I型激肽释放酶在制备防治脑损伤后远隔部位继发性损害的药物中的新用途的制作方法

专利名称：I型激肽释放酶在制备防治脑损伤后远隔部位继发性损害的药物中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物化学领域。具体而言，涉及I型激肽释放酶(Human Kallikrein—l ) 的新医药用途，主要是在制备防治远隔部位脑损伤药物中的新用途。
背景技术：
局灶性脑损害是导致人类致残的主要原因，其中脑卒中、颅脑外伤和颅内肿瘤是导致 局灶性脑损害的主要疾病。在我国，仅脑卒中的年发病率就高达200/10万，患病人数达800 万人。新近发现，这些疾病除了引起局灶的神经元损害外，还可导致远离病灶部位的继发 性损伤，其中以大脑皮层损害后同侧丘脑腹后核(ventr叩osterior nucleus, VPN)发生 的继发性损伤最为常见。这种远隔损害在一定程度上影响神经功能恢复。
由于远隔损伤继发于脑卒中等脑损伤疾病，因此发生较原发损害晚，且进展缓慢，这 使得防治远隔部位继发性损伤的可行性高于防治梗死灶原发缺血性损伤，因此减轻远隔损 伤在脑卒中等脑损伤后期的神经功能恢复中起重要作用。
目前，国内外对卒中等原因引起的脑损伤主要治疗措施是针对病灶局部进行干预，以 抢救病灶边缘区尚未死亡的神经细胞，对局灶性脑损害引起的远隔部位脑损伤则甚少关注。 目前还缺乏防治远隔部位脑损伤的有效手段。
I型激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，它是从人尿中提取的糖蛋白，分子量约为54000道 尔顿，能催化激肽原生成激肽、扩张血管增加流量、改善血液循环的作用，还有增加红细 胞的变形性和抑制血小板聚集、延长在钙化时间，改善血液粘稠的作用。
目前，国外激肽释放酶治疗缺血性卒中的实验研究主要集中在基因水平。有研究表明 激肽释放酶基因治疗可提高局部缺血脑组织内胶质细胞的存活率，并能促进胶质细胞由缺 血半暗带向缺血核心区迁移，同时明显抑制脑缺血诱导的神经细胞凋亡。新近研究证实， 组织型激肽释放酶对超过缺血-再灌注时间窗的脑梗死大鼠仍有明确的神经保护作用。公开 号为CN1931362A、 CN1403156A和CN1706493A的发明专利公开了其在治疗和预防脑梗塞药 物中的应用、在制备急性冠脉疾病药物中的应用及在制备治疗糖尿病合并脑梗死药物中的 应用。
目前有关激肽释放酶的神经保护研究大多集中在脑梗死灶或损伤灶局部，没有观察对 远隔部位损害的作用。

发明内容
本发明的目的是提供I型激肽释放酶用于制备治疗和/或预防脑损伤后远隔部位继发性损 害的药物的新用途，同时提供一种用于治疗和/或预防脑损伤后远隔部位继发性损害的药物组 合物。
本发明人对I型激肽释放酶的药理作用逬行了深入研究，结果表明I型激肽释放酶对远隔 部位脑损伤具有显著的预防和治疗效果。 本发明的技术方案如下
I型激肽释放酶在制备防治脑损伤后远隔部位继发性损害的药物中的新用途。
所述的脑损伤包括由于外力作用或疾病作用所致的脑损伤，其中所述疾病包括脑卒中、 颅脑外伤、颅内肿瘤等。
所述防治脑损伤后远隔部位继发性损害的药物，包括含有有效活性成分的I型激肽释放酶 的药物组合物。I型激肽释放酶可以单独作为药物使用，但通常情况下，I型激肽释放酶是和 药学上可接受的辅料组成的药物组合物使用。
本发明所述药物组合物可以通过口服、舌下、经皮、肌肉、皮下、皮肤粘膜、静脉等途 径给药。该药物组合物可以以口服剂、注射剂、局部给药制剂形式存在；其中注射剂包括注 射液和冻干粉针剂，局部给药制剂包括贴剂、喷雾剂。
本发明所述的辅料可选自甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸、聚乙二醇、 氯化钠、葡萄糖中任意一种或几种组合。
本发明所述的药物组合物中，I型激肽释放酶与药用辅料重量比例为h 1 1: 12000;优 选比例为l: 1 1: 6000;较为优选比例为l: 1 1: 4000;最优选比例为l: 1 1: 2000。
本发明所述的药物组合物，其辅料可选自甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘 氨酸、聚乙二醇中一种或任意几种，该药物可以冻干粉针剂形式存在，在使用时溶解于灭菌 注射用水或其它注射用灭菌介质中。
本发明所述的药物组合物，其辅料也可选自甘露醇、聚乙二醇、氯化钠、葡萄糖中一种 或任意几种，该药物可以注射液形式存在。
应用I型激肽释放酶组合物治疗远隔部位脑损伤根据病情的严重程度、治疗时间而定，一
般静脉注射给药每次0.1-0.2PNA单位，每天给药1一2次，连续给药7天以上。
PNA的定义为在37°C， pH8. 0的条件下，1分钟水解底物Val — Leu—Arg—PNA释放1
U mol游离PNA,即为1PNA单位。本研究发现，I型激肽释放酶能够减轻远离梗死灶的同侧丘脑VPN内NeuN+神经元的丟失 及小胶质细胞的活化和增生，提示I型激肽释放酶治疗能减轻大脑皮层梗死同侧丘脑VPN的继 发性损伤。试验中虽I型激肽释放酶治疗时间仅仅6天，但其减轻同侧丘脑VPN继发性损伤的 作用持续至第28d时仍然存在，提示这种作用是一个持续性过程，有助于梗死后期受损神经功 能的恢复。
本发明人前期研究结果证实大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN内存在BrdU标记的新增殖细 胞。本发明进一步表明，在发生了继发性损伤的梗死侧丘脑VPN, I型激肽释放酶治疗在减少 神经元的丢失及小胶质细胞增生的同时，还显著增加了BrdU标记的细胞数目。这表明，I型激 肽释放酶不仅针对脑梗死灶周围，还对远离梗死灶的同侧丘脑VPN的细胞增殖有促进作用。
同时，本发明药理试验结果显示，I型激肽释放酶治疗组在大脑皮层梗死同侧丘脑VPN内 的nestin阳性细胞数量显著高于溶剂对照组，提示I型激肽释放酶治疗促进了脑梗死后同侧丘 脑VPN的nestin阳性细胞增殖，且这种促进作用随着脑梗死时间的延长逐渐增加。
综上所述，本发明人通过药效试验证实，I型激肽释放酶对远隔部位脑损伤具有显著的 预防和治疗效果。
I型激肽释放酶(又称人尿激肽原酶)，系从新鲜人尿中提取精制的一种由238个氨基酸组 成的糖蛋白，分子量约为54000道尔顿，具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血 流量、改善血液循环的作用，促进缺血区新生血管生成，并且还有增加红细胞的变形性和抑 制血小板聚集、延长再钙化时间、改善血液粘稠的作用。其一级结构式为Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-Cys-GlLrGln-His-Ser-Gln-Pro-Trp-GlirAla-Ala-Leu-Tyr-His-
30 40 Phe-Ser-Thr-Phe-Gln-Cys-Gly-Gly-lie-Leu-Val_His-Arg-Gin-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-
50 60 His-Cys-ne-Ser-Asp-Asn-Tyr-Gln-Leu-Trp-Leu-Gly-Arg-His-Asn-Leu-Phe-Asp-Asp-Glu-
70 CHO 80
Asn_Thr-Ala-Gin-Phe-Val-His-Val-Ser-Glu-Ser-Phe-Pro-His-Pro-Gly-Phe-Asn-Met-Ser-
CHO 90 100
Leu-Leu-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Tyr-Ser-His-Asp-Leu-Met-Leu-Leu-
110 120 Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-Ala-Asp-Thr-Ile-Thr-Asp-Ala-Val-Lys-Va卜Val-Glu-Leu-Pro-Thr-
130 140 Gln-Glu-Pro-Glu-Val-Gly-Ser-Thr-Cys-Leu-/Ua-Ser-Gly-Trp-Gly-Ser-Ile-Glu-Pro -Glu-
CHO 150 160
AsrrPhe-Ser-Phe-Pro-Asp-Asp-Leu-Gln-Cys-Val-Asp-Uu-Lys-Ile-Leu-Pro-AsrrAsp-Glu-
Giu 170 180 Cys__Lys_Ala-His-Val-Gln-Lys-Val-Thr-Asp-Phe-Met-Leu-Cys-Val-Gly-His-Leu-Glu_ I Lys_I
190 200
Gly-Gly-Lys-Asp-Thr-Cys-Val-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met-Cys-Asp-Gly-Va1-Leu_
210 220 Gln-Gly-Val-Thr-Ser-Trp-Gly-Tyr-Val-Pro-Cys-Gly-Thr-Pro-Asn-Lys-Pro-Ser-Val-Ala-
230
Val-Arg-VaKeu-Ser-Tyr-Val-Lys-T卬-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser 这种I型激肽释放酶通过以下方法制备
1. 新鲜的男性尿液中加入3%脱乙酰甲壳素吸附，调节pH至4.5 5.5,用1 25%的硫酸 铵溶液，调节pH至5. 0 13. 0洗脱，优选用8 12%的硫酸铵溶液,调节pH至7 9洗脱， 加入50%硫酸铵，沉淀蛋白，得到I型激肽释放酶粗品；此步骤的特点是洗脱条件温和，得 到的粗品质量好，有利于后面的纯化.
2. 将I型激肽释放酶溶解，经扩张床强阴离子交换(Streamline Q XL， GE Healthcare 公司)柱层析；再经苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl S印harose 6 Fast Flow, GE Healthcare公司)柱层析；I型激肽释放酶溶液6(TC恒温加热10小时，得到纯度较高的、 去除病毒的I型激肽释放酶中间体。
3. 将上述I型激肽释放酶中间体溶液上亲和层析柱，作为亲和层析的介质为苯扎嘧啶交联
6琼脂糖凝胶(Benzamidine S印harose 6B， GE Healthcare公司)，用平衡缓冲溶液冲洗柱 子，去除杂蛋白，使用的平衡缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐 缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液，优选，Tris-HCl缓冲溶液缓冲溶液的pH值为3 — 11，优 选，7 — 9。利用不同浓度的盐洗脱液，分别将I型激肽释放酶的两个组分洗脱下来，洗脱是 在电导值5-50ms/cra和20-80ms/cm分别进行；分别洗脱得到高分子组分和低分子组分，高 分子组分即本发明的I型激肽释放酶。


附图l I型激肽释放酶治疗减轻了大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN继发的神经元丢失。 A I型激肽释放酶治疗组MCA014d梗死侧丘脑VPN的NeuN免疫阳性神经元 B溶剂对照组大鼠梗死侧丘脑VPN的NeuN免疫阳性神经元
C A和B两组比较的直方图，横坐标天数；纵坐标梗死例VPN的NeuN+的细胞数；
I~~I为Kallikrein治疗组，CED为溶剂组 *:与I型激肽释放酶治疗组比较，/ <0.05;标尺=20(^ 1。
附图2 I型激肽释放酶治疔减轻了大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN的小胶质细胞活化及增
生
A I型激肽释放酶治疗组MCA014d梗死侧丘脑VPN的OX-42免疫阳性小胶质细胞 B溶剂对照组大鼠梗死侧丘脑VPN的OX-42免疫阳性小胶质细胞
CA、 B两组比较的直方图，横坐标天数；纵坐标梗死例VPN的OX-42+细胞(％);
□为Kallikrein治疗组，■为溶剂组 *:与I型激肽释放酶治疗组比较，pO.05;标尺=200|1111
附图3 I型激肽释放酶治疗促进了大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN的BrdU免疫阳性细胞增
殖
A I型激肽释放酶治疗组MCA014d梗死侧丘脑VPN的BrdU免疫阳性细胞 B溶剂对照组大鼠梗死侧丘脑VPN的BrdU免疫阳性细胞
CA、 B两组比较的直方图，横坐标天数；纵坐标梗死例VPN的BrdU+细胞数；
□为Kallikrein治疗组，,为溶剂组 *:与I型激肽释放酶治疗组比较，p<0.05;标尺二200nm。
7图4 I型激肽释放酶治疗促进了大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN的nestin免疫阳性细胞增
殖
A I型激肽释放酶治疗组MCA014d梗死侧丘脑VPN的nestin免疫阳性细胞 B溶剂对照组大鼠梗死侧丘脑VPN的nestin免疫阳性细胞
CA、 B为两组比较的直方图，横坐标天数；纵坐标梗死例VPN的nestin+细胞(％)
□为Kallikrein治疗组，CZ1为溶剂组 *:与I型激肽释放酶治疗组比较，p<0.05;标尺=200^!11。
具体实施例
以下通过具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例l I型激肽释放酶减轻大鼠梗死侧丘脑VPN的继发性损伤
动物分组雄性封闭群Sprague-Dawley大鼠共56只，按双肾双夹法复制易卒中型肾血管 性高血压模型(Zeng J， Zhang Y, Mo J， Su Z, Huang R. Two-kidney, two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats. Stroke, 1998, 29:1708-13)。 肾动脉狭窄术后 12w，选取血压稳定在180mmHg(lmmHg-0.133kPa)以上，且无自发卒中征象的高血压大鼠48
只，用随机数字表随机分为2组
(1) 局灶性大脑皮层梗死+I型激肽释放酶治疗组(简称I型激肽释放酶治疗组，24只)大
脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)术后24h， I型激肽释放酶治疗组连续 2d或6d经尾静脉注射溶解于0.5ml生理盐水的剂量为1.6xl(^PNAU/kg/d的激肽释放酶。
(2) 局灶性大脑皮层梗死+溶剂对照组(简称溶剂对照组，24只)溶剂对照组经尾静脉注 射等量等疗程的生理盐水。
模型制作所有大鼠先按Bederson等方法制作右侧局灶性大脑皮层梗死模型，简言之， 先用10n/。水合氯醛(3ml/kg)行腹腔麻醉，然后在手术显微镜下行右颞颧根部前方开颅术，挑开 硬脑膜，暴露右侧大脑中动脉，在其跨越嗅束、发出纹状体动脉后的远端用双极电凝器将其 凝闭，从而使其远端血流中断。术中和术后给大鼠灯照取暖使其体温保持在37士0.5'C。待麻 醉清醒后，将大鼠置于清洁级环境饲养。
检测指标和方法
(1)灌注、取材及制片大鼠分别于MCAO后3d、 7d、 14d和28d被处死(每组每个时间点6只大鼠)。用10。/。水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉后，经升主动脉快速灌注4"C肝素化的生理盐水 100ml，然后换4。C4。/。多聚甲醛-0.1mol/LPBS (pH=7.4) 200ml继续灌注，迅速开颅取脑，鼠 脑组织块置于上述固定液后固定6小时，然后依次置于4匸含15%、 20%、 30%的蔗糖(0.1M 磷酸缓冲液(PB)配制，pH=7.4)溶液中，分别至脑组织沉底。然后于恒温冰冻切片机(VT 2800N;Ldca, Heidelberg, Germany)行冰冻切片，片厚10nm，晾干后存放于-40。C低温冰箱。
(2) 脑梗死灶定位通过HE染色确定MCAO后脑梗死灶的定位。
(3) 免疫荧光法检测
主要材料 一抗分别为小鼠抗大鼠NeuN(l:1000, Chemicon International Inc, Temecula, CA， USA);小鼠抗大鼠OX-42(1:1000, Chemicon International Inc,Temecula,CA， USA)。 二 抗分别为山羊抗小鼠Alexa Flour 488 (1:200， Invitrogen, USA); Cy2-偶联的山羊抗小鼠及Cy3-偶联的山羊抗兔二抗(分别为1:200及1:400, Chemicon International Inc， Temecula， CA, USA); Cy2-偶联的驴抗绵羊及Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(分别为l:200及l:400, Jackson Immunoresearch Laboratories, USA)。
免疫染色方法和歩骤将切片采用单标或双标免疫荧光法行免疫组织化学检査。
1) 从-4(TC冰箱取出冰冻切片，置于室温30min复温。
2) 切片用0.01M (PBS， pH=7.4)漂洗3次，每次5min。
3) 滴加正常山羊或驴血清，室温孵育lh，以阻断非特异性抗原抗体反应。lh后将血清倾去不 漂洗。
4) 滴加一抗分别为小鼠抗大鼠NeuN(l:1000);小鼠抗大鼠OX-42(l:1000)，于4'C孵育过 夜。
5) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
6) 滴加二抗分别为驴抗绵羊AlexaFlour488二抗(l:200)/Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(1:400); 山羊抗小鼠Alexa Flour 488二抗(l:200)/Cy3-偶联的山羊抗兔二抗(1:400);山羊抗小鼠Alexa Flour 488(1:200);室温避光孵育1.5h。
7) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
8) 荧光封片剂封片，避光后通过荧光显微镜(01ympusBX51,Japan)采集图象。阴性对照片均 采用0.01MPBS作为一抗的替代物。
(4) 细胞计数
MCAO组大鼠脑梗死后梗死侧丘脑VPN内VPN的NeuN+细胞数目在x20倍物镜下通过荧光显微镜(01ympusBX51， Japan)采集，结果以NeuN+细胞数目/片来表达。OX-42免疫染色在 xlO倍物镜下通过荧光显微镜采集，结果以OX-42十染色百分比/片来表达。全部图像分析通过 NIH ImageJ 1.38软件完成。
(5)统计学处理
全部数据均采用SPSS for windows 13.0进行统计分析，数据用均数±标准差表示，计量资 料行单因素方差分析(ANOVA)后通过t检验比较不同时间点各组间差异的显著性。p<0.05 认为差异有统计学意义。 试验结果
1 、 MCAO后的梗死灶定位
HE染色显示，I型激肽释放酶治疗组和溶剂对照组大鼠的梗死灶均局限于右侧颞顶叶皮 层，且大小较为一致，梗死范围均不涉及丘脑。
2 、 I型激肽释放酶治疗减少了脑梗死后同侧丘脑VPN的神经元丢失免疫荧光法检测发现， 在MCAO术后不同时间点，激肽释放酶治疗组梗死侧丘脑VPN内NeuN标记的神经元数目比溶 剂对照组大鼠显著增加，即激肽释放酶治疗组梗死侧丘脑VPN内神经元丢失的程度较溶剂对 照组减轻，两组比较差异具有统计学意义(见图l)。
3、 I型激肽释放酶治疗减轻了梗死侧丘脑VPN的小胶质细胞活化和增生
在MCAO术后不同时间点，I型激肽释放酶治疗组和溶剂对照组梗死侧丘脑VPN均出现大 量的OX-42免疫阳性小胶质细胞。这些小胶质细胞在形态上表现为肥大的胞体和增厚的突起， 即呈典型的的活化状态；同时在数量上呈明显增生，且随着梗死时间的延长越发显著。至术 后4周时，活化和增生的OX-42免疫阳性的小胶质细胞几乎布满MCAO大鼠整个梗死侧的丘脑 VPN。然而，与溶剂对照组大鼠相比，I型激肽释放酶治疗组梗死侧丘脑VPN内OX-42免疫阳 性的小胶质细胞无论在活化程度上还是在增生的数量上均明显减轻，两组比较差异具有统计 学意义(见图2)。
激肽释放酶是丝氨酸蛋白酶超家族成员，是KKS (kallikreinkininsystem，激肽释放酶-激 肽系统)中的核心部分，能催化激肽原生成激肽，而激肽与激肽受体结合产生生物学效应。 新近研究证实，组织型激肽释放酶对缺血性卒中有明确的神经保护作用。激肽释放酶基因治 疗可提高局部缺血脑组织内胶质细胞的存活率，并能促进胶质细胞由缺血半暗带向缺血核心 区迁移，同时明显抑制脑缺血诱导的神经细胞凋亡；能显著减少单核/巨噬细胞在缺血脑组织 的聚集，有效抑制卒中诱发的局部炎症反应；此外，还能抑制氧化应激，最终减少脑梗死体积，改善神经功能。但值得指出的是，既往研究关注的仅是激肽释放酶对脑梗死灶及周边局 部组织的神经保护作用，激肽释放酶是否能对脑梗死后远隔部位的继发性损伤产生影响并不 清楚。本研究发现，I型激肽释放酶能够减轻远离梗死灶的同侧丘脑VPN内NeuN+神经元的丢 失及小胶质细胞的活化和增生，提示I型激肽释放酶治疗能减轻大脑皮层梗死同侧丘脑VPN的 继发性损伤。由于梗死灶周脑组织与远隔部位的病理改变及病理生理机制相似，我们推测，I 型激肽释放酶治疗对梗死侧丘脑VPN继发性损伤的改善作用可能也与抑制神经细胞凋亡、抑 制炎症反应及氧化应激等有关。此外，虽然I型激肽释放酶治疗时间仅仅6d，但其减轻同侧丘 脑VPN继发性损伤的作用持续至第28d时仍然存在，提示这种作用是一个持续性过程，有助于 梗死后期受损神经功能的恢复。
实施例2 I型激肽释放酶促进梗死侧丘脑VPN的BrdU标记的细胞增殖
动物分组雄性封闭群Sprague-Dawley大鼠共56只，按双肾双夹法复制易卒中型肾血管 性高血压模型(Zeng J， Zhang Y, Mo J, Su Z， Huang R. Two-kidney, two clip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-prone rats. S/n A:e, 1998, 29:1708-13)。'肾动ftk多夹窄术后 12w,选取血压稳定在180mmHg(lmmHgK).133kPa)以上，且无自发卒中征象的高血压大鼠48
只，用随机数字表随机分为2组
(1) 局灶性大脑皮层梗死十I型激肽释放酶治疗组(简称激肽释放酶治疗组，24只)
MCAO术后24h， I型激肽释放酶治疗组连续2d或6d经尾静脉注射溶解于0.5m性理盐水的剂量 为1.6x l(T2 PNAU/kg/d的激肽释放酶。
(2) 局灶性大脑皮层梗死+溶剂对照组(简称溶剂对照组，24只)溶剂对照组经尾静脉 注射等量等疗程的生理盐水。
模型制作所有大鼠先按Bederson等(Bederson JB， Pitts LH, Tsuji M， Mshimura MC， Davis RL, Bartkowski H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. S"o&， 1986,17:472-76)方法制作右侧局灶性大脑皮层梗死模型， 简言之，先用10W水合氯醛(3ml/kg)行腹腔麻醉，然后在手术显微镜下行右颞颧根部前方开颅 术，挑开硬脑膜，暴露右侧大脑中动脉，在其跨越嗅束、发出纹状体动脉后的远端用双极电 凝器将其凝闭，从而使其远端血流中断。术中和术后给大鼠灯照取暖使其体温保持在 37±0.5°C。待麻醉清醒后，将大鼠置于清洁级环境词养。
检测指标和方法(1 )BrdU腹腔注射两组大鼠均在MCAO后24h起连续2d或6d经腹腔注射BrdU( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 50mg/kg),每天2次，用以标记新增殖的细胞。
(2) 灌注、取材及制片大鼠分别于MCAO后3d、 7d、 14d和28d被处死(每组每个时间点6 只大鼠)。用10o/。水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉后，经升主动脉快速灌注4'C肝素化的生理盐水 100ml，然后换4。C4。/。多聚甲醛-0.1mol/LPBS (pH=7.4) 200ml继续灌注，迅速开颅取脑，鼠 脑组织块置于上述固定液后固定6小时，然后依次置于4°(:含15%、 20%、 30%的蔗糖(0.1M 磷酸缓冲液(PB)配制，pH=7.4)溶液中，分别至脑组织沉底。然后于恒温冰冻切片机(VT 2800N;Leica, Heidelberg, Germany)行冰冻切片，片厚10pm，晾干后存放于-40。C低温冰箱。
(3) 脑梗死灶定位通过HE染色确定MCAO后脑梗死灶的定位。
(4) 免疫荧光法检测
主要材料 一抗分别为小鼠抗大鼠BrdU(l: 1000， Sigma-Aldrich, St. Louis, MO， USA);绵 羊抗大鼠BrdU(l:500,Abcam， UK)。 二抗分别为山羊抗小鼠Alexa Flour 488 (1:200, Invitrogen, USA); Cy2-偶联的山羊抗小鼠及Cy3-偶联的山羊抗兔二抗(分别为1:200及1:400， Chemicon International Inc, Temecula， CA, USA); Cy2-偶联的驴抗绵羊及Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(分别 为1:200及1:400, Jackson Immunoresearch Laboratories, USA)。
免疫染色方法和步骤将切片采用单标或双标免疫荧光法行免疫组织化学检查。
1) 从-40'C冰箱取出冰冻切片，置于室温30min复温。
2) 检测BrdU的切片则先浸泡于37'C2NHC1中30min,随后浸泡于室温0.1M硼酸溶液 (pH=8.5)10min，再用0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
3) 滴加正常山羊或驴血清，室温孵育lh，以阻断非特异性抗原抗体反应。lh后将血清倾 去不漂洗。
4) 滴加一抗分别为绵羊抗大鼠BrdU(l:500)/小鼠抗大鼠nestiii(l:1000);绵羊抗大鼠BrdU/ 小鼠抗大鼠NeuN(l:1000);小鼠抗大鼠BrdU(l:1000)/兔抗大鼠GFAP(1:1000);小鼠抗大鼠 BrdU(l:1000)/兔抗大鼠laminin(1:400)，于4。C孵育过夜。
5) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
6) 滴加二抗分别为驴抗绵羊Alexa Flour 488 二抗(l:200)/Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(1:400); 山羊抗小鼠Alexa Flour 488 二抗(1:200)/Cy3-偶联的山羊抗兔二抗(1:400);山羊抗小鼠Alexa Flour 488(1:200);室温避光孵育1.5h。
7) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
128)荧光封片剂封片，避光后通过荧光显微镜(01ympus BX51, Japan)采集图象。阴性对照片 均采用0.01MPBS作为一抗的替代物。
(5) 细胞计数:
MCAO组大鼠脑梗死后梗死侧丘脑VPN内VPN的BrdU+细胞数目在x20倍物镜下通过荧 光显微镜(01ympusBX51，Japan)采集，结果以BrdU+细胞数目/片来表达。全部图像分析通过 NIHImageJ 1.38软件完成。
(6) 统计学处理
全部数据均采用SPSS for windows 13.0进行统计分析，数据用均数±标准差表示，计量资 料行单因素方差分析(ANOVA)后通过t检验比较不同时间点各组间差异的显著性。p<0.05 认为差异有统计学意义。 试验结果
1. MCAO后的梗死灶定位
HE染色显示，激肽释放酶治疗组和溶剂对照组大鼠的梗死灶均局限于右侧颞顶叶皮 层，且大小较为一致，梗死范围均不涉及丘脑。
2. I型激肽释放酶治疗促进了梗死侧丘脑VPN内BrdU标记的细胞增殖
在MCAO术后7d，无论是I型激肽释放酶治疗组还是溶剂对照组，梗死侧丘脑VPN内均出 现BrdU标记的新增殖细胞，至术后14d时细胞增殖更加明显，但28d时仅可见极少量的BrdU阳 性细胞。在术后各时间点，I型激肽释放酵治疗组梗死侧丘脑VPN内BrdU标记的细胞数显著高 于同期溶剂对照组，两组比较差异具有统计学意义(见图3)。
BrdU是DNA前体脱氧胸腺嘧啶核苷的类似物，由于能竞争性地掺入S期细胞单链DNA核 苷酸序列替代胸腺嘧啶而被广泛用作细胞增殖的标记物。我们前面的研究首次证实，大脑皮 层梗死后同侧丘脑VPN内存在BrdU标记的新增殖细胞。本研究进一步表明，在发生了继发性 损伤的梗死侧丘脑VPN， I型激肽释放酶治疗在减少神经元的丢失及小胶质细胞增生的同时， 还显著增加了BrdU标记的细胞数目。本研究表明，I型激肽释放酶不仅针对脑梗死灶周围，还 对远离梗死灶的同侧丘脑VPN的细胞增殖有促进作用。这种作用在MCAO术后7d出现，14d 时最为明显，术后28d时无论I型激肽释放酶组还是溶剂对照组，梗死侧丘脑VPN内BrdU标记 的细胞均罕见，这可能与本试验采取在MCAO术后24h起连续6天经腹腔注射BrdU来标记新增 殖的细胞，而梗死后期BrdU标记的细胞已发生分裂、消亡有关。实施例3 I型激肽释放酶促进梗死侧丘脑VPN的nestiii阳性细胞的增殖
动物分组雄性封闭群Spmgue-Dawley大鼠共56只，按双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高
血压模型(Zeng J, Zhang Y， Mo J, Su Z， Huang R. Two-kidney, two clip renovascular
hypertensive rats can be used as stroke-prone rats. 5Vrofe, 1998, 29:1708-13)。肾动脉狭窄术后
12w，选取血压稳定在180mmHg(lmmHg-0.133kPa)以上，且无自发卒中征象的高血压大
鼠48只，用随机数字表随机分为2组
(1) 局灶性大脑皮层梗死+I型激肽释放酶治疗组(简称激肽释放酶治疗组，24只) MCAO术后24h， I型激肽释放酶治疗组连续2d或6d经尾静脉注射溶解于0.5ml生理盐水的剂量 为1.6x 10—2 PNAU/kg/d的激肽释放酶。
(2) 局灶性大脑皮层梗死+溶剂对照组(简称溶剂对照组，24只)溶剂对照组经尾静脉 注射等量等疗程的生理盐水。
模型制作所有大鼠先按Bederson等(Bederson JB， Pitts LH, Tsuji M, Nishimura MC, Davis RL， Bartkowski H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. S/ra/ce, 1986, 17:472-76)方法制作右侧局灶性大脑皮层梗死模型， 简言之，先用l(^水合氯醛(3ml/kg)行腹腔麻醉，然后在手术显微镜下行右颞颧根部前方开颅 术，挑开硬脑膜，暴露右侧大脑中动脉，在其跨越嗅束、发出纹状体动脉后的远端用双极电 凝器将其凝闭，从而使其远端血流中断。术中和术后给大鼠灯照取暖使其体温保持在 37士0.5'C。待麻醉清醒后，将大鼠置于清洁级环境饲养。
检测指标和方法
(1)灌注、取材及制片大鼠分别于MCAO后3d、 7d、 14d和28d被处死(每组每个时间点6 只大鼠)。用10。/。水合氯醛(3ml/kg)腹腔麻醉后，经升主动脉快速灌注4'C肝素化的生理盐水 100ml，然后换4。C4。/。多聚甲醛-0.1mol/LPBS (pH=7.4) 200ml继续灌注，迅速开颅取脑，鼠 脑组织块置于上述固定液后固定6小时，然后依次置于41:含15%、 20°/。、 30%的蔗糖(0.1M 磷酸缓冲液(PB)配制，pH=7.4)溶液中，分别至脑组织沉底。然后于恒温冰冻切片机(VT 2800N; Leica， Heidelberg, Germany)行冰冻切片，片厚10pm，晾干后存放于-40。C低温冰箱。
(3)脑梗死灶定位通过HE染色确定MCAO后脑梗死灶的定位。(4) 免疫荧光法检测
主要材料 一抗为小鼠抗大鼠nestin(l:1000, ChemiconInternational Inc, Temecula， CA, USA); 二抗分别为山羊抗小鼠Alexa Flour 488 (1:200, Invitrogen, USA); Cy2-偶联的山羊抗小 鼠及Cy3-偶联的山羊抗兔二抗(分别为l:200及1:400, Chemicon International Inc， Temecula, CA, USA); Cy2-偶联的驴抗绵羊及Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(分别为l:200及l:400, Jackson Immunoresearch Laboratories, USA)。
免疫染色方法和步骤将切片采用单标或双标免疫荧光法行免疫组织化学检查。
1) 从-40'C冰箱取出冰冻切片，置于室温30min复温。
2) 切片用0.01M (PBS， pH=7.4)漂洗3次，每次5min。
3) 滴加正常山羊或驴血清，室温孵育lh，以阻断非特异性抗原抗体反应。lh后将血清倾 去不漂洗。
4) 滴加一抗绵羊抗大鼠BrdU(l:500)/小鼠抗大鼠nestin(l:1000)，于4'C孵育过夜。
5) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
6) 滴加二抗为驴抗绵羊AlexaFlour 488 二抗(1:200)/Cy3-偶联的驴抗小鼠二抗(1:400);室 温避光孵育1.5h。
7) 0.01MPBS漂洗3次，每次5min。
8) 荧光封片剂封片，避光后通过荧光显微镜(Olympus BX51， Japan)采集图象。阴性对照片 均采用0.01MPBS作为一抗的替代物。
(5) 细胞计数
MCAO组大鼠脑梗死后梗死侧丘脑VPN内VPN的Nestin免疫染色在xl0倍物镜下通过荧 光显微镜采集，结果以nestin染色百分比/片来表达。全部图像分析通过NIH ImageJ 1.38软件完成。
(6) 统计学处理
全部数据均采用SPSS for windows 13.0进行统计分析，数据用均数±标准差表示，计量资 料行单因素方差分析(ANOVA)后通过t检验比较不同时间点各组间差异的显著性。； <0.05 认为差异有统计学意义。
试验结果 1、MCAO后的梗死灶定位
HE染色显示，激肽释放酶治疗组和溶剂对照组大鼠的梗死灶均局限于右侧颞顶叶皮层，且大小较为一致，梗死范围均不涉及丘脑。
2 、 I型激肽释放酶治疗促进了梗死侧VPN内nestin标记的细胞增殖
在MCAO术后7d，激肽释放酶治疗组和溶剂对照组的梗死侧丘脑VPN内均出现零星散在 的nestin+细胞，并且在术后14d时增殖明显，至28d时达到高峰。但在术后各时间点，激肽释 放酶治疗组梗死侧丘脑VPN内nestin+细胞数显著高于同期溶剂对照组，两组比较具有统计学 意义(见图4)。
Nestin，中文名祌经巢蛋白，是目前公认的一种神经干细胞的标记物。近年来有研究认为 神经轴索损伤后也表达nestin阳性。我们前面的研究首次发现，大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN 内存在nestin阳性细胞，并且部分nestin阳性细胞与BrdU阳性细胞共表达，提示同侧丘脑VPN 存在神经再生现象。本研究发现，I型激肽释放酶治疗组在梗死侧丘脑VPN内的nestin阳性细 胞数量显著高于溶剂对照组，提示激肽释放酶治疗促进了脑梗死后同侧丘脑VPN的nestin阳性 细胞增殖。值得一提的是，这种促进作用随着脑梗死时间的延长逐渐增加，在本实验观察的 时间内以MCAO术后28d时为最明显。研究发现，梗死侧丘脑VPN内的nestin阳性细胞在形态 上与GFAP阳性的星型胶质细胞非常相似，而梗死侧丘脑VPN内胶质细胞的增殖也是随着脑梗 死时间的延长逐渐增加的，由此我们推测，VPN内nestin阳性细胞的增殖，可能与脑梗死后同 侧丘脑VPN的继发性损伤以胶质细胞的活化及增殖为突出特征有关，但确切机制尚不清楚。
实施例4 I型激肽释放酶注射液的制备
取过滤灭菌的I型激肽释放酶15 PNA单位，调节PH至中性，加注射用水至50毫升， 加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装100个安瓿中，熔封，即得I型激肽释放酶的注射液。
实施例5 I型激肽释放酶冻干粉针剂的制备
取过滤灭菌的I型激肽释放酶15 PNA单位，加1. 5克甘露醇、0. 5克柠檬酸钠溶解， 调节PH至中性，加注射用水至50毫升，无菌过滤，分装100个安瓿中，无菌条件下冷冻 干燥，即得I型激肽释放酶的冻干粉针。
权利要求
1. I型激肽释放酶在制备防治脑损伤后远隔部位继发性损害的药物中的新用途。
2. 根据权利要求1所述的新用途，其特征在于脑损伤包括由于外力作用或疾病作用所致的 脑损伤，其中所述疾病包括脑卒中、颅脑外伤、颅内肿瘤。
3. 根据权利要求1所述的新用途，其特征在于所述药物包括含有有效活性成分的I型激肽 释放酶的药物组合物。
4. 根据权利要求3所述的新用途，其特征在于所述药物组合物包括由I型激肽释放酶和药 学上可接受的辅料组成。
5. 根据权利要求3或4所述的新用途，其特征在于所述药物组合物是通过口服、舌下、经 皮、肌肉、皮下、皮肤粘膜、静脉途径给药。
6. 根据权利要求3或4所述的新用途，其特征在于所述药物组合物是以口服剂、注射剂、 局部给药制剂形式存在；其中注射剂包括注射液和冻干粉针剂，局部给药制剂包括贴剂、 喷雾剂。
7. 根据权利要求3到6任一所述的新用途，其特征在于所述的辅料选自甘露醇、右旋糖苷、 水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸、聚乙二醇、氯化钠、葡萄糖中任意一种或几种组合。
8. 根据权利要求4所述的新用途，其特征在于I型激肽释放酶与药用辅料重量比例为1:1 1: 12000。
9. 根据权利要求8所述的新用途，其特征在于I型激肽释放酶与药用辅料重量比例为1:1 1: 2000。
10. 根据权利要求8或9所述的新用途，其特征在于辅料选自甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、 柠檬酸钠、甘氨酸、聚乙二醇，该药物以冻干粉针剂形式存在。
11. 根据权利要求8或9所述的新用途，其特征在于辅料选自甘露醇、聚乙二醇、氯化钠、 葡萄糖，该药物以注射液形式存在。
全文摘要
本发明提供一种I型激肽释放酶用于制备预防和治疗脑损伤后远隔部位继发性损害的药物的新用途，同时提供一种用于预防和治疗脑损伤后远隔部位继发性损害的药物组合物。该药物组合物包括I型激肽释放酶和药学上可接受的辅料，可以制成注射剂使用，包括冻干粉针剂和注射液。
文档编号A61P25/00GK101530611SQ20091013186
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者莉 凌, 曾进胜 申请人:中山大学附属第一医院