专利名称：一种氨基糖苷类抗生素的制备方法
技术领域：
一种氨基糖苷类抗生素在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用，属于氨基糖苷类抗生素应用技术领域。本发明涉及具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构的氨基糖苷类抗生素的1-N-酰化衍生物及其在制备抗耐药菌药用组合物中的应用。
背景技术：
文献1 CN1420120A， 文献2 ZL93112412.3， 文献3 ZL01133701.X， 文献4 USP4117221， 文献5 USP4230847， 文献6 USP5442047。
自氨基糖苷类抗生素上市以来，其广谱抗菌活性尤其是对革兰氏阴性菌显示强大的抗菌作用、与临床上广泛使用的β-内酰胺类抗生素有很好的协同作用以及它们主要的耳、肾毒性有可预见性，从而成为临床上不可或缺的一类抗生素。
为了降低毒性以及增强对耐药菌的活性，也开发了一些半合成氨基糖苷类抗生素，如阿贝卡星、异帕米星、依替米星、奈替米星，它们的结构式如下 AHB＝(s)-4-氨基-2-羟基丁酰基， AHP＝(s)-3-氨基-2-羟基丙酰基， 阿贝卡星(1-N-AHB-地贝卡星)
异帕米星(1-N-AHP-庆大霉素B)
依替米星(1-N-乙基庆大霉素C1a)
奈替米星(1-N-乙基西索米星)
近年来，随着各类抗菌药物的广泛使用，诱导出许多耐药菌株，导致产生了许多令临床医生难以有效治疗的感染病症，尤其是对各种抗菌剂显示高度、多重耐药的甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、甲氧西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)等，成为临床上感染症治疗中的很大障碍。
上述开发的半合成氨基糖苷类抗生素，除了阿贝卡星对MRSA有明确的作用外，其余产品对MRSA的抗菌效果均不理想。
文献4中公开了许多1-N-庆大霉素及西索米星等酰基衍生物，还报告了这些酰化衍生物对耐药菌有良好的抗菌活性，可以制成商业用的抗生素制剂。但文献并未公开这些衍生物对MRSA及MRCNS等高度耐药菌的抗菌活性，且文献所公开的衍生物中并不是所有化合物对MRSA都有良好的抗菌活性，例如1-N-AHP庆大霉素B(异帕米星)对MRSA就没有好的抗菌活性。因此，上述专利文献并不能覆盖本专利的发明构思。
文献5公开了采用二价金属离子络合保护，合成除1-NH2位呈游离状态的保护中间体，进一步在1-N位进行专一性衍生化的方法，文献6公开了用锌离子络合，甲酰基保护中间体，合成异帕米星的新方法。但并未覆盖本发明的合成方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基糖苷类抗生素作为制备治疗耐药菌感染药物的应用，要解决的问题在于提供对MRSA及MRCNS有强大抗菌且生产成本低的氨基糖苷类抗生素。
为了解决这个问题，发明人仔细比较了临床应用的具有不同结构特征的氨基糖苷类抗生素对临床分离的病原菌的抗菌活性。其中， 依替米星的结构特征1-N-乙基，2′-NH2，3′、4′-二去氧，3″-N-CH3， 异帕米星的结构特征1-N-AHP，2′-羟基，3′、4′-二羟基，3″-N-CH3， 阿米卡星的结构特征1-N-AHB，2′-羟基，3′、4′-二羟基，3″-NH2， 阿贝卡星的结构特征1-N-AHB，2′-NH2，3′、4′-二去氧，3″-NH2， 奈替米星的结构特征1-N-乙基，2′-NH2，3′、4′-二去氧，3″-N-CH3，4′＝5′的双键结构， SK-701＝1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a； SK-702＝1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a。
SK-701的结构特征1-N-AHP，2′-NH2，3′、4′-二去氧，3″-N-CH3， SK-702的结构特征1-N-AHP，2′-NH2，3′、4′-二去氧，3″-NH2。
表1.各种不同结构特征的抗生素对MRSA及MRCNS的抗菌活性
通过比较，可以看到 1.4′＝5′的双键结构(奈替米星)不是抗生素具有抗MRSA的必须结构； 2.1-N酰化(阿米卡星、异帕米星)也不是抗生素具有抗MRSA的唯一 必须结构； 3.1-N烷基化的产物(奈替米星、依替米星)抗MRSA作用不大。
由此，我们惊奇地发现以具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的抗生素为前体合成的1-N酰基衍生物具有显著的抗MRSA和MRCNS活性，从而完成了本发明。
本发明提供了具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的氨基糖苷类抗生素1-N-酰基衍生物作为制备治疗耐药菌感染药用制剂的应用。
本发明的技术方案一种氨基糖苷类抗生素在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用，该氨基糖苷类抗生素具有如下1-N酰化衍生物结构
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，或(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO， R1＝H或CH3，R2＝H或CH3。
该氨基糖苷类抗生素是R＝(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，R1＝H，R2＝CH3，结构如下
即1-N-(s)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用。或该氨基糖苷类抗生素是R＝(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，R1＝R2＝H，结构如下
即为1-N-(s)-3-氨基-2-羟基丙酰-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用。
所述的耐药菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，或耐药菌是耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌。
所述药用组合物，由作为活性成分的该1-N酰化衍生物或其药用盐与药用载体组成，并且按该1-N酰化衍生物或其药用盐为0.01％～99.99％与含药用载体为99.99％～0.01％的重量配比组成。
所述药用组合物的制备方法，是将有效量的1-N酰化衍生物或其药用盐与药用载体相混和，经常规的分装、灭菌而制得。
所述药用组合物为片剂、水针剂、粉针剂、眼药水、气雾剂、霜剂、或气溶胶剂。
如下结构的氨基糖苷类抗生素化合物的制备方法
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，或(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO R1＝H或CH3， 包括如下步骤 1)用二价金属离子使母核化合物1位氨基呈络合态后进行甲酰化反应，用作络合的二价金属离子是锌离子、钴离子或镍离子； 2)脱除金属离子； 3)在1-N位进行R基衍生化反应； 4)专一性去除甲酰化保护基； 5)对目标产物进行纯化，产物纯化采用阳离子交换树脂柱层析方法，用不同浓度的氨水溶液进行洗脱；或产物纯化采用吸附树脂柱层析方法，用不同浓度的乙醇、甲醇或丙酮水溶液进行洗脱。
如下结构的氨基糖苷类抗生素化合物的制备方法
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，或(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO， R1＝H或CH3， 包括如下步骤 1)母核化合物用碘或碘化物实现3″-N脱甲基反应并经纯化后得到3″-N-脱甲基产物； 2)用二价金属离子使1位氨基呈络合态后进行甲酰化反应，用作络合的二价金属离子是锌离子、钴离子或镍离子； 3)脱除金属离子； 4)在1-N位进行R基衍生化反应； 5)专一性去除甲酰化保护基； 6)对目标产物进行纯化，产物纯化采用阳离子交换树脂柱层析方法，用不同浓度的氨水溶液进行洗脱；或产物纯化采用吸附树脂柱层析方法，用不同浓度的乙醇、甲醇或丙酮水溶液进行洗脱。
本发明的有益效果 阿贝卡星具有同样的结构特征，也有显著的抗MRSA活性。但阿贝卡星是卡那霉素类氨基糖苷类抗生素，而且它采用复杂的化学方法进行3′、4′-双脱氧，合成路线长，工艺复杂，成本高。
为经济有效地实现本发明，本发明以天然来源、经济易得的具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的抗生素作为原料合成1-N-酰化衍生物，使得本发明具有很好的工业化应用价值。
本发明选择天然来源的具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的庆大霉素C1a为原料合成的1-N-酰化衍生物为 SK-701＝1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a； SK-702＝1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a。
但不仅限于此，1-N-(S)-4-氨基-2-羟基丁酰基衍生物以及1-N-乙酰衍生物也能采用本发明提供的方法进行合成。
SK-701和SK-702的结构测定数据如下 1.MSSK-701，M+1＝537，它的分子量为536 SK-702，M+1＝523，它的分子量为522 2.13C-NMR测定结果见表2. 表2
3.1H-NMR特征数据见表3 表3
本发明公开的具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的氨基糖苷类抗生素1-N-酰基衍生物不但显示出对MRSA和MRCNS有很好的抗菌作用，而且还显示出对革兰氏阴性菌也有良好的抗菌作用。
细菌的药敏测定方法按CLSI(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)推荐的琼脂双倍稀释法，进行样品对临床分离菌的最低抑菌浓度(MIC)的测定。抗菌药物浓度为128mg/L-0.06mg/L 12个浓度双倍稀释度。细菌接种量为104CFU/点。质控菌株为金黄色葡萄球ATCC29213(MSSA)、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞ATCC27853.阿米卡星的药敏判断标准按CLSI2007年版标准。试验结果悬表4-8。
表4 SK-701，SK-702等试验药对需氧革兰氏阳性球菌的药敏(MICmg/L)
表5 SK-701，SK-702等试验药对需氧革兰氏阴性杆菌的药敏(MICmg/L)
表6-1 SK-701和SK-702等试验药对对临床分离菌300株的累计抑菌率(％)
表6-2 SK-701和SK-702等试验药对对临床分离菌300株的累计抑菌率(％)
SK-701和SK-702的初步的急性毒性(LD50)试验结果表明，SK-701和SK-702的LD50相近，为50-75mg/Kg，在氨基糖苷类抗生素临床使用许可的范围内。
可以看到，SK-701和SK-702具有显著的抗MRSA和MRCNS活性，LD50结果在氨基糖苷类抗生素临床应用许可的范围内，因此可用于制备对耐药菌感染有治疗作用的药剂。
合成方法1
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO(AHP)或(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO(AHB) R1＝H或CH3 合成方法2
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO(AHP)，(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO(AHB)；R1＝H或CH3 合成方法3
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO(AHP)，(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO(AHB) R1＝H或CH3 本发明为了专一性在1-N位进行目标侧链的修饰，采用甲酰基保护中间体，甲酰基的供体为2-甲酰巯基噻唑，其结构式如下
本发明在将这些衍生物用于制备对耐药菌感染治疗有效的药用组合物时，先用酸中和成易溶于水的盐，其中酸可以是无机酸如盐酸、磷酸、硫酸等，也可以是有机酸如马来酸、乳酸、酒石酸，最常用的是用硫酸制成的硫酸盐。
本发明公开的这些药用制剂的制备方法，具体的方法是将具有2′-NH2-3′、4′-二去氧结构特征的氨基糖苷类抗生素1-N-酰基衍生物或它们的药用盐作为活性成分与药物上可应用的载体如缓冲剂、润滑剂、崩解剂、粘合剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、等渗剂等，以重量比为活性成分占0.01-99.99％与载体占99.99-0.01％的比例配制，并经封装、灭菌而成。
本发明药用制剂的使用方式、剂量与其它氨基糖苷类抗生素相似，例如，最常用的应用方式为注射用，其剂量为50-800mg/天，分1-3次使用。
具体实施例方式 实施例11-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a的合成 1)3、2′、6′-三-N-甲酰基庆大霉素C1a的合成 25克庆大霉素C1a(GMC1a)用500mL二甲亚砜(DMSO)搅拌下溶解，冷却至室温，加入100mL二氯甲烷、32克四水合乙酸钴，在室温下搅拌溶解并络合。分批加入40克2-甲酰巯基噻唑，搅拌下反应1小时。反应液中加入500mL 5℃冷水混合均匀，分液，上层液中加入5克活性炭搅拌20分钟过滤，滤液用1/10滤液体积的二氯甲烷萃取，萃取二次。
上层水相用800mL HD-2树脂(铵型)柱动态吸附，水洗除尽DMSO后，用0.4N氨水洗脱，至pH9.5时开始分部收集，合并相同组分，浓缩至干，用100mL甲醇溶解、蒸干脱水，重复一次，得到固体20.5克。
取上述固体5克用200mL HD-2树脂柱(高/直径＞10)纯化，用0-0.4N氨水梯度洗脱，分部收集洗脱液，合并相同组分，浓缩至干，用甲醇溶解、蒸干脱水，重复一次，得到固体产物3、2′、6′-三-N-甲酰基庆大霉素C1a 2.8克。[α]Dt＝154°；元素分析C44.32H7.41O12.35(水分5.6％，理论值C44.22H7.56O12.31)。
2)1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a的合成 上述第一次得到的固体15克加到300mL甲醇中溶解，室温下加入10.5克邻苯二甲酰胺基-α-羟基丙酸(PHPA)、5克1-羟基苯并三唑一水合物(HOBT)搅拌溶解，分批加入8.4克二环己基碳二亚胺(DCC)，反应1小时。
反应液过滤，滤液减压浓缩至干，加入300mL乙醇，80mL水合肼，肼解6小时。减压蒸发回收乙醇，加水溶解，用HD-2树脂柱吸附、纯化，0-0.4N氨水洗脱，分部收集，合并相同组分，浓缩至干得到固体7.2克。
取上述固体2克，用50mL水溶解，微孔滤膜(0.45微米)过滤，滤液冷冻干燥，得到1.7克固体为1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a碱。
另取上述固体5克用80mL水溶解，加6N H2SO4调pH4.5～7，加2克活性炭脱色，过滤，滤液冷冻干燥得到7.1克1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a硫酸盐。
实施例21-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a的合成 5克3″-N-脱甲基庆大霉素C1a加入20mL水、100mL DMSO，搅拌溶解，加10克乙酸锌搅拌溶解，室温下分批加入8.5克2-甲酰巯基噻唑搅拌反应。反应液加150mL冷水，混合均匀，过滤。滤液用弱酸性阳离子树脂D151动态吸附，水洗后用0.4N氨水洗脱，pH9.5时开始分部收集，合并相同组分，减压蒸发至干，得到固体3.5克。
上述固体用实施例1中步骤2)的方法进行1-N酰化反应并纯化得到1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a碱1.8克。
取其中1.5克上述固体用30mL水溶解，6N H2SO4调pH4.5～7.0，加活性炭脱色，过滤，滤液冷冻干燥得到2.1克1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a硫酸盐。
实施例31-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a的合成 1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰庆大霉素C1a硫酸盐8克加100mL水溶解，加10克乙酸钠，滴加10克碘(100mL二甲基甲酰胺溶解)，50～70℃搅拌反应12小时。反应液加水稀释至400mL，用100mL D151树脂动态吸附，水洗后用0.4N氨水洗脱，pH9.5时开始分部收集，合并相同组分，减压蒸发至干。加50mL水溶解，用HD-2(弱酸性阳离子树脂)树脂柱(高/直径＞10)纯化，0-0.4N氨水洗脱，分部收集。合并相同组分，浓缩至干，用30mL水溶解，加6N H2SO4调pH4.5～7，加1克活性炭脱色，过滤，滤液冷冻干燥得到3.1克1-N-(S)-3-氨基-2-羟基丙酰基-3″-N-脱甲基庆大霉素C1a硫酸盐。
实施例4.抗生素水针剂 配方 SK-70110克 无水亚硫酸钠0.4克 注射用水加至200毫升 pH 4.5～7.0 工艺按配方称取主辅料，溶于160mL注射用水中，调整pH后加活性炭适量，加水至定容200mL，去炭后微孔滤膜精滤至净，通氮气灌封，100℃流通蒸汽灭菌30分钟。
权利要求
1.一种具有如下1-N酰化衍生物结构的氨基糖苷类抗生素的制备方法
R＝CH3CO，(S)-CH2(NH2)CH(OH)CO，或
(S)-CH2(NH2)CH2CH(OH)CO，
R1＝H或CH3，R2＝H或CH3。
包括如下步骤
1)用二价金属离子使母核化合物1位氨基呈络合态后进行甲酰化反应，用作络合的二价金属离子是锌离子、钴离子或镍离子；
2)脱除金属离子；
3)在1-N位进行R基衍生化反应；
4)专一性去除甲酰化保护基；
5)对目标产物进行纯化，产物纯化采用阳离子交换树脂柱层析方法，用不同浓度的氨水溶液进行洗脱；或产物纯化采用吸附树脂柱层析方法，用不同浓度的乙醇、甲醇或丙酮水溶液进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的制备方法，当所述的R2＝CH3，在权利要求1所述步骤1之前，采用碘或碘化物对母核化合物实现3″-N脱甲基反应并经纯化后得到3″-N-脱甲基产物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是所述R2＝H，步骤1所述甲酰化反应后得到如下结构的3、2′、6′-三-N-甲酰基衍生物中间体
R1＝H或CH3。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是R1＝H，所述3、2′、6′-三-N-甲酰基衍生物为3、2′、6′-三-N-甲酰基庆大霉素C1a。
全文摘要
一种氨基糖苷类抗生素在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用，属于氨基糖苷类抗生素应用技术领域。本发明提供了具有2′-NH2-3′、4′-二去氧氨基糖苷类抗生素1-N-酰基衍生物在制备治疗耐药菌感染的药用组合物中的应用，以及该衍生物的制备和制剂的制备方法。
文档编号A61P31/00GK101723994SQ200910165440
公开日2010年6月9日 申请日期2007年10月9日 优先权日2007年10月9日
发明者刘军 申请人:常州方圆制药有限公司