专利名称：：欧缬草的组织培养繁殖方法
技术领域：
：本发明属于植物组织培养繁殖
技术领域：
，具体地，涉及败酱科缬草属药用植物欧缬草(^/eh""flo^^"a/"L.)组织培养繁殖方法。
背景技术：
：欧缬草(^r/en^ao^c/wafcLinn.)为败酱科缬草属多年生草本植物，原产欧洲，国内并无野生分布。欧缬草作为国际上认定的药用缬草在欧美使用历史悠久并广泛应用，其根入药主要具有镇静、促进睡眠、抗抑郁和焦虑等功效，且无宿醉作用，用作镇静安眠(镇静剂)，治疗轻、中度失眠与精神紧张等，先后被英、美、法、德、俄、意等22国国家标准以及欧洲植物药治疗科学合作协会(ESCOP)植物药专册目录收载。欧缬草及其制剂目前在欧美市场上十分畅销，年销售额(达到上亿美元)一直列畅销植物药前10名。缬草属全世界约250余种，我国约有28种1变种(包括栽培1种)，其中一些种虽有药用记载，如缬草(K/7"MCfo#C/""/&C.Y.ChengetH.B.Chen)、宽叶缬草(PT/aw"e,)、黑7JC缬草(Kawwew^y)、毛节缬草(Kote/TO/oto)、蜘蛛香(Ky加"w""W)等，但非欧缬草(Ko#d"afcLinn.)。本发明所用资源为欧缬草，其学名经缬草属专家陈虎彪教授鉴定。国内缬草资源中缬草烯酸(2000年美国药典USP24规定欧缬草原料中缬草烯酸不低于0.1%)含量远未达到欧缬草欧美药典的标准，从而无法进入欧美市场。随着社会压力和生活节奏的加快，我国有20%至30%的国民患有不同程度的失眠，老年群体失眠率更是高达40%。目前治疗失眠主要以合成药物为主，常具有一定的副作用，如头晕目眩、乏力等，因而寻找能促进睡眠的天然植物药非常必要。而解决这些天然植物药的繁殖技术及应用迫在眉睫。迄今，现在技术中未有欧缬草(ra/ena"aq^c/恥feLinn.)的组织培养繁殖方法的报道。
发明内容本发明旨在提供一种欧缬草(讼/Wa加oj7k^a/"Linn.)的组织培养繁殖方法，用欧缬草幼嫩的腋芽或顶芽作外植体，经无菌处理后，利用培养基进行外植体诱导、丛芽增殖及生根培养，经过试管苗炼苗移栽，达到组织快繁和规模化生产的目的。本发明人工繁殖的欧缬草可用于制备改善睡眠保健食品和药物。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案欧缬草(ra/^v'a加o#a>afeL.)组织培养繁殖方法，包括用欧缬草幼嫩的腋芽和顶芽作外植体，经无菌处理后，在培养基中进行外植体诱导、丛芽增殖、生根培养、炼苗移栽。所述无菌处理和外植体诱导是将幼嫩的顶芽或腋芽经0.1%的肥皂液侵泡810min，用自来水冲洗干净，用0.1%氯化汞溶液消毒1015min后取出，用无菌水冲洗58次，接种于启动培养基MS十6-BA1.5+NAA0.2上培养；培养条件3%蔗糖、0.65%琼脂，PH5.，培养温度为(25±1)°C，光照时间12h'cT1,光照10001ux。所述增殖培养是将启动培养基培养获得的丛生芽在无菌条件下去掉生长过长的叶片，切成lcm左右的单个小芽，接种在增殖培养基①MS+6-BA1.5+NAA0.2或②MS+6-BA1.0+NAA0.2或③MS+6-BA0.5+NAA0.2上进行增殖培养，培养条件3%蔗糖、0.65%琼脂，PH5.，培养温度为(25±1)。C，光照时间12hW1，光照10001ux。所述生根培养是将增殖培养产生的不定芽，分成单株，转至生根培养基①MS+IAA0.2+IBA0.2或②MS+IAA0.5+IBA0.5或③MS+IAA1.0+IBA1.0上诱导生根。所述炼苗移栽是当不定根生长至0.5lcm时，移至大棚中，不打开瓶盖，在自然光照条件下炼苗57d，取出小苗，小心洗去根部的培养基，用1:1000的多菌灵溶液浸泡5min后，栽于温室中，加盖塑料薄膜保湿，一周内保持遮光60%和适当湿度，一周后揭去薄膜。本发明还提供了一种改善睡眠的药物，以上述欧缬草组织培养得到的欧缬草的提取物为原料，加入可接受的药用载体制备而得所述的药物是以欧缬草组织培养得到的欧缬草为原料，用95%乙醇提取获得欧缬草提取物，再加入可接受的药用载体。改善睡眠的保健品，以本发明上述欧缬草组织培养得到的欧缬草的提取物为原料，加入可接受的药用载体制备而得。所述的保健品是以欧缬草组织培养得到的欧缬草为原料，用95%乙醇提取获得欧缬草提取物，再加入可接受的药用载体。具体实施例方式下面的实施例可以使本专业人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:欧缬草的组织培养繁殖方法材料与方法1、材料试验材料即组织培养外殖体为欧缬草植株幼嫩的顶芽或腋芽。2、方法将幼嫩的顶芽或腋芽经0.1。/。的肥皂液侵泡810min，用自来水冲洗干净，在超菌工作台上用0.1%氯化汞溶液消10~15min后取出，用无菌水冲洗7~8次，接种于培养基上培养，置于光照10001ux，温度25士1。C下培养。启动培养基MS+6-BA1.5+NAA0.2;增殖培养基①MS+6-BA1.5+NAA0.2;②MS+6-BA1.0+NAA0.2;③MS+6-BA0.5+NAA0.2;生根培养基①MS+IAA0.2+IBA0.2;②MS+IAA0.5+IBA0.5;③MS十IAA1.0+IBA1.0。以上培养基均加入3%蔗糖、0.65%琼脂，PH5.8。培养温度为(25±1)度，光照时间12h*d—、光照度lOOOlx。实验步骤和结果1、启动培养切取欧缬草顶芽或腋芽，首先用肥皂及自来水清洗，然后用蒸馏水冲洗干净后，在超净台上用75%酒精消毒305，再用0.1%的HgCl2溶液消毒35min,无菌水冲洗56次，接种到启动培养基上，经过1015d的培养，顶芽和腋芽开始萌动，30d后有丛生芽产生，基部产生少量的愈伤组织，丛生芽生长正常。2、增殖培养将l步骤启动培养获得的丛生芽在无菌条件下，去掉生长过长的叶片，切成lcm左右的单个小芽，接种在增殖培养基①或②或③号上进行增殖实验。30d后结果表明在②号MS+6-BA1+NAA0.2培养基中，生长状况最佳，形成的丛生芽增殖倍数达到5倍，丛芽基部有极少的愈伤组织形成，无不定根产生，丛芽生长健壮，苗高约23cm。在①号MS+6-BA1.5+NAA0.2培养基中，形成的丛生芽矮小，有玻璃苗产生，丛芽基部有愈伤组织形成，无不定根，小苗分化明显受到抑制，丛生芽增殖倍数约3倍，苗高约1.52cm。在③号MS+6-BA0.5+NAA0.2培养基中，小苗生长较快，形成的丛生芽较少，增殖倍数约1.5倍，丛芽基部无愈伤组织形成，有少量的不定根产生，苗高约45cm。在增殖培养时，欧缬草随BA浓度的提高，增殖速度相应提高。但在较高的BA浓度条件下芽苗会变细、变弱，且随BA浓度进一步提高，芽苗变得更加丛生、细弱，并有玻璃苗出现。根据这种情况，生产中在努力提高丛芽增殖率，又保证不定芽健壮的同时，把增殖率控制在5左右较为适宜。3、生根培养将增殖培养产生的不定芽，分成单株，转至生根培养基①或②或③号上诱导生根。15d后结果如下①号MS+IAA0.2+IBA0.2培养基中，植株生长正常，生根率约75%，根部无愈伤组织，单株生根数量约12条。②号MS+IAA0.5+IBA0.5培养基中，植株生长正常，生根率约100%，根部无愈伤组织，单株生根数量约34条。③号MS+IAA1.0+IBA1.0培养基中，生根率约100%，根部有愈伤组织，单株生根数量约5条以上。4、移栽:欧缬草小苗叶片较薄，植株幼嫩，当不定根生长至0.5lcm时，可以进行炼苗处理，移至大棚中，不打开瓶盖，在自然光照下炼苗57d，取出小苗，小心洗去根部的培养基，用l:1000的多菌灵溶液浸泡5min后，栽于温室中，加盖塑料薄膜保湿，一周内保持遮光60%和适当湿度。一周后揭去薄膜，一个月后成活率达90%。制剂实施例按实施例1的方法种子繁殖获得欧缬草根原料，进行提取(95%乙醇室温浸提，采用40升95%乙醇浸提5公斤欧缬草3次，得到1公斤乙醇提取物)或粉碎得到提取物或欧缬草根粉，按常规制剂制作方法制成改善睡眠药效的片剂或胶囊。提取物片剂按照本领域己知的方法制备片剂，每片含有下述成分欧缬草提取物90mg乳糖100mg硬脂酸镁3mg聚乙烯吡咯烷酮7mg合计200mg如果需要，片剂可用羟丙基甲基纤维素、滑石和着色剂进行膜包覆。提取物胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分:欧缬草提取物90mg乳糖80mg玉米淀粉25mg硬脂酸镁lmg聚乙烯吡咯垸酮4mg合计200mg[制剂实施例3]原料胶囊按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有欧缬草根粉400mg。试验例1:试验例可进一步说明本发明所述欧缬草的有益效果，这些试验例为本发明的药效学试验，即欧缬草改善睡眠的药理实验。实验方法按实施例1的方法获得欧缬草根原料，经粉碎后过80目筛的生药粉于乳钵中加入0.5%CMC-Na研磨后配制成相应浓度的混悬液供动物灌胃用。实验动物为SPF级ICR小鼠，34周齡，雌雄各半，体重1822g，由昆明医学院实验动物中心提供，生产许可证SCXK(滇)2005-0008。IVC动物实验室。采用中药药理实验方法学中的阈下剂量戊巴比妥钠协同催眠试验、阈剂量戊巴比妥钠睡眠时间测定试验的方法(这些方法见[l]李仪奎等.中药药理实验方法学.上海科学技术出版社，1991:330;[2]李仪奎等.中药药理实验方法学.上海科学技术出版社，1991:334和[3]陈奇等.中药药理研究方法学.1993:113114中的描述)进行试验，均采用多次灌胃和单次腹腔注射两种给药方式。实验设置溶媒对照，以安定片为阳性对照。实验结果1、对戊巴比妥钠阈下催眠剂量小鼠入睡率的影响取1822g小鼠80只，按体重和性别随机分成8组溶媒对照;阳性对照安定片；欧缬草根粉样品500、250、125mg/kg(多次给药为l.O、0.5、0.25g/kg);每组10只，雌雄各半。各组动物分别按剂量灌胃给药一次(多次给药试验除阳性对照组仅于试验当天给药一次外，其余各组动物每日按剂量灌胃给药一次，连续3天)，空白对照组给予20ml/kg的0.5%CMC-Na，45min后(多次给药试验为末次给药后45min)各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，记录15分钟内翻正反射消失达一分钟以上的动物数为入睡指标，用乂2检验比较各给药组与对照组的差异。结果见表1和2。表l单次给药对戊巴比妥钠阈下催眠剂量小鼠入睡率的影响(试验一)组别剂量(mg/kg)动物数(只)入睡动物数(只)入睡率(%)溶媒对照—10110安定片2.01010100**欧缬草500102202501022012510330与对照组相比**P<0.01实验结果表明2.0mg/kg的安定灌胃给药一次，能明显提高阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡率；欧缬草单次给药对阈下剂量戊巴比妥钠有协同催眠趋势，与溶媒对照组相比无显著差异。表2多次给药对戊巴比妥钠阚下催眠剂量小鼠入睡率的影响(试验二)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与对照组相比*P<0.05，**P<0.01实验结果表明2.0mg/kg的安定灌胃给药一次、低剂量连续给药3天，能明显提高阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡率；欧缬草多次给药能明显提高阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡率，0.25g/kg剂量达到显著水平。2、对阈剂量巴比妥钠小鼠睡眠时间的影响取1822g小鼠80只，按体重和性别随机分成8组溶媒对照；阳性对照安定片；欧缬草样品500、250、125mg/kg(多次给药为1.0、0.5、0.25g/kg);每组10只，雌雄各半。各组动物分别按剂量灌胃给药一次(多次给药试验除阳性对照组仅于试验当天给药一次外，其余各组动物每日按剂量灌胃给药一次，连续3天)，空白对照组给予20ml/kg的0.5%CMC-Na，45min后(多次给药试验为末次给药后45min)各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg，以翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间。记录各只小鼠的入睡时间和睡眠恢复时间，t检验比较组间差异的显著性。结果见表3和表3单次给药对阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠时间的影响(试验一)组别剂量动物数睡眠潜伏期睡眠时间(mg/kg)(n)(土SD,min)(x士SD，min)溶媒对照—104.5±1.138.4±18.3安定片20101.6±0.7**73.6±28.4**欧缬草500103.9±1.034.9±20.9250104.0±1.237.U24.6125104.7±2.042.9±19.3与对照组相比**P<0.0I实验结果表明2.0mg/kg的安定灌胃给药一次，能明显縮短阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠的潜伏期、延长睡眠维持时间；欧缬草单次给药对小鼠睡眠潜伏期有縮短趋势，对睡眠维持时间无明显影响。表4多次给药对阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠时间的影响(试验二)组别剂量(/kg)动物数(n)睡眠潜伏期(3f±SD,min)睡眠时间(x士SD,min)溶媒对照-103.5±0.738.9±20.0安定片2.0mg101.9±0.6**75.8±21.4**中国产欧缬l.Og102.9±0.733.1±17.80.5g104.4±1.431.1±8.10.25g103.5±2.056.1±34.0与对照组相比*P<0.05，**P<0.01实验结果表明2.0mg/kg的安定灌胃给药一次，能明显缩短阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期、延长睡眠维持时间；样品1.0g/kg剂量连续灌胃给药3天，对睡眠潜伏期有縮短趋势(接近统计学差异)，样品0.25g/kg剂量连续灌胃给药3天，对睡眠时间有延长趋势。3、药理小结欧缬草根粉以0.25g/kg、剂量连续灌胃给药3天，能明显提高阈下剂量戊巴比妥钠小鼠的入睡率；1.0g/kg连续灌胃给药3天，对睡眠潜伏期有縮短趋势；0.25g/kg剂量连续灌胃给药3天，对睡眠时间有延长趋势。即欧缬草有温和的催眠作用《权利要求1、欧缬草(ValerianaofficinalisL.)的组织培养繁殖方法，包括用欧缬草幼嫩的腋芽或顶芽作外植体，经无菌处理后，在培养基中进行外植体诱导、丛芽增殖、生根培养、炼苗移栽。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于外植体诱导是将幼嫩的顶芽或腋芽经0.1%的肥皂液侵泡810min，用自来水冲洗干净，用0.1%氯化汞溶液消毒1015min后取出，用无菌水冲洗5~8次，接种于启动培养基MS+6-BA1.5+NAA0.2上培养至获得从生芽；培养条件3%蔗糖、0.65%琼脂，PH5，培养温度,(25±1)。C，光照时间12h'(T1,光照10001ux。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于丛芽增增是将启动培养基培养获得的丛生芽在无菌条件下去掉生长过长的叶片，切成lcm大小的单个小芽，接种在增殖培养基①MS+6-BA1.5+NAA0.2或②MS+6-BA1.0+NAA0.2或③MS+6-BA0.5+NAA0.2上进行增殖培养，培养条件3%蔗糖、0.65%琼脂，PH5，培养温度为(25±1)。C，光照时间12h'(r1,光照10001ux。4、如权利要求1所述的方法，其特征在于生根培养是将增殖培养产生的不定芽，分成单株，转至生根培养基①MS+IAA0.2+IBA0.2或②MS+IAA0.5+IBA0.5或③MS+IAA1.0+EBA1.0上诱导生根至长出不定根。5、如权利要求1所述的方法，其特征在于炼苗移栽是当不定根生长至0.5lcm时，移至大棚中，不打开瓶盖，在自然光照条件下炼苗57d，取出小苗，洗去根部的培养基，用1:IOOO的多菌灵溶液浸泡5min后，栽于温室中，加盖塑料薄膜保湿，一周内保持遮光60%和适当湿度，一周后揭去薄膜。6、改善睡眠的药物，以权利要求l欧缬草组织培养得到的欧缬草的提取物为活性成分，再加入可接受的药用载体制备而得。7、如权利要求6所述的药物，其特征在于以权利要求1欧缬草组织培养得到的欧缬草为原料，用95%乙醇提取获得欧缬草提取物，再加入可接受的药用载体。8、改善睡眠的保健品，以权利要求1欧缬草组织培养得到的欧缬草的提取物为活性成分，加入可接受的保健品载体制备而得。9、如权利要求8所述的保健品，其特征在于以权利要求1欧缬草组织培养得到的欧缬草为原料，用95%乙醇提取获得欧缬草提取物，再加入可接受的保健品载体。全文摘要本发明旨在提供一种欧缬草(ValerianaofficinalisLinn.)的组织培养繁殖方法，用欧缬草幼嫩的腋芽和顶芽作外植体，经无菌处理后，利用培养基进行外植体诱导、丛芽增殖及试管苗生根试验。经过试管苗炼苗移栽，达到组织快繁和规模化生产的目的。本发明组织培养得到的欧缬草可用于制备改善睡眠的保健食品和药物。文档编号A61K36/185GK101518204SQ20091009429公开日2009年9月2日申请日期2009年4月3日优先权日2009年4月3日发明者刘玉清,俊周,徐云峰,曹家驹,赵友兴,赵建国申请人:中国科学院昆明植物研究所;昆明滇虹药业有限公司