专利名称：通过静脉给药的用于控制释放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，包括海藻酸或其药学可接受的盐类的微粒，通过该微粒达到控制释放，并且增加经静脉给药的活性成分的半衰期，以及使应用次数减少，并在血液中达到更稳定的活性成分水平，由此潜在地减少一般由于定期输注活性成分而出现的其浓度的峰谷。
本发明说明了具有下列组合的海藻酸盐的疏水微粒其尺寸适于静脉输注且其物理化学特性适于避免该微粒被迅速吞噬，从而能够控制释放复杂的活性成分。
发明内容
由于其物理化学和生物化学特性，海藻酸及其盐类(海藻酸铵、海藻酸钙、海藻酸钾、海藻酸钠和海藻酸丙二醇酯)是在活性成分的包封中最常用和研究最多的聚合物之一。它们是天然来源、从海藻或细菌商业化产生的多糖。
海藻酸盐是海藻酸的盐类，是由两种单体单元，β-(1-4)-D-甘露糖醛酸(M)和α-(1-4)-L-谷洛糖醛酸(G)组成的线性多糖。它们分为形成多种序列的嵌段，最常见的为G、M和MG。
在多价阳离子如钙(Ca++)的存在下，在形成海藻酸盐的延伸网络的连续G嵌段之间形成强键。钙离子作为桥位于具有带负电荷的谷洛糖醛酸的基团之间。
在一些制剂中，它们经常伴随着其他多糖诸如壳聚糖。壳聚糖是一种由随机分布的β-(1-4)D-氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(乙酰单位)组成的线性多糖。
在一些海藻酸盐制剂中可使用白蛋白作为带电荷物质，优选无菌和无热原的人白蛋白，其还可用作制造过程中活性成分的保护剂或用作产品的长期保存期间的稳定剂。
其在血浆中的释放要被改变的活性成分可以是复杂的和不稳定的活性成分。更具体地，活性成分的特征是显示生物活性。此生物活性可通过酶活性、转运、与配体的分子相互作用或结合来表现。在两种情况下活性成分的问题是对制造的能量条件不稳定或敏感，其中尤其是温度、压力和/或非极性环境，因为小的结构变化可导致生物活性的不可逆丧失。
作为具有生物活性的活性成分，可列举人肽类激素诸如褪黑激素、5-羟色胺、甲状腺素、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原和血管紧张素、加压素、心房肽、降钙素、促红细胞生成素、卵泡刺激素胰高血糖素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素类生长因子(或生长介素)、黄体生成素、黑色素细胞刺激素、催产素、催乳素、血小板生成素、神经肽Y、组胺、以及其衍生物。
其他实例可以是生物活性蛋白，尤其是诸如白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α-酸性糖蛋白、α-2-巨球蛋白、抗凝血酶、结合珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、纤溶酶原、纤维蛋白原、补体蛋白、凝血因子和免疫球蛋白。
这些活性成分是生物活性的事实使得由于微小结构损害造成它们特别容易可能丧失功能性。此种结构损害可与温度、压力、介质的极性、渗透压、氧的存在、搅拌等有关。
就此而言，在这些活性成分中凝血因子VIII非常突出，因为它极度不稳定。由于其结构复杂性，其非常难以充分地稳定FVIII的生物活性，尤其是其纯化形式。例如，Parti R等人(Haemophilia 2000；6513-522)说明了在大于40℃的温度下，甚至冻干形式的FVIII的生物活性都开始受到损害。当FVIII在溶液中时，这种不稳定性最为突出，甚至在25℃下就观察到不稳定性的迹象。对于IX因子和VIIa因子，对于外界因素诸如温度的敏感性也是公知的。
就此而言，必需注意，采用的制造工艺要获得具有FVIII的生物活性的治疗制剂。这意味着该方法可应用于显示难以稳定的生物活性的活性成分，并且因此，本发明可应用于与FVIII一样不稳定的成分。通过扩展，本发明可应用于比FVIII更稳定的成分。因此，凝血因子是可从如本发明中所述的制剂的应用中获益的活性成分的明显实施例。
在本发明中，包括在聚合物微球中的活性成分因此可以是显示生物活性的肽、蛋白或激素。优选地，活性成分是凝血因子，且更优选地，活性成分是VIII因子、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、由VIII因子和血管性血友病因子形成的复合体、IX因子或VIIa因子。
这些成分可以是人、动物、重组或转基因来源的。在后一种情况下，合成分子可以是天然分子的复制或可被有意地修饰。
获得组合物 微囊化是一种用不同特性的材料包被分子、固体颗粒或液体球以产生微米尺寸的微粒的方法。由此技术方法获得的产品被称为微粒、微胶囊或微球。
有几种微囊化技术 -通过化学方法的微囊化 ·界面聚合法 -通过物理化学法的微囊化 ·蒸发溶剂 ·凝聚法 ·凝胶化 ·螯合 ·形成囊泡 -通过机械方法的微囊化 ·挤出 ·共挤出 ·喷雾干燥 ·喷雾冷冻 选择用于制造本发明中描述的微粒的技术是喷雾干燥，该方法记载在Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteins withinalginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′s University，Kingston，Canada]。此制造技术的特征是单阶段，且微粒作为终产物获得。
包括本发明的用于控制释放活性成分的海藻酸或其盐类的微粒的用于静脉给药的生物相容组合物的制造工艺的特征在于以下的阶段 -喷雾，其中含有活性成分和聚合物的溶液/混悬液/乳液通过喷嘴被泵出，并且以液滴的形式分散， -在干燥室中干燥，在此处热空气促进溶剂从液滴蒸发，以及 -收集被包封的产物。
此方法在140～180℃的温度下进行，供应流速为35～40m3/h，注射流速为3.5～5ml/min且压力为4～6psi。
在这些条件下能够获得尺寸小于或等于5μm，优选1-4.5μm并保持活性成分的活性的颗粒。另外，可在喷雾阶段前任选的乳液匀化工艺中改进颗粒的平均尺寸。此附加的匀化工艺借助于压力，例如1500～2000psi来进行。
通过喷雾干燥包封活性成分是一个连续工艺，其中溶液或乳液被脱水，在工艺结束时回收由微粒形成的固体。
为此，含有活性成分的液体以预定的注射流速被机械驱动至喷嘴或旋转盘，从中其以数百万个非常小的液滴进行喷雾。液滴的大小在很大程度上由使液体形成喷雾的气体的压力来决定。此工艺在密闭室中进行，在该密闭室中控制的气，通常为空气的气流以预定的吸入速率并在可控温度下连续循环。
作为喷雾的结果，液体极大地增加了其与空气的接触表面积，使得当面对干燥空气流时，液体溶剂，通常为水迅速蒸发。由于改变状态需要热量，因此此迅速蒸发使每个小液滴内部冷却。以此方式能够进行快速干燥，同时尽量减小对活性成分的热休克。完成该工艺后，产物以固体形式被收集。
组合物的说明 获得的微粒通过测定其颗粒平均粒径、其Z电位和生物活性来区分。颗粒的尺寸使用Beckman Coulter LS13320装置通过激光衍射来测定。
由于有静脉给药的问题，需要颗粒尺寸小于或等于5μm，优选1～4.5μm，因为较大的颗粒尺寸会导致血栓形成。
Z电位使用Malvern Zetasizer装置测定，Z电位是控制混悬液中颗粒的相互作用的重要参数之一。其通过颗粒表面和分散介质的特性来确定。在此情况下，最佳值为-30mV以上，因为此值确保颗粒之间的斥力并确保没有凝聚物。已经显示具有接近0，优选-30mV～0的Z电位的微粒具有很低的肝脏摄取和细胞清除水平。(Szycher，Michael，High PerformanceBiomaterialsA Comprehensive Guide to Medical and PharmaceuticalApplications，CRC Press出版，1991ISB 0877627754，9780877627753，812页)。
组合物的应用 修饰释放或控制释放的药物形式以下列方式设计相对于以相同方式给药的常规释放的药物形式，改变活性物质释放的速率和/或位置。
在本发明中，已经观察到显示生物活性的活性成分诸如蛋白(更具体地，凝血因子)的包封如何在体内和体外释放模型中实现控制释放。由于VIII因子的结构复杂性，其对于外界因素极度敏感而著名。实际上，甚至将FVIII冷冻在其天然基质-人血浆中，仍会导致生物活性的部分损失(Bravo，M.I.等人，Pharmeuropa Scientific Notes，2006-1，1-5页)。
因此当本发明中所述的含有人FVIII的微粒置于环境非常类似于人血浆的连续流动室中时，与未包封产品相比，已经观察到介质中FVIII的释放有延迟。
类似地，在兔中静脉给予本发明的含FVIII微粒，与常规产品相比，使FVIII在血浆中的半衰期始终显著地延长。此外，在可能指示有与所述制剂相关的毒性作用的动物中没有观察到不良反应。
体内药代动力学数据非常明显，因为毫无疑问地证实MPS的调理作用和加速摄取已经被本发明的制剂适当地解决了。
本发明可用于治疗需要静脉给予复杂成分的各种病理状况，这些病理状况可包括，例如，出血障碍和凝血障碍、激素紊乱等。在这些情况下，将实现半衰期的显著延长，例如对于FVIII，可包括减少用于维持一线预防治疗方案的给药次数，例如，每周一次给药。
可能存在的与使用亲水聚合物有关的缺点可以是，在产品悬浮在给药水性载体，例如，无热原和无菌注射用水中的时间和静脉输注时刻之间的时段期间微粒的部分溶出。此类缺点可使用，例如，部分无极性的生物聚合物溶液，诸如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、异丙叉甘油、甘油缩甲醛或丙酮(Mottu F等人，Journal of Pharmaceutical Science&Technology 2000Vol.54，No.6，456-469)作为本发明中所述的微粒的重悬浮和给药载体来克服。
例如，本发明可以包装在真空或惰性气氛中的脱水或冻干产品的形式来产生，使得能够在不同的温度条件下，例如，在2℃～40℃之间，具有长期稳定性。由此保存的产品可在用溶剂配制后经静脉给药，溶剂可以是注射用水，或盐水溶液，或具有下列可变含量的混合物或盐水溶液，例如0.5％～50％的生物相容溶剂诸如，例如，尤其是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、四氢呋喃聚乙二醇醚、异丙叉甘油、甘油缩甲醛或丙酮。
本发明的有益效果 本发明说明了具有下列组合的海藻酸盐的亲水微粒的产生该微粒具有适于静脉输注的尺寸以及适于防止其迅速吞噬的物理化学特性，使得复杂活性成分的半衰期延长。
海藻酸盐是生物相容的，并经尿清除，并且与任意已知的毒性作用无关。由于具有此特性，本发明与蛋白和复杂活性成分的给药是可配伍的。
本发明可克服造成可控静脉给药系统不实用的所有缺陷，由此减少了治疗所需的给药次数，而静脉使用的活性成分没有变化。就此而言，需注意，本发明不需要在氨基酸序列、糖基化作用或导入合成衍生物这些方面对活性成分作任何的修饰。
图1显示了BATCH 9和BATCH 1的体外释放试验的结果的比较图。
图2显示了在给予未包封的FVIII后和在应用本发明的组合物后在兔血浆中人FVIII:C的药代动力学。
图3显示了在给予未包封的FVIII后和在应用本发明的组合物后在兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学。
具体实施例方式 实施例1 微粒的制备 如Erdinc B.I.[Erdinc B.I.(2007)Micro/nanoencapsulation of proteinswithin alginate/chitosan matrix by spray drying，Degree Thesis，Queen′sUniversity，Kingston，Canada]中的记载使用喷雾干燥工艺生产海藻酸盐微粒。基本上，通过产生具有所选择的聚合物和活性成分的乳液来制备微粒。
使用Büchi小型喷雾干燥仪B-290装置在下列条件下对样品进行喷雾喷雾温度140℃-180℃，吸入速率35-40m3/h，注射流速3.5-5ml/min，且压力为4-6psi。
实施例2 微粒的说明 表1、2和3说明了在制造微粒中使用的原料和其特性，包括尺寸、Z电位和收率。使用的制造工艺和条件如实施例1中所述。
表1FVIII微粒(血浆FVIII)的说明 FVIII活性/FVIII抗原比给出了指定样品中活性蛋白的比例的概念。以此方式，如果我们将初始样品中的活性/抗原比与包封样品的活性/抗原比进行比较，则我们可计算微囊化后仍然具有功能的活性成分的比例。在实施例中，我们发现在包封工艺期间的活性收率，以与初始活性收率相比的百分比表示，对于第1批次、第2批次和第3批次分别为57.6％、33.9％和35.7％。
表2FIX微粒(血浆FIX)的说明 在此例子中，我们发现在所有所述批次中，在第4批次、第5批次和第6批次中包封工艺期间的活性收率为100％。
表3rFVIII微粒(重组rFVIII)和rFVIIa(重组rFVIIa)的说明 在重组来源的蛋白的情况下，对于第7批次和第8批次，包封工艺期间测定的活性收率分别为25％和71％。
在所有批次中，使用Beckman Coulter LS 13320装置通过衍射激光测定颗粒尺寸，并且使用Malvern Zetasizer装置测定Z电位。
FVIII的生物活性通过缺陷性血浆凝血试验或通过生色作用评价FXa的生成来测定。对于FVIIa和FIX，分别通过评价无FVII和FIX的血浆的凝血时间(部分活化凝血活酶时间)来测定生物活性。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的免疫检测方法分别使用针对FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特异性抗体测定蛋白浓度。
指示指定样品中活性蛋白的比例的活性/抗原比通过获得样品中具体活性成分的活性和抗原单位之间的商来计算。通过估计起始样品和最终的包封产品的活性/抗原比之间的变化百分比来计算活性/抗原收率。
如在所有例子中所见，平均粒径小于或等于5μm，且Z电位为负。活性/抗原收率的结果还表明工艺期间生物活性得到保持。
各表显示控制释放系统适用于不同的活性成分。
实施例3 体外释放试验 在Sotax CE1装置中在闭合回路中采用连续流动室进行控制释放试验以评价活性成分的释放。
在37℃的温度下使用含有1％人白蛋白的咪唑缓冲液(pH 7.3)作为溶解介质进行试验，流速为7-25ml/min。在不同的时刻(5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟和240分钟)提取代表性样品用于分析。用相同体积的新鲜介质替换提取的样品的体积以便纠正体积的损失。
FVIII的生物活性通过缺陷性血浆凝血试验或通过生色作用评价FXa的生成来测定。对于FVIIa和FIX，分别通过评价无FVII和FIX的血浆的凝血时间(部分活化凝血活酶时间)来测定生物活性。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的免疫检测方法分别使用针对FVIII:Ag、FIX:Ag或FVII:Ag的特异性抗体测定蛋白浓度。
测试完成后获得下列的结果 表4.未包封的冻干FVIII(第9批次)的体外释放试验
表5.FVIII纳米颗粒(第1批次)的体外释放试验
我们可看到与未包封产品相比，应用于活性成分的微粒的组合物改变了产品的释放动力学。
实施例4 VIII因子在动物中的药代动力学 为了评价在体内组合物对活性成分的释放的作用，对兔进行药代动力学试验。为此，50IU/kg剂量的来自第9批次的人FVIII(未包封)经静脉给予三只雌性新西兰白兔。类似地，50IU/kg剂量的来自如实施例1所述和根据实施例2所述制造的第1批次的包封FVIII经静脉给予另外三只雌性新西兰白兔。在不同的时间，获取血浆样品进行分析以检测人FVIII:C的存在，如表6中所述。在选择性免疫俘获人FVIII分子后通过生色作用检测人FVIII。这样可使融合的人FVIII的活性与兔FVIII的活性区分开。
表6.在给予未包封FVIII后和应用本发明的组合物后兔血浆中人FVIII:C的药代动力学
从结果我们可以看出组合物延迟了活性成分在血浆中的释放。另外，这些结果证明不管其大小如何，都不存在将微粒从循环中迅速清除的细胞机制(肝脏、脾脏或巨噬细胞)。
使用用于此目的的适当软件(WinNonlin 5.2)分析此数据，使我们能够计算表7中详述的药代动力学常数。
表7.在给予未包封FVIII后和应用本发明的组合物后兔血浆中人FVIII:C的药代动力学参数
实施例5 动物中血管性血友病因子的药代动力学 在第9批次制剂(未包封FVIII)和第1批次制剂(包封FVIII)两种情况下，FVIII的血浆来源具有显著含量的血管性血友病因子(VWF)。这意味着VWF的包封与FVIII的包封同时发生。对此，可独立地研究它们的行为。为此，我们继续通过评价兔血浆中人VWF抗原(VWF:Ag)的存在来单独地分析VWF药代动力学。结果显示在表8中。
表8.在给予未包封VWF后和应用本发明的组合物后兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学
从结果我们可以看出组合物延迟了活性成分在血浆中的释放。另外，这些结果证明不管其大小如何，都不存在将微粒从循环中迅速清除的细胞机制(肝脏、脾脏或巨噬细胞)。
使用用于此目的的适当软件(WinNonlin 5.2)分析此数据，使我们能够计算表9中详述的药代动力学常数。
表9.在给予未包封FVIII/VWF后和应用本发明的组合物后兔血浆中人VWF:Ag的药代动力学参数
可观察到，活性成分(在此例子中为VWF)的包封明显地延长了其半衰期。
尽管本发明已经对于优选实施方式的实施例进行了说明，但这些实施例不应被认为是对本发明的限制，本发明由下列权利要求的较宽释义来限定。
权利要求
1.一种用于静脉给药的生物相容组合物，包括用于控制释放活性成分的海藻酸或其盐的微粒，其特征在于这些微粒的尺寸小于或等于5μm，并且具有负Z电位。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述微粒的尺寸为1-4.5μm。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述Z电位为-70～0，不包括0。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述活性成分为肽、蛋白质或激素。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分为人、动物、重组或转基因来源。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分显示不稳定的生物活性。
7.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是凝血因子。
8.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是VIII因子。
9.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是VWF。
10.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是由FVIII和VWF形成的复合体。
11.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是IX因子。
12.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述活性成分是VIIa因子。
13.一种制造根据权利要求1-12任一项所述的用于静脉给药的生物相容组合物的方法，所述生物相容组合物包括用于控制释放活性成分的海藻酸或其盐的微粒，其特征在于所述方法包括以下的步骤
-喷雾，其中含有活性成分和聚合物的溶液/混悬液/乳液通过喷嘴被泵出，并且以液滴的形式分散，
-在干燥室中干燥，在此处热空气促进溶剂从液滴蒸发，以及
-收集被包封的产物；
此方法在140～180℃的温度下进行，供应流速为35～40m3/h，注射流速为3.5～5ml/min且压力为4～6psi。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于在喷雾阶段之前另外进行将所述乳液匀化的任选步骤。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述附加的匀化步骤通过施加1500-2000psi的压力进行。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于获得的所述微粒的尺寸为1-4.5μm。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于获得的所述微粒的Z电位为-70～0，不包括0。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述活性成分为肽、蛋白质或激素。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分可以为人、动物、重组或转基因来源。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分显示不稳定的生物活性。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是凝血因子。
22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是VIII因子。
23.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是VWF。
24.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是由FVIII和VWF形成的复合体。
25.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是IX因子。
26.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述活性成分是VIIa因子。
27.根据权利要求1-12任一项所述的生物相容组合物在治疗出血障碍、凝血变化和激素疾病中的应用。
全文摘要
通过静脉给药的用于控制释放活性成分的海藻酸的生物相容微粒的组合物。本发明涉及一种生物相容组合物，其包括海藻酸或其盐的微粒和活性成分。更具体地，本发明涉及用于包封要静脉给予需要其的患者的活性成分的微粒。当静脉给药时，这些微粒是具有如下的组合其足以增加血液中活性成分的半衰期或存留时间尺寸，在肝脏中的摄取少，并且细胞清除快速。
文档编号A61K38/00GK101757631SQ200910249539
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者萨尔瓦多·格兰切·加蒙, 安娜·娜蒂·瑞卡特, 约瑟·玛利亚·苏内·尼格, 约瑟·拉蒙·蒂科·格劳, 蒙特塞拉特·米尼亚罗·卡莫纳 申请人:基立福有限公司