专利名称：：具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷提取物的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有抗癌作用的剌人参叶总皂苷的制备方法，具体涉及一种制备含高纯度剌人参叶总皂苷提取物的制备方法及其在抗癌药物制备方面的应用。
背景技术：
：癌症是人类目前面临的重大疾病之一，已成为威胁人类生命的第二大疾病。根据世界卫生组织的数据显示，2004年癌症死亡人数达740万人(约占所有死亡人数的13%)，而超过70%的癌症死亡发生在低收入和中等收入国家。预计全世界癌症死亡人数将继续增加，2030年估计将有1200万人死于癌症。肝癌与肺癌、胃癌、结肠癌和乳癌一起成为每年导致癌症总死亡率的主要癌症，每年约有61万死亡人死于肝癌。而我国年均癌症发病人数约180万200万，死亡人数约140万150万；目前，我国每死亡5人，即有1人死于癌症；在0岁64岁国民中，每死亡4人，即有1人死于癌症；癌症位居国人各类死因首位，尤以西部和农村地区增长明显(人民网.我国的癌症流行现状2006-4-30)。因此抗癌药物的开发具有重要意义。剌人参为五加科剌参属植物，目前世界上仅有三种，分别为北美剌人参(0plopanaxhorridusMiq)、东北剌人参(0plopanaxelatusNakai)禾口日本剌人参(0plopanaxjaponicusNakai)，均为多年生落叶灌木。近年来研究表明，剌参属植物具有多方面的药理作用，是非常具有开发前景的药用植物。北美剌人参主要分布在阿拉斯加及不列颠哥伦比亚。北美剌人参的茎皮及根是当地的传统药用植物，用于治疗各种疾病，包括关节炎、感冒、发烧以及糖尿病等(TrevorC.Lantz，KristinaSwerhunandNancyJ.Turner.Devil'sClub(Oplopanaxhorridus):AnEthnobotanicReview.HerbalGram，AmericanBotanicalCouncil2004，62:33_48.)。东北剌人参主要分布于中国东北、俄罗斯、朝鲜三国境内。其根茎入药，具有滋补强壮、调节血压、兴奋中枢神经等功效，有类似人参的作用。近年来由于资源破坏，剌人参处于濒危状态，已列为国家二级保护植物。国内外学者对剌人参进行了研究。Moerman，Turner等报道北美剌人参具有抗糖尿病作用。药理实验表明北美剌人参提取夜，对分支杆菌有很强的抑制活性。Kobaisy等分离了五个聚炔类化合物，有显著的抗念珠菌，抗细菌，抗分支杆菌活性，在10微克能够杀死结核分支杆菌和耐异烟肼的鸟型分枝杆菌(KobaisyM，AbramowskiZ，LermerL，SaxenaG，HancockRE，TowersGH，DoxseeD，StokesRWAntimycobacterialpolyynesofDevil'sClub(0plopanaxhorridus)，aNorthAmericannativemedicinalplant.JNatProd.1997Nov;60(11):1210-13.)。TaichiInui通过逆流色谱技术从北美剌人参根茎皮提取液进行了粗分，分离了一些化合物，并通过生物活性筛选得出北美剌人参的提取液对结合杆菌有很强的药理作用，这些药理作用有可能是通过协同作用实现的(I皿iT，et.Counter-currentchromatographybasedanalysisofsynergyinananti—tuberculosisethnobotanical.JChromatogrA.2007Jim1;1151(1—2):211-5.)。TaiJ等报道北美剌人参干燥根皮的乙醇提取液对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用和具有抗氧化作用，如K562，HL60，MCF7和MDA-MB-468均有抑制作用(TaiJ，et.InvitroMiti-proliferativeandMitioxid肌tstudiesonDevil'sClubOplopanaxhorridus.JEthnopharmacol.2006Nov24;108(2):228-3)。前期我们对剌人参根及茎皮抗银痏病的活性成分进行研究(De-QiangDou，Xiao-YanHu，Yue-RanZhao，Ting-GuoKang，Feng_YunLiu，Hai—XueKuang，DavidC.Smith.Studiesontheanti—psoriasisconstituentsof0plopanaxelatusNakai.NaturalProductResearch2009,23(4):334-342.)。进一步我们对剌人参叶的化学成分和抗癌作用进行研究。目前国内外尚无关于剌人参叶总皂苷制备方法及其抗癌作用的相关报道。我们经过多次的实验考查，总结出一套适合工业生产的总皂苷的制备方法，并发现其具有抗癌作用，而实现了本发明。
发明内容本发明是关于具有抗癌作用的剌人参叶总皂苷制备方法的发明，本发明首次证明剌人参叶总皂苷提取物具有抗癌作用，并经过正交实验等考查，建立一套完备的制备具有抗癌作用剌人参叶总皂苷提取物的方法。本发明的目的在于寻找出一种制备剌人参叶总皂苷类提取物的方法。本发明的目的还在于证明剌人参叶总皂苷提取物具有抗癌作用，可作为抗癌药物的原料药。本发明的目的实现如下具有抗癌作用的剌人参叶总皂苷提取物的制备方法，其特征在于剌人参叶，粉碎成粗粉，用水或含水乙醇提取，提取液过滤，合并滤液，减压浓縮得浓縮液，经分离纯化，得剌人参叶总皂苷浸膏，总皂苷浸膏经干燥得剌人参叶总皂苷。本提取物可作为原料药应用于治疗癌症疾病的药物制剂中。本发明所用剌人参叶来源于东北剌人参(OplopanaxelatusNakai)、北美剌人参(0plopanaxhorridusMiq)禾口日本剌人参(Oplopanaxj即onicusNakai)的口十。所用剌人参叶含叶柄，阴干，粉碎，得剌人参叶粗粉(260目)。本发明所用的水或含水乙醇的提取方法如下乙醇浓度为0%100%(体积比，下同)，优选60%乙醇；提取方式可采用渗漉、超声、闪式提取和回流提取，优选回流提取法。回流提取的溶剂用量为药材量的320倍量；回流提取13次；每次13小时。提取液过滤，合并，减压浓縮至药材量的13倍。本发明的分离纯化方法采用溶剂萃取法和大孔树脂吸附法。溶剂萃取法是将上述所得的浓縮溶液置水中悬浮，用13倍体积水饱和的正丁醇萃取三次，水饱和正丁醇的用量优选与水的体积相当萃取。减压回收正丁醇得浸膏，获得剌人参叶总皂苷提取物浸膏。所用的大孔吸附树脂法是将上述浓縮液经大孔树脂色谱柱分离，依次用水和20%80%乙醇冲洗，优选70%乙醇。大孔树脂型号可以是AB-8、D-101、HPD-100、DA201和DM301。收集乙醇洗脱液，回收乙醇，即得剌人参叶总皂苷提取物浸膏。本专利中所得剌人参叶总皂苷提取物浸膏的干燥方法可以采用减压干燥法、冷冻法或喷雾干燥法，优选减压干燥法。经干燥后即得剌人参叶总皂苷提取物。本专利所得的剌人参总皂苷提取物中，总皂苷的重量百分含量(比色法)为30%4本专利所得的刺人参总皂苷提取物具有抗癌作用，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗癌药物的制剂中。本发明中的刺人参叶总皂苷提取物中包括含通式14在内的以羽扇豆烷和齐墩果烷为主的皂苷元和皂苷所组成的。其中不同种类的剌人参叶中成分的含量有差别。'COOR4其中=H，OH，Glc;R2或Glc与Rha组成的糖链。通式(1)、R3H，OH，Glc;R3CHV0H，CH肌CHO，C00H;R4=H，Glc'COO书-D-Glc6-p"D-Glc4"a"L-Rha其中R丄=H，0H，Glc;R2通式(2)H，0H，Glc;R3=CH3，0H，CH20H，CHO，C00Hc'COO-p"D-Glc6-&D-Glc4-a-L-Rha其中R=H，0H，Glc;R2通式(3)H，0H，Glc;R.,=CHV0H，CH0H，CHO，C00Hc5其中&=H，0H，Glc;R2=H，0H，Glc;R3=CH3，0H，CH20H，CH0，COOH。通式(4)总皂苷的含量测定参照文献方法(郭颖，王世成，窦德强.不同产地文冠果果壳中总皂苷含量测定.辽宁中医药大学学报2009,11(5):165-166.)。具体实施例方式实施例1:剌人参叶总皂苷提取物的制备方法1、溶剂萃取法制备剌人参叶总皂苷取剌人参叶粉末lkg，60%乙醇回流提取2次，每次2h，合并提取液，回收乙醇溶液，浓縮至小体积(约1500毫升)，经等量的水饱和正丁醇萃取三次，合并萃取液，减压浓縮正丁醇得浸膏，经减压干燥得剌人参总皂苷提取物103g，比色法测得总皂苷为70g(68.0%)，其收率为7.0%。2、溶剂萃取法制备剌人参叶总皂苷取剌人参叶粉末lkg，95X乙醇回流提取1次，lh，合并提取液，回收乙醇溶液，浓縮至小体积(约1500毫升)，经等量的水饱和正丁醇萃取三次，合并萃取液，减压浓縮正丁醇得浸膏，经减压干燥得剌人参总皂苷提取物70g，比色法测得总皂苷为52.5g(75%)，其收率为5.2%。3、大孔吸附树脂法制备剌人参叶总皂苷北美剌人参叶lkg，粉碎，过10目筛子，60%乙醇回流提取3次，每次3h，合并提取液，回收乙醇溶液，浓縮至小体积(无醇味，约2000ml)。溶液上已预先处理过的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、70%乙醇、95%乙醇洗脱，70%的乙醇洗脱液减压回收溶剂乙醇，经减压干燥得剌人参总皂苷提取物95g，测得总皂苷为74.2g(78.1%)，其收率约为7.4%。4、大孔吸附树脂法制备剌人参叶总皂苷北美剌人参叶lkg，粉碎，过10目筛子，纯水回流提取3次，每次lh，合并提取液，减压浓縮至小体积(约1500ml)。溶液上已预先处理过的DIOI大孔吸附树脂柱，依次用水、70%乙醇、95%乙醇洗脱，70%的乙醇洗脱液减压回收溶剂乙醇，经减压干燥得剌人参总皂苷提取物100g，测得总皂苷为70.2g(70.2%)，其收率约为7.0%。实施例2剌人参叶总皂苷的体外抗癌活性研究1、实验材料与试剂人结肠癌细胞株(HCT116)、人肺癌细胞株(NCI-H460)、人胃癌细胞细胞株(MGC803)、人胰腺癌细胞株(PANC-1)和人肝细胞癌细胞株(H印G2)均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所。RPMI-1640(美国Hyclone公司产品)，小牛血清(美国Gibco公司产品)，四甲基二氮唑蓝(美国Biosharp公司产品)，二甲基亚砜(美国Biomol公司产品)，O.25%胰蛋白酶(中国医学科学院生物医学工程研究所)实验采用上述实施例1中的方法制备的提取物。2、实验方法以上各细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液、37t:，5%0)2条件下培养，48小时换液，细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化传代。以5Xl(^个/ml细胞浓度的细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200iiL，37°C，5%C02培养24h后，加入不同浓度的治疗药物。按倍比稀释北美剌人参叶总皂苷为5，10，20，40，60mg/mL(用含0.5%DMSO、10%小牛血清的RPMI-1640培养液稀释)，每个剂量设4个复孔；另设对照组(用含0.5%DMS0、10X小牛血清的RPMI-1640培养液)。培养24h、48h、72h后，吸出培养液，每孔加入含MTT(终浓度5mg/mL)的无血清的RPMI-1640培养液200yL，继续培养4h后，吸弃上清溶液，加入100iiLDMSO，在微量震荡器上振荡5min，使其充分混匀，酶标仪(TecanInfiniteM200)测定其吸光度(A值)，吸收波长为570nm。分别计算细胞存活率和细胞增殖抑制率并绘制北美剌人参叶总皂苷提取物对肝癌细胞的生长抑制曲线。细胞存活率=(A;^纟a/A对照组)X100X;细胞增殖抑制率=(l-A给鄉/A对照组)X100%。3、实验结果本实验对首先对剌人参叶不同提取部位的活性进行比较，发现正丁醇萃取部分和大孔吸附树脂的75%乙醇洗脱部分的对各种癌细胞增殖具有显著的抑制作用。阳性对照采用5-氟嘧啶(5-FU)的IC5。值为5iig/ml。实验结果如下表1剌人参叶总皂苷对癌细胞增值的抑制作用cellHCT116NCI-H460PANC-1MGC803H印G-2IC50(吗/ml)83.279.853.162.550.2实施例3剌人参叶总皂体对人肝癌细胞H印G2裸鼠移植瘤的生长抑制实验1、材料实验动物为69周龄BALB/c裸小鼠，2230g，50只，雌雄各半，无特定病原体(SPF)条件下饲养。剌人参叶总皂苷按照上述实施例1方法制备。人肝癌细胞H印G-2购于中国科学院上海生命科学研究院细胞生物学研究所，5—氟脲嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU，合肥霍氏医药科技有限公司)。2、方法总皂苷溶液的制备按实施例1制备的剌人参叶总皂苷提取物，精密称定提取物，用0.5%CMC混悬配成所需的药液浓度，给药前摇匀即可。实验方法取人肝癌H印G2细胞，在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液、37。C、5%C02条件下培养，48小时换液，细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化。在无菌条件下接种于裸鼠腋窝皮接种H印G-2细胞悬液(1.0X10cfu/mL)0.2mL，(相当于每只裸鼠接种2X106个肿瘤细胞).接种1周后可见肿瘤生长，当肿瘤大小到直径约为34mm时(接种10d以后)，将荷瘤裸鼠按肿瘤大小随机分为5组，每组910只裸鼠，雌雄兼有，(1)空白组给生理盐水，ig，每日给药；(2)阳性对照组5-FU，用生理盐水稀释，无菌分装，20mg/kg，ip，隔日给药；(3)给药组分剌人参叶总皂苷高、中、低剂量组，5%CMC配制，50200mg/kg，ig，每日给药，共给药21d.自接种后每日测量裸鼠体质量.每周用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长(a)短(b)径，并按以下公式计算相积。末次给药后24h时处死动物，剥离肿瘤称质量.计算各组抑瘤率，抑瘤率=(l-用药组平均瘤质量/空白组平均瘤质量)X100X，实验重复两次.结果见表2。表2剌人参叶总皂体对H印G2裸鼠移植瘤的生长抑制实验(文士S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>与空白对照相比:*P<0.05*"<0.013、实验结果结果如表2所示，剌人参叶总皂苷对裸小鼠移植瘤的生长具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖性。观察其活动进食状况均无明显异常，对体重增加也无影响，表明剌人参叶总皂苷对裸鼠的生长无明显的毒副作用。剌人参叶总皂苷50200mg/Kg连续应用21天，对肝肿瘤有显著的剂量依赖性抑制作用，其低剂量组抑瘤率为19.9%，与对照组比较有显著差异(P<0.05)，中及高剂量组抑瘤率分别为38.3%，61.0%，瘤重与对照组相比差异有极显著意义(P<0.01)。权利要求具有抗癌作用的刺人参叶总皂苷的制备方法，其特征在于刺人参叶，粉碎成粗粉，用水或含水乙醇提取，提取液过滤，合并滤液，减压浓缩得浓缩液，经分离纯化，得刺人参叶总皂苷浸膏，总皂苷浸膏经干燥得刺人参叶总皂苷。2.根据权利要求1所述的剌人参叶总皂苷的制备方法，其特征是所用剌人参叶来源于东北剌人参、北美剌人参和日本剌人参的叶。3.根据权利要求1所述的剌人参叶总皂苷的制备方法，其特征是所用剌人参叶含叶柄，阴干，粉碎，得剌人参叶粗粉，粒度为1060目。4.根据权利要求1所述的剌人参叶总皂苷的制备方法，其特征是水或含水乙醇的提取方法如下乙醇浓度为0%100%;提取方式可采用渗漉、超声、闪式提取和回流提取，优选回流提取法，回流提取的溶剂用量为药材量的320倍量；回流提取13次；每次13小时，提取液过滤，合并，减压浓縮至药材量的13倍，经分离纯化即得。5.根据权利要求4所述的剌人参叶总皂苷的制备方法，其特征是分离纯化方法采用溶剂萃取法和大孔树脂吸附法。6.根据权利要求5所述的溶剂萃取法，其特征是将权利要求4中所得的浓縮溶液置水中悬浮，用13倍体积水饱和的正丁醇萃取三次，水饱和正丁醇的用量优选与水的体积相当萃取，减压回收正丁醇得浸膏，获得剌人参叶总皂苷提取物浸膏。7.根据权利要求5所述的大孔吸附树脂法，其特征是将权利要求4中所得浓縮经大孔树脂色谱柱分离，依次用水和20%80%乙醇冲洗，优选70%乙醇，大孔树脂型号可以是AB-8、D-101、HPD-100、DA201和DM301，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，即得剌人参叶总皂苷提取物浸膏。8.根据权利要求1所述的剌人参叶中总皂苷提取物的制备方法，其特征是权利要求6、7中所得剌人参叶总皂苷提取物浸膏的干燥方法可以采用减压干燥法、冷冻法或喷雾干燥法，优选减压干燥法，经干燥后即得剌人参叶总皂苷提取物。9.根据权利要求1所述剌人参叶总皂苷提取物的制备方法，其特征在于所述的提取物中，总皂苷的重量百分含量，比色法为20%以上，收率为1%30%。10.根据权利要求1所述剌人参叶总皂苷在抗癌方面的应用，其特征是剌人参叶总皂苷具有抑制癌细胞增殖的作用，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗癌药物的制剂中。全文摘要本发明提供一种刺人参叶总皂苷提取物的制备方法及其在抗癌药物方面的应用。该方法包括如下步骤1)将刺人参叶粉碎成粗粉；2)将刺人参叶粉末用水或含水乙醇进行提取，过滤后合并滤液，浓缩，得到浓缩液；3)将浓缩液进行减压浓缩，干燥后，得到所述刺人参叶总皂苷提取物。该方法制备所得刺人参叶总皂苷提取物中，总皂苷的重量含量为20％以上，收率为1％～30％。经药理试验证明该提取物具有较好的抗癌作用。刺人参叶总皂苷提取物可单独或与其它药物组合作为原料药应用于具有抗癌作用的药物制剂中。该方法制备产物纯度高，方法简便实用，适合工业化生产。文档编号A61K36/185GK101732377SQ20091022057公开日2010年6月16日申请日期2009年12月8日优先权日2009年12月8日发明者刘培培,康廷国,窦德强申请人:辽宁中医药大学