因子都迅速升高了，分别达到了 261. 52士64. 41， 652. 83士 156. 32和2. 53士0. 21ng/L。三七三醇皂苷提取物后处理显著的抑制IL-6和 INF-Y的产生，在一定程度上改善了 TNF-α的释放。试验的结果显示在LPS注射之后20分钟运用三七三醇皂苷提取物后处理对于以 上提到的每一个LPS诱导产生改变的效果是，能够显著的减少粘附于小静脉壁白细胞的 数目、脱颗粒的肥大细胞的数目以及中性粒细胞⑶lib的表达以及LPS诱导的血浆IL-6， INF- γ浓度，这些结果显示运用三七三醇皂苷提取物后处理能够改善三七三醇皂苷提取物 诱导的白细胞的粘附，能够改善在本试验条件之下LPS诱导的微循环障碍。这些结果表明 三七三醇皂苷提取物对LPS诱导的败血症具有治疗作用。另一项研究表明，用本发明的三七三醇皂苷提取物处理可以很好地降低肠系膜上 动脉缺血-再灌注诱导的肝脏微循环障碍，包括降低微静脉直径，红细胞流速和灌注的窦 状隙数量，以及增加白细胞滚动和粘附。本发明的三七三醇皂苷提取物对微循环障碍的改 善作用是基于对缺血_再灌注诱导的肝脏损伤的保护作 用。有关试验表明，本发明的三七三醇皂甙提取物比现有技术疗效高，副作用少，纯度 高，吸收好，质量稳定，用途新颖，同时制备方法工艺简单，操作方便，成本低廉，适合工业化生产。
具体实施例方式下面以具体来说明本发明，实施例是为了便于理解本发明，而不以任何方式限制 本发明的权利要求和核心内容。实施例1三七三醇组皂苷的制备三七，粉碎成颗粒过20目筛，8倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集30 倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1.5倍，离 心，上清液上D941树脂，树脂与药材0. 75 lg/g，上样流速为lBV/h，7. 5倍柱体积，流速 1.25BV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液，上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干， 备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18反向填料粒径70 μ m)，用30%比例 的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干。实施例2实施例1所述的三七三醇组皂苷的检测性状淡黄色或棕褐色粉末，味苦。照高效液相色谱法测定提取物含量色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0. 05%磷 酸溶液(99 400)为流动相；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Re峰计算应不低 于2500。对照品溶液的制备分别精密称取人参皂苷Rgl，人参皂苷Re和三七皂苷Rl适量。 加甲醇分别制成每Iml含人参皂苷Rgl 1.3mg、人参皂苷Re 0. 2mg的溶液、三七皂苷Rl 0. 6mg,即得。供试品溶液的制备取提取物粉末0.05g至25ml容量瓶中，精密称定，加20ml甲 醇溶解，超声处理，放冷后加甲醇定容至刻度，摇勻，滤过，即得。测定法分别精密吸取上述对照品溶液各10 μ 1与供试品溶液10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。Rgl含量占总提取物70%三七皂苷Rl含量占总提取物20%人参皂苷Re含量范围占总提取物9%，提取物中水分不超过10. 0% ；水分照水分测定法(《中国药典》2005版附录IX H 第一法)测定，不得过10.0%。三七总皂苷含量在85 %以上；三七总皂苷中Rbl不多于8%。
实施例3三七，粉碎成颗粒(过20目筛)，3倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集 20倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1. 5倍， 离心，上清液上D941树脂(树脂与药材0.5 lg/g)上样流速为0.5BV/h，5倍柱体积，流 速lBV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液。上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干， 备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18反向填料粒径30 μ m)，用40 %比例 的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干。实施例4三七，粉碎成颗粒(过20目筛)，10倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集 40倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1. 5倍， 离心，上清液上D941树脂(树脂与药材1 lg/g)上样流速为1. 5BV/h, 10倍柱体积，流速 1.5BV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液。上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干， 备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18反向填料粒径100 μ m)，用50%比 例的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干。实施例5三七，粉碎成颗粒(过20目筛)，5倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集25 倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1.5倍，离 心，上清液上D941树脂(树脂与药材0. 6 lg/g)上样流速为0. 75BV/h, 7倍柱体积，流速 1.4BV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液。上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干， 备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18反向填料粒径50 μ m)，用60%比例 的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干.实施例6实施例3的提取物，经过检测，Rgl含量占总提取物40%，三七皂苷Rl含量占总提 取物10%，人参皂苷Re含量占总提取物5%。提取物中水分不超过10.0%;三七总皂苷含 量在80%以上；三七总皂苷中Rbl不多于10%。实施例7实施例4的提取物，经过检测，Rgl含量占总提取物70%，三七皂苷Rl含量占总提 取物20%，人参皂苷Re含量占总提取物5%。提取物中水分不超过10. 0% ；三七总皂苷含 量在85%以上；三七总皂苷中Rbl不多于8%。实施例8实施例5的提取物，经过检测，Rgl含量占总提取物50%，三七皂苷Rl含量占总提取物15%，人参皂苷Re含量占总提取物10%。提取物中水分不超过10.0% ；三七总皂苷 含量在85%以上；三七总皂苷中Rbl不多于8%。实施例9三七，粉碎成颗粒过20目筛，6倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集35 倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1.5倍，离 心，上清液上D941树脂(树脂与药材0.8 lg/g)上样流速为0.8BV/h，9倍柱体积，流速 1.3BV/h，水洗；收集上样流出液和水洗液。上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干， 备用，上述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱(C18反向填料粒径80 μ m)，用50%比例 的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干。实施例10取实施例1的三七三醇组皂苷，根据需要可以含有药物可接受的载体，根据制剂 学常规技术制备成片剂.
实施例11取实施例1的三七三醇组皂苷，根据需要可以含有药物可接受的载体，根据制剂 学常规技术制备成胶囊剂.实施例12取实施例1的三七三醇组皂苷，根据需要可以含有药物可接受的载体，根据制剂 学常规技术制备成注射剂.实施例13两组病人，各50人，服用现有技术的三七三醇组皂苷片和本发明最优选的实施例 1的三七三醇组皂苷片，有效率相同，后者头晕，恶心等副作用减少50%以上。
权利要求
一种三七三醇组皂苷提取物的制备方法，其特征在于，提取步骤如下a.取三七；b.乙醇渗漉；c.渗漉液浓缩；d.分离出上清液；e.上清液上D941树脂柱；f.水洗；收集上样流出液和水洗液；g.洗脱液浓缩；h.经流动相溶解后上C18反相硅胶柱；I.乙腈和水混合液洗脱；j.洗脱液浓缩得提取物。
2.权利要求1的制备方法，其特征在于，提取步骤如下a.取三七，粉碎成粗颗粒；b.3 10倍70%乙醇浸泡8小时，渗漉，收集20 40倍量70%乙醇渗漉液，渗漉流速 为 lBV/h ；c.渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1.5倍；d.离心，得上清液；e.上清液上D941树脂(树脂与药材0.5 1 lg/g)上样流速为0. 5 1. 5BV/h, 5-10倍柱体积，流速1 1. 5BV/h ；f.水洗；收集上样流出液和水洗液；g.洗脱液浓缩至干；h.经流动相溶解后上C18反相硅胶柱，填料粒径30 100μ m ；I.用30-60%的乙腈和水混合液洗脱；j.洗脱液减压浓缩干燥得提取物。
3.权利要求1的制备方法，其特征在于，提取步骤如下三七，粉碎成颗粒，3 10倍70%乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集20 40倍量 70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1. 5倍，离心，上 清液上D941树脂上样流速为0. 5 1. 5BV/h, 5-10倍柱体积，流速1 1. 5BV/h,水洗；收 集上样流出液和水洗液。上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干，备用，上述干膏经流 动相溶解后上C18反相硅胶柱，用30-60%比例的乙腈和水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压 回收有机溶剂至干.
4.权利要求1的制备方法，其特征在于，提取步骤如下三七，粉碎成颗粒过20目筛，8倍70 %乙醇浸泡8小时，装渗漉桶渗漉，收集30倍量 70%乙醇渗漉液，渗漉流速为lBV/h，渗漉液于70°C以下减压浓缩至药材的1. 5倍，离心，上 清液上D941树脂，树脂与药材0. 75 lg/g,上样流速为lBV/h，7. 5倍柱体积，流速1. 25BV/ h，水洗；收集上样流出液和水洗液，上样流出液和水洗液70°C以下减压浓缩至干，备用，上 述干膏经流动相溶解后上C18反相硅胶柱，C18反向填料粒径70 μ m，用30%比例的乙腈和 水洗脱，洗脱液70°C以下真空减压回收有机溶剂至干。
5.用权利要求1的三七三醇皂苷提取物的制备方法获得的提取物。
6.含有权利要求5的提取物的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及一种中药提取物及其制备，特别涉及中药三七的提取物三七三醇皂苷提取物及其制备，制备过程包括提取，分离，浓缩等步骤。
文档编号A61P9/00GK101966215SQ20091006989
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者张兰兰, 李瑞明, 王玉 申请人:天津天士力制药股份有限公司