专利名称：基于内皮抑素基因的免疫脂质体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别涉及基于内皮抑素(Vasohibin)基因的免 疫脂质体，还涉及该免疫脂质体的制备方法和应用。
背景技术：
肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是以肺间质弥漫性渗出、浸润和纤维化 为主要病变的一大类疾病。其发病机制仍不清楚，临床缺乏特效治疗药物，预 后极差。因此，对肺纤维化发病机制及其防治的研究具有重要的临床意义。
传统认为慢性炎症在肺纤维化中起重要作用，然而针对单个或多个细胞因 子抑制炎症反应以减轻肺纤维化的措施被证明效果不佳。近年来，血管生成在 肺纤维化发生中的作用日益受到重视。文献报道，肺纤维化早期血管生成异常 增加，而血管生成是炎症发生和组织修复的中心，炎性因子对血管生成有促进 作用，血管生成又是炎性细胞渗入病灶并活化的通路，血管生成的失控必定会 引起炎症反应和组织修复的失控，因此，血管生成可能是肺纤维化形成中的一 个核心环节而起关键作用。
生理情况下，血管生成受血管生成促进因子和血管生成抑制因子的平衡调 节。研究发现，通过抑制血管生成促进因子如血管内皮生长因子(VEGF)或促 进血管生成抑制因子如干扰素诱导蛋白-10 (IP-10)的产生，能够减轻博来霉素 致大鼠肺纤维化模型血管生成和肺纤维化的程度，提示在肺纤维化过程中血管 生成促进因子占有优势而血管生成抑制因子相对不足，因此，调节血管生成促 进因子和血管生成抑制因子之间的平衡可能为肺纤维化防治提供新的策略。
Vasohibin是新近发现的血管生成抑制因子，'选择性表达于血管内皮细胞， 可以被血管生成促进因子如VEGF等诱导产生，并通过负反馈调节抑制血管生成。研究表明，Vasohibin基因转染至小鼠肝组织中可使血浆中Vasohibin释放 增加，并在远隔部位表现出抗血管生成效应；在小鼠视网膜新生血管生成模型 中，血管内皮细胞VEGF高表达与Vasohibin mRNA升高相伴行，敲除Vasohibin 基因后导致视网膜新生血管增加，相反，眼球内注射重组Vasohibin基因能强烈 抑制视网膜新生血管形成；通过腺病毒载体转染Vasohibin基因还可以抑制人脐 静脉内皮细胞的增殖、迁移和微管形成。因此，Vasohibin可能为肺纤维化防治 提供新的方法和药物。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于Vasohibin基因的免疫脂质 体，可以特异性作用于肺血管内皮细胞抑制血管生成和肺纤维化形成，具有靶 向性强、毒副作用小、半衰期长等优点。
为达到此目的，在本发明的第一方面，提供了一种基于Vasohibin基因的免 疫脂质体，由Vasohibin基因重组真核表达载体、脂质体和抗第WI因子相关抗原 单克隆抗体组成，所述脂质体内包裹Vasohibin基因重组真核表达载体，脂质体 表面连接抗第VIfl因子相关抗原单克隆抗体。
进一步，所述Vasohibin基因重组真核表达载体含有核苷酸序列如SEQ ID No.l所示的Vasohibin基因；
进一步，所述Vasohibin基因重组真核表达载体采用p3xFLAG-CMV-14真 核表达载体；
进一步，所述脂质体由磷脂和胆固醇组成；
进一步，所述磷脂为卵磷脂。
本发明的目的之二在于提供所述基于Vasohibin基因的免疫脂质体的制备方 法，操作简便易行。
为达到此目的，在本发明的第二方面，提供了所述基于Vasohibin基因的免 疫脂质体的制备方法，包括以下步骤
a、 Vasohibin基因重组真核表达载体的构建提取人脾脏组织血管内皮细胞总RNA;合成PCR上下游引物上游引物序 列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示；以人脾脏组织血管 内皮细胞总RNA为才莫板进行Vasohibin基因的逆转录和PCR扩增，PCR反应条 件为温度95X:预变性IO分钟，然后温度94。C变性1分钟、58"退火1分钟、 72。C延伸4分钟，共30个循环，最后温度72。C延伸10分钟；PCR产物经琼脂 糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化目的片段，即得Vasohibin基因；将所得 Vasohibin基因用限制性内切酶Notl和Xbal进行双酶切，再与同样经Notl和Xbal 双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA连接酶的作用下进行连 接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨卡青霉素的LB平板筛 选阳性克隆，小量提取重组质粒，采用双酶切法和PCR法鉴定阳性克隆质粒并 测序，测序结果显示在p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位点之间插入有与SEQ ID No.l所示核苷酸序列完全一致者，即为构建成功的Vasohibin基因重组真核 表达载体p3xFLAG-CMV-14八/ksohibin;取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的 大肠杆菌DH5a，接种于含有氨千青霉素的LB液体培养基中，在温度37。C振摇
培养，待培养液的OD49。nm达到1 1.5，大量抽提重组质粒，用超纯水溶解制成
P3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，置温度-20。C保存，备用；
b、 包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体的制备 将卵磷脂和胆固醇用乙醚溶解制成溶液，在搅拌条件下向该溶液中緩慢加
入p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，超声振荡至7JC相和有机相混合均匀，减压 蒸馏除去有机溶剂，离心，弃去上清液，收集沉淀，即得包裹Vasohibin基因重 组真核表达载体的脂质体；
c、 包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体与抗第VI因子相关抗原 单克隆抗体的连接
将抗第Vi因子相关抗原单克隆抗体经巯基化修饰后，与包裹Vasohibin基因 重组真核表达载体的脂质体在室温下轻摇连接过夜，用琼脂糖凝胶柱分离除去 游离的抗第VDI因子相关抗原单克隆抗体，即得基于Vasohibin基因的免疫脂质体。本发明的目的之三在于提供所述基于Vasohibin基因的免疫脂质体的应用。 为达到此目的，在本发明的第三方面，提供了所述基于Vasohibin基因的免 疫脂质体在制备抗肺纤维化药物中的应用。
本发明的有益效果在于本发明提供了 一种基于Vasohibin基因的免疫脂质 体及其制备方法和应用，该免疫脂质体可以特异性作用于肺血管内皮细胞抑制 血管生成和肺纤维化形成，具有靶向性强、毒副作用小、半衰期长等优点，且 制备方法简单，可以用于制备抗肺纤维化药物，在肺纤维化防治领域具有良好 的应用前景，可取得较好的社会经济效益。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明作进一步的详细描述，其中
图1为Western blot检测Vasohibin基因重组真核表达载体在真核细胞中的 表达；
图2为琼脂糖凝胶电泳检测基于Vasohibin基因的免疫脂质体； 图3为免疫组4匕染色观察肺组织中VEGF的定位和表达； 图4为HE染色7见察肺组织病理改变。
具体实施例方式
Vasohibin应用于肺纤维化防治须特异性作用于肺血管内皮细胞。直接注射 Vasohibin基因重组腺病毒，因缺乏靶向性会对肺外其他器官组织的血管生成产 生不利影响。脂质体是由 一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体， 可以包裹多种物质(如药物、核酸等)并将其转入多种类型的细胞中，可以延 长包裹物的作用时间、降低毒性，但仍然缺少主动靶向性。免疫脂质体则是一 种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体，其借助抗体或抗体片段与靶细 胞表面抗原的特异性结合，可以特异性识别并结合靶细胞，使脂质体在靶区释;改包裹物，具有靶向性强、毒副作用小等优点。第環因子相关抗原(vWF)主 要表达于血管内皮细胞，是血管生成标志性抗原。本发明首先构建Vasohibin基 因重组真核表达载体，再制备包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体， 最后将其与抗人vWF单克隆抗体偶联，制得基于Vasohibin基因的免疫脂质体， 具有靶向性强、毒副作用小、半衰期长等优点。将该免疫脂质体通过气道给药， 对其降低博来霉素致小鼠肺纤维化模型血管生成及肺纤维化形成的作用进行了 考察，结果显示，该免疫脂质体能够有效降低博来霉素致小鼠肺纤维化模型的 血管生成及肺纤维化形成，可以用于制备抗肺纤维化药物。
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第 三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
一、基于Vasohibin基因的免疫脂质体(简称Anti-vWF-Lip-Vasohibin)的
制备
1 、 Vasohibin基因重组真核表达载体的构建及检测 (1) Vasohibin基因重组真核表达载体的构建
取手术切除的人脾脏组织，加入液氮充分研磨，再称取100 mg置无RNA 酶的离心管中，采用RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提^jk管内皮细胞总RNA, 按照试剂盒说明书操作。
根据GenBank登录号为NM—014909的Vasohibin基因序列设计1对特异性 引物，在每条引物的5，端加上保护碱基，再在其后引入限制性内切酶识别序列； 引物序歹'H口下F: 5，-gcggccgcagatccccataccgagtgtg國3， ( SEO ID No.2),下划线 部分为NotI酶切位点；R: 5，-tctagagggcctctttggtcatttcc-3， ( SEQ ID No.3 )，下 划线部分为Xbal酶切位点；设计的引物委托上海生工公司进行合成。
以血管内皮细胞总RNA为模板、引物F和R为PCR上下游引物，采用 RT-PCR逆转录扩增试剂盒(TaKaRa公司)进行Vasohibin基因的逆转录和PCR扩增，按照试剂盒说明书操作，PCR反应条件为温度95。C预变性10分钟，然 后温度94。C变性1分钟、58。C退火1分钟、72。C延伸4分钟，共30个循环，最 后温度72。C延伸IO分钟；PCR产物用浓度为10 g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴 定，鉴定正确的PCR产物采用胶回收试剂盒(TIANGEN公司)切胶回收纯化 目的片段，按照试剂盒说明书操作，即得Vasohibin基因。
将Vasohibin基因用限制性内切酶Notl和Xbal ( TaKaRa公司)进行双酶 切，双酶切产物经切胶回收纯化后，与同样经NotI和XbaI双酶切的真核表达载 体p3xFLAG-CMV-14 ( Sigma-Aldrich公司)在T4 DNA连接酶(TaKaRa公司) 的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a (TIANGEN公司)感受态细 胞，用含有氨千青霉素(AMP)的LB平板筛选阳性克隆，将单个阳性克隆接 种于含有AMP的LB液体培养基中，在温度37。C振摇培养12小时后，用质粒 小量提取试剂盒(TIANGEN公司)小量提取重组质粒，按照试剂盒说明书操作， 所得重组质粒采用双酶切法和PCR法进行鉴定，双酶切法和PCR法均鉴定为阳 性的重组质粒委托上海生工公司对插入片段进行测序，测序结果显示在 p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位点之间插入有与SEQ ID No.l所示核苦酸 序列完全一致的DNA片段，表明Vasohibin基因重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin构建成功。
取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大肠杆菌DH5a，接种于含有AMP 的LB液体培养基中，在温度37。C振摇培养过夜，待培养液的光吸收值OD490nm 达到1-1.5，采用超纯质粒抽提试剂盒(TIANGEN公司)大量抽提重组质粒， 按照试剂盒说明书操作，所得重组质粒用超纯水溶解制成p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin溶液，用紫外分光光度计测定纯度和浓度，置温度-20。C保存，备用。 (2 ) Vasohibin基因重组真核表达载体的检测
Western blot检测将cos-7细胞接种于6孔板中，用PRIM 1640培养液在 温度为37。C、 C02气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞融合率达 到约80%时，采用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin或p3xFLAG-CMV-14转染入cos-7细胞，按照试剂说明书操作，转染 4小时后，将培养液更换为PRIM 1640培养液，继续培养48小时，收集细胞， 用PBS洗涤并重悬，超声裂解细胞，离心，收集上清液，用His Bind蛋白纯化 试剂盒(Novage公司)纯化Vasohibin，按照试剂盒说明书操作；取纯化蛋白溶 液，采用质量百分浓度为5%的浓缩胶、质量百分浓度为12.5%的分离胶进行 SDS-PAGE电泳，电泳完毕后电转印PVDF膜，用脱脂奶粉溶液封闭1小时后， 加入兔抗小鼠Vasohibin单克隆抗体，温度37。C孵育1小时，PBST洗膜后，再 加入羊抗兔IgG,温度37。C孵育l小时，PBST洗膜后，再加入发光底物，温度 37。C孵育l分钟，暗室中用X光片曝光，显影，定影，观察p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin在真核细胞中的表达。结果如图1所示，其中M泳道为蛋白质分子量 标准，1至3泳道为从p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin转染的cos-7细胞中提取纯 化的蛋白溶液，4泳道为从p3xFLAG-CMV-14转染的cos-7细胞中提取纯化的蛋 白溶液；从图可知，1至3泳道在分子量为40kD处均有一明显的蛋白质条带， 与Vasohibin预期分子量大小一致，而4泳道无相应条带，表明构建的p3xFLAG-
2、包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体(简称Lip-Vasohibin) 的制备及4全测
(1) Lip-Vasohibin的制备
采用逆向蒸发法制备取卵磷脂2g和胆固醇0.4g,加入乙醚60mL,搅拌 使完全溶解，再在搅拌条件下緩慢加入浓度为0.5 mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ Vasohibin溶液60 mL,超声振荡30分钟至水相和有才几相混合均匀，所得乳状液 减压蒸馏除去有机溶剂后，10000 r/min离心20分钟，弃去上清液(含未包裹入 脂质体的p3xFLAG-CMV-14八&sohibin),收集沉淀，即得Lip-Vasohibin。 (2 ) Lip-Vasohibin的检测
透射电镜检测将Lip-Vasohibin用浓度为3g/L的磷钨酸溶液负染后，滴至 专用铜网上，自然风千，置透射电子显微镜下观察脂质体的形态结构和粒径分布。结果显示，制备的Lip-Vasohibin为球形或近球形小嚢泡；粒径均匀，分布 范围为30 150nm，平均粒径低于100nm。 3 、 Anti-vWF-Lip-Vasohibin的制备及检测 (1) Anti-vWF-Lip-Vasohibin的制备
将抗vWF单克隆抗体(SantaCruz公司)经巯基化修饰后，与Lip-Vasohibin 在室温下轻摇连接过夜，用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离Anti-vWF-Lip-Vasohibin 和游离的抗vWF单克隆抗体，即得Anti-vWF-Lip-Vasohibin。 (2 ) Anti-vWF-Lip-Vasohibin的检测
琼脂糖凝胶电泳检测在Anti-vWF-Lip-Vasohibin中加入浓度为5 g/L的SDS (SDS能够破坏脂质体的膜表面结构，使其释放内部的包裹物)，混匀静置，取 上清液进行浓度为5 g/L的琼脂糖凝胶电泳，同时设置未加入SDS的Anti-vWF-Lip-Vasohibin 为对照。 结果见图2，其中M泳道为DL 15000 DNA分子量标准， 1泳道为未加入SDS的Anti-vWF-Lip-Vasohibin, 2泳道为加入SDS的Anti-vWF -Lip-Vasohibin;从图可知，2泳道在分子量为5000 bp处有一明亮的DNA条带， 与p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin预期分子量大小一致，表明制备的Anti-vWF-Lip-Vasohibin 包裹有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin。
二、 Anti-vWF-Lip-Vasohibin对小鼠肺纤维化才莫型血管生成及肺纤维化形成 的影响
将8周龄的C57BL/6雄性小鼠(由中国人民解放军第三军医大学实验动物 中心提供)随^L分为3组生理盐水对照组(A组)、博来霉素组(B组)、博来 霉素+Anti-vWF-Lip-Vasohibin组(C组)；小鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，B组 按照每公斤体重1.5U的剂量气管内灌注博来霉素建立小鼠肺纤维化模型，A组 气管内灌注等体积生理盐水，C组在气管内灌注博来霉素前7天，按照每公斤体 重5mg的剂量雾化吸入Anti-vWF-Lip-Vasohibin;于灌注博来霉素后第28天处 死各组小鼠，采集以下标本:①用生理盐水行左肺支气管肺泡灌洗术，每次1 mL, 停留10秒后回抽，共灌洗5次，收集灌洗液(BALF),用300目尼龙网过滤除去上层粘液，备用；②取右肺组织，用体积百分浓度为10%的福尔马林溶液固 定，石蜡包埋，连续4^m切片，备用；③取左肺组织，迅速置温度为-80。C的 液氮中保存，备用。
1 、免疫组化染色观察肺组织中VEGF的定位和表达
将各组肺组织石蜡切片脱蜡至水，用质量百分浓度为3%的过氧化氢溶液在 室温下孵育15分钟以消除内源性过氧化物酶，用蒸馏水洗涤10分钟，置pH为 5的柠檬酸緩沖液中微波修复，自然冷却，滴加兔抗小鼠VEGF多克隆抗体，温 度4。C孵育过夜，PBS冲洗，再滴加山羊抗兔IgG,室温孵育2小时，PBS冲洗， DAB显色，蒸馏水洗涤，封片，显微镜下观察。结果见图3，从图可知，VEGF 主要定位于肺间质血管内皮细胞，其表达强度为A组〈C组〈B组，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能够降低肺间质血管生成。
2、 羟脯氨酸法测定肺组织中胶原蛋白的含量
取各组左肺组织标本，剪碎，脱脂，温度110。C烘干至恒重，称取2mg置 磨口试管中，加入浓度为6mol/L的HC1溶液lmL,温度125。C高压水解3小时， 冷却后加入浓度为6 mol/L的NaOH溶液中和，加水稀释至10 mL，取稀释液1 mL,用氯胺T法测定肺组织中羟脯氨酸的含量(羟脯氨酸为胶原蛋白的特征成 份，占胶原蛋白氨基酸总量的13.4%,比值恒定，故羟脯氨酸的含量直接反映胶 原蛋白的含量)。结果显示，各組小鼠肺组织中雍脯氨酸的含量分别为A组 (17.52±2.19)mg/g、 B组(37.83士3.76) mg/g、 C组(28,67士4.23) mg/g， B组显著高 于A组，而C组较B组明显降〗氐，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能够降低肺组 织中胶原蛋白的含量。
3、 HE染色XC察肺组织的病理改变
将各组肺组织石蜡切片常规行HE染色。结果见图4，从图可知，A组肺泡 腔及肺间质未见炎性细胞浸润，无肺泡壁水肿，未见肺泡炎及肺纤维化病变；B 组肺泡腔及肺间质有大量炎性细胞浸润，肺泡壁水肿，出现严重的肺泡炎改变， 肺纤维化形成；C组肺泡腔及肺间质有少量炎性细胞浸润，出现轻微的肺泡炎改变，有一定程度的肺纤维化形成；表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能够减少肺间质 炎性细胞的浸润并在一定程度上抑制肺纤维化形成。
4、 光镜下计数BALF中炎性细胞的数量
取各组BALF， 1000 r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀用PBS 100 mL 重悬，加入红细胞裂解液0.5 mL，室温静置8分钟，1000 r/min离心10分钟， 弃去上清液，沉淀用PBS0.5mL重悬，置光镜下进行炎性细胞计数。结果显示， 各组BALF中炎性细胞的数量分别为A组(2.4士0.3)xloVmL、 B组(24.3士 4.1)xl0VmL、 C组(15.2士2.7)xl()4/mL, B组显著高于A组，而C组较B组明显 降低，表明Anti-vWF- Lip-Vasohibin能够降低BALF中炎性细胞的数量。
5、 考马斯亮蓝法测定BALF中总蛋白的含量
肺毛细血管通透性增高是肺纤维化的基本病理改变，表现为大量蛋白渗出， 故BALF中总蛋白含量是肺纤维化的重要检测指标。取各组BALF, 1000 r/min 离心10分钟，取上清液，用考马斯亮蓝法测定总蛋白的含量。结果显示，各组 BALF中总蛋白含量分别为A组(0.12士0.05)mg/mL， B组(0.81士0.13)mg/mL, C 组(0.47士0.11)mg/mL, B组显著高于A组，而C组较B组明显降低，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能够降低BALF中总蛋白含量。
6、 ELISA法测定BALF中转化生长因子-pi (TGF-卩1)的含量
TGF-(31是很强的致纤维化细胞因子。取各组BALF ， 1000 r/min离心10分 钟，取上清液，用ELISA双抗体夹心法测定TGF-pi含量。结果显示，各组BALF 中TGF-卩1含量分别为A组(40.84 ±5.32) pg/mL、 B组(63.17土8.43) pg/mL、 C 组(57.62士5.31) pg/mL， B组显著高于A组，而C组较B组明显降低，表明Anti-vWF-Lip-Vasohibin能够降低BALF中TGF-卩1含量。
基于上述实验结果，可得出如下结论本发明的基于Vasohibin基因的免疫 脂质体能够有效降低博来霉素致小鼠肺纤维化模型的血管生成及肺纤维化形 成，可以作为活性物质，单独或与其它药物组成复方，再加入药学上可接受的 辅料，按照药学领域的常M4'J剂方法制成各种剂型的抗肺纤维化药物，通过适当途径给药，从而为肺纤维化的预防或治疗提供一种理想策略。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术 人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所 附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。<110> 中国人民解力文军第三军医大学
<120>基于Vasohibin基因的免疫脂质体及其制备方法和应用 <160> 3
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> 智人(homo sapiens)
<220> <221> <222>
CDS
(1)…(觀)
1
<400> atgccagggg gcggccaccg agagatgagg tttgtcaacc gtggccaaga ctgcccaaga cgcctggaag ttcUtgaaa accaaagagg aacagcatgc tacttccgcc agtcggcgcg ctggacttcg cagagcgtgt gacgtggagc atgcggctca gatgtUctt agacggccct taccagatcc
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aacgtccgct ctcagcccag cgtccccttc gtggaaacac ggccacagac tgtccctgag agggacacag caaggaaatg ttacctcacc ctcagggaac gctgggcatg egagctegtg gaagctgggc ctcggtgctg cgcccgcgac ccgg ccgcagtgaa ecttaaeggg
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1098
<210> 2 <211> 28 <212> DNA<213>人工序列 <220>
<223>人工序列的描述引物F
<400> 2
gcggccgcag atccccatac cgagtgtg 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物R
<400> 3
tctagagggc ctctttggtc atttcc 2权利要求
1、基于Vasohibin基因的免疫脂质体，其特征在于由Vasohibin基因重组真核表达载体、脂质体和抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体组成，所述脂质体内包裹Vasohibin基因重组真核表达载体，脂质体表面连接抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体。
2、 根据权利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体，其特征在于所述Vasohibin基因重组真核表达载体含有核苦酸序列如SEQ ID No.l所示的Vasohibin基因。
3、 根据权利要求2所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体，其特征在于所述Vasohibin基因重组真核表达载体采用p3xFLAG-CMV-14真核表达载体。
4、 根据权利要求2所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体，其特征在于所述脂质体由磷脂和胆固醇组成。
5、 根据权利要求4所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体，其特征在于所述磷脂为卵磷脂。
6、 权利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、 Vasohibin基因重组真核表达载体的构建提取人脾脏组织血管内皮细胞总RNA;合成PCR上下游引物上游引物序列如SEQ IDNo.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示；以人脾脏组织血管内皮细胞总RNA为模板进行Vasohibin基因的逆转录和PCR扩增，PCR反应条件为温度95。C预变性IO分钟，然后温度94。C变性1分钟、58。C退火1分钟、72。C延伸4分钟，共30个循环，最后温度72。C延伸IO分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化目的片段，即得Vasohibin基因；将所得Vasohibin基因用限制性内切酶NotI和XbaI进行双酶切，再与同样经NotI和Xbal双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，小量提取重组质粒，釆用双酶切法和PCR法鉴定阳性克隆质粒并测序，测序结果显示在p3xFLAG-CMV-14的Notl和Xbal位点之间插入有与SEQID No.l所示核苷酸序列完全一致者，即为构建成功的Vasohibin基因重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14八&sohibin;取含有p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin的大肠杆菌DH5a，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在温度37。C振摇培养，待培养液的OD49。固达到1~1.5，大量抽提重组质粒，用超纯水溶解制成p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，置温度-20。C保存，备用；b、 包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体的制备将卵磷脂和胆固醇用乙醚溶解制成溶液，在搅拌条件下向该溶液中緩慢加入p3xFLAG-CMV-14/Vasohibin溶液，超声振荡至水相和有机相混合均匀，减压蒸馏除去有机溶剂，离心，弃去上清液，收集沉淀，即得包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体；c、 包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体与抗第VID因子相关抗原单克隆抗体的连接将抗第VI1I因子相关抗原单克隆抗体经巯基化修饰后，与包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体在室温下振摇连接过夜，用琼脂糖凝胶柱分离除去游离的抗第WI因子相关抗原单克隆抗体，即得基于Vasohibin基因的免疫脂质体。
7、权利要求1所述的基于Vasohibin基因的免疫脂质体在制备抗肺纤维化药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了基于Vasohibin基因的免疫脂质体及其制备方法和应用，该免疫脂质体由Vasohibin基因重组真核表达载体、脂质体和抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体组成，脂质体内包裹Vasohibin基因重组真核表达载体，脂质体表面连接抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体；其制备方法包括Vasohibin基因重组真核表达载体的构建、包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体的制备、包裹Vasohibin基因重组真核表达载体的脂质体与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体的连接共3个步骤；该免疫脂质体可特异性作用于肺血管内皮细胞抑制血管生成和肺纤维化形成，靶向性强、毒副作用小，可用于制备抗肺纤维化药物。
文档编号A61K48/00GK101579315SQ20091010365
公开日2009年11月18日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者吴学玲, 崔社怀, 曹国强, 曌 杨, 杨雪梅, 王兴胜, 赵云峰 申请人:中国人民解放军第三军医大学